SU438684A1

SU438684A1 - The method of obtaining-asparaginase

Info

Publication number: SU438684A1
Application number: SU1904191A
Authority: SU
Inventors: Рута Карловна Озолинь; Паула Пауловна Гривинь; Юлий Оскарович Якобсон; Людмила Федоровна Горькавая; Ростислав Ильич Гвоздяк; Михаил Михайлович Левитов; Александр Николаевич Мешков; Леонид Давидович Штоффер; Прасковья Михайловна Бычкова; Виктор Николаевич Игнатов; Ольга Ивановна Прокофьева
Original assignee: Институт Микробиологии Им. А.Кирхенштейна; Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков
Priority date: 1973-04-02
Filing date: 1973-04-02
Publication date: 1974-08-05

Description

1one

Изобретение относитс к области медицины и касаетс ферментных препаратов.This invention relates to the field of medicine and enzyme preparations.

Известен способ получени L-аснарагиназы путем культивировани Erwinia cairotovora на средах с высоким содержанием определенной фракции дрожжевого экстракта (5% Glatex) в качестве источника аминного азота и глутаматом натри в качестве источника углерода. Средн удельна активность клеток 4-6 МЕ/мг сухих клеток.A known method for producing L-asnaraginase is by cultivating Erwinia cairotovora on media with a high content of a certain fraction of yeast extract (5% Glatex) as the source of amino nitrogen and sodium glutamate as the carbon source. The average specific activity of cells is 4-6 IU / mg dry cells.

Целью изобретени вл етс интенсификаци процесса биосинтеза фермента.The aim of the invention is to intensify the process of enzyme biosynthesis.

Дл достижени поставленной цели культивирование осуществл ют на среде, содержащей до 0,5% аминного азота; 0,1 -1,0% неорганической соли аммони ; 0,5-2% органической кислоты, например лимопной, или многоатомного спирта, например глицерина; до 1,5% фосфатов; до 0,05% сернокислого магни , при рН 6,5-7,5 и температуре 28- 42°С.To achieve this goal, the cultivation is carried out on a medium containing up to 0.5% amino nitrogen; 0.1-1.0% inorganic ammonium salt; 0.5-2% organic acid, for example, lymphoic acid, or a polyhydric alcohol, for example glycerol; up to 1.5% of phosphates; up to 0.05% magnesium sulfate, at pH 6.5-7.5 and a temperature of 28-42 ° C.

Способ получени L-аспарагиназы заключаетс в следующем. Культуру Erwinia сагоtovora 268 поддерживают на скошенном МПА (или рыбном агаре, картофельном агаре), пересевают один раз в мес ц, сохран ют при температуре ±4 ±1°С. Дл получени инокул та используют свежепересе нную 18-часовую культуру, выращенную при 28-37°С.The method for producing L-asparaginase is as follows. The culture of Erwinia sagotovora 268 was kept on MPA (or fish agar, potato agar), seeded once a month, and kept at a temperature of ± 4 ± 1 ° C. To prepare the inoculum, a freshly grown 18-hour culture grown at 28-37 ° C is used.

Размнолсают культуру в колбах емкостью 750 мл со 150 мл среды состава, аналогичного ферментационной среде при 28-37°С в течение 18-24 час.Culture culture in flasks with a capacity of 750 ml from 150 ml of medium of composition similar to the fermentation medium at 28-37 ° C for 18-24 hours.

Дл засева ферментационной среды используют 0,005-0,01% посевного материала (ио сухому весу). Ферментацию осуществл ют в ферментерах объемом 100 л с рабочим объемом ферментационной жидкостиFor the sowing of the fermentation medium, 0.005-0.01% of the inoculum (dry weight) is used. The fermentation is carried out in 100 l fermenters with a working volume of fermentation liquid.

75 л. Среду стерилизуют 40-60 мин при I атм. Пеногаситель ввод т или одновременно со средой или по ходу ферментации. Ферментацию ведут при 28-42°С, аэрации 20- 75 л/мин, работе мешалки 250-400 об/мин.75 liters The medium is sterilized for 40-60 minutes at I atm. The defoamer is introduced either simultaneously with the medium or during fermentation. Fermentation is carried out at 28-42 ° C, aeration of 20- 75 l / min, the operation of the stirrer 250-400 rpm.

Продолжительность выращивани 8-18 час.Duration of cultivation is 8-18 hours.

В ходе ферментации контролируют рН,During the fermentation, the pH is controlled,

прирост биомассы, удельную активность Lаспарагиназы .biomass growth, specific Lasparaginase activity.

По окончании ферментации биомассу сепарируют и используют Д.ЯЯ выделени фермента . Выделение L-аспарагиназы из клеток может осуществл тьс одним из известных способов .At the end of the fermentation, biomass is separated and D.IaI enzyme isolation is used. Isolation of L-asparaginase from cells can be carried out by one of the known methods.

Пример 1. Посевной материал в количестве 0,01% используют дл засева колб, емкостью 750 мл в 150 мл среды следующего состава (в %): К2НРО4 0,7; КН2РО4 0,3; MgSO4 0,02; NH4PO4 0,5; блочна кислота 1.0.Example 1. A seed in the amount of 0.01% is used for seeding flasks with a capacity of 750 ml in 150 ml of medium of the following composition (in%): K2HPO4 0.7; KH2PO4 0.3; MgSO4 0.02; NH4PO4 0.5; block acid 1.0.

рН среды после стерилизации 6,,0. Услови выращивани : температура 30°С, скорость качалки 220 об/мин, продолжительность выращивани 18 час. В конце ферментации удельна активность клеток составл ет 8 МЕ/мг сухих клеток, съем 12,5 МЕ/мл культуральной жидкости. Аналогичный выход Lаспарагиназы дает замена блочной кислоты на нтарную, аспарагиновую кислоту или глицерин .pH after sterilization 6,, 0. Growing conditions: temperature 30 ° C, rocking speed 220 rpm, growing time 18 hours. At the end of the fermentation, the specific activity of the cells is 8 IU / mg dry cells, 12.5 IU / ml of culture liquid will be removed. A similar output of Lasparaginase gives the replacement of malic acid for succinic, aspartic acid or glycerin.

Пример 2. Биосинтез по примеру 1 провод т на среде (в %): К2НРО4 0,7; КН2РО4 0,3; MgSO4 0,02; NH4PO4 0,3; блочна кислота 1,0; дрожжевой экстракт 0,3 (по амипному азоту).Example 2. The biosynthesis of example 1 is carried out on medium (%): K2HPO4 0.7; KH2PO4 0.3; MgSO4 0.02; NH4PO4 0.3; block acid 1.0; yeast extract 0.3 (amine nitrogen).

При изготовлении сред с дрожжевым экстрактом экстракт предварительно раствор ют при нагревании, осадок отдел ют центрифугированием и добавл ют требуемые компоненты , рН среды после стерилизации 6,8- 7,0. Продолжительность ферментации 8- 12 час, температура 39-42°С, аэраци 280- 300 об/мин.When making media with yeast extract, the extract is pre-dissolved by heating, the precipitate is separated by centrifugation and the required components are added, the pH of the medium after sterilization is 6.8-7.0. The duration of fermentation is 8-12 hours, the temperature is 39-42 ° С, aeration is 280-300 rpm.

Получают клетки с удельной активностью 8 МЕ/мг сухих клеток, съем 50 МЕ/мл.Obtain cells with a specific activity of 8 IU / mg dry cells, eat 50 IU / ml.

Пример 3. Посевной материал в количестве 0,01;%; используют дл засева ферментера емкостью 100 л в 75 л среды состава, указанного в примере 2. Пеногаситель - силикон ЭПО-40 в количестве 0,01%- Услови ферментации: температура 37°С, аэраци 75 л/мин, мешалка 250 об/мин, продолжительность ферментации 8 час (до достижени стационарной фазы). Получают клетки с удельной активностью 7 МЕ/мг сухих клеток, съем 33 МЕ/мл.Example 3. Seed material in the amount of 0.01;%; used for planting a fermenter with a capacity of 100 liters in 75 liters of the medium of the composition specified in example 2. Defoamer - EPO-40 silicone in an amount of 0.01% - Fermentation conditions: temperature 37 ° C, aeration 75 l / min, agitator 250 rpm , the duration of fermentation is 8 hours (until reaching the stationary phase). Obtain cells with a specific activity of 7 IU / mg dry cells, eat 33 IU / ml.

Пример 4. Посевной материал в количестве 0,005% используют дл засева ферментера емкостью 100 л в 75 л среды состава (в %): сульфат аммони 0,1; кукурузный экстракт 0,1 (по аминному азоту); ферментный гидролизат казеина 0,1 (по аминпому 5 азоту); молочна кислота 0,5; рН перед посевом 7,0.Example 4. A seed in the amount of 0.005% is used for seeding a fermenter with a capacity of 100 liters in 75 liters of the composition medium (in%): ammonium sulfate 0.1; corn extract 0.1 (amine nitrogen); enzymatic casein hydrolyzate 0.1 (amine 5 nitrogen); lactic acid 0.5; pH before sowing 7.0.

При приготовлении сред с кукурузным экстрактом используют экстракт с содержанием не более 4%. углеводов (на сухой вес), рНWhen preparing media with corn extract, use an extract with a content of not more than 4%. carbohydrate (dry weight) pH

0 среды довод т до 7,5 40%-ным NaOH, осадок отдел ют, добавл ют остальные компоненты среды. Молочную кислоту добавл ют с учетом ее количества, вносимой в среду с кукурузным экстрактом.0 medium is adjusted to 7.5 with 40% NaOH, the precipitate is separated, the remaining medium components are added. Lactic acid is added taking into account its quantity introduced into the medium with corn extract.

5 Услови ферментации: температура 28- 30°С, аэраци 20 л/мин, мешалка 400 об/мин, продолжительность выращивани 18 час. В конце ферментации получают клетки с удельной активностью 7 МЕ/мг сухих клеток,5 Fermentation conditions: temperature 28-30 ° C, aeration 20 l / min, agitator 400 rpm, cultivation time 18 h. At the end of the fermentation, cells with a specific activity of 7 IU / mg dry cells are obtained,

0 съем 17 МЕ/мл.0 eat 17 IU / ml.

Предмет изобретени Subject invention

Способ получени L-аспарагиназы путем 5 аэробного глубинного культивировани культуры Erwinia carotovora на средах, содержа ших источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением фер мента, отличающийс тем, что, с целью 0 интенсификации процесса биосинтеза фермента , культивирование осуществл ют па среде, содержащей до 0,5% аминного азота; 0,1 - 1,0% неорганической соли аммони ; 0,5- 2,0% органической кислоты, например лимон5 ной, или многоатомного спирта, например глицерина; до 1,5% фосфатов; до 0,05% сернокислого магни , при рП 6,5-7,5 и температуре 28-42°С.The method of obtaining L-asparaginase by means of aerobic deep cultivation of Erwinia carotovora culture on media containing sources of carbon, nitrogen and mineral salts, followed by isolation of the enzyme, characterized in that, in order to intensify the process of enzyme biosynthesis, the cultivation is performed containing up to 0.5% amine nitrogen; 0.1 - 1.0% inorganic ammonium salt; 0.5-2.0% of an organic acid, for example, citric acid, or a polyhydric alcohol, for example glycerol; up to 1.5% of phosphates; up to 0.05% magnesium sulphate, with a RP of 6.5-7.5 and a temperature of 28-42 ° C.