SU295267A1 - Способ получения биологически активных веществ - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к области микробиологии , а именно к получению биологически активных веществ.

Известен способ получени  биологически активных веществ путем выращивани  их продуцентов Brevibacterium ketoglutamicum в питательной среде, содержащей углеводородные фракции нефти, источники азота, неорганические соли в присутствии стимул торов роста, например биотина.

Дл  большей эффективности и экономичности получени  биологически активных веществ по предложенному способу в качестве продуцента используют Brevibacterium ketoglutamicum АТСС 15587.

Предложенный способ осуществл етс  следующим образом.

Выращивание продуцентов Brevibacterium ketoglutamicum АТСС 15587 дл  получени  биологически активных веществ производ т в питательной среде, содержащей углеводородные фракции нефти, источники азота, неорганические соли в присутствии стимул торов роста , например биотина.

Процесс может протекать как в синтетической питательной среде, так и в естественной ферментативной среде, в течение всего периода времени, пока питательна  среда содержит основные, необходимые дл  нормального роста и развити  щтамма микроорганизма питательныр вещества, которые подаютс  в питательную среду в соответствующих количествах.

В качестве основного источника углерода в ходе протекани  процесса используют газообразные углеводороды, в частности такие, как метан, этан, пропан, нормальный бутан, изобутан , пропилен, бутилен и тому подобные соединени , а также различные смеси указанных соединений.

В ходе проведени  процесса в ферментационной среде в незначительных количествах могут, кроме того, присутствовать другие источники углерода, например жидкие углеводороды , включающие в себ  парафины: нормальный пентан, нормальный октан, нормальный декан и углеводы (глюкоза, фруктоза, мальтоза, сахароза, крахмал, крахмальные гидролизаты, меласса и т. п.) или другие соответствующие источники углерода (глицерин, маннит, сорбит, органические кислоты, глютамииова  кислота и т. п.).

Эти соединени  могут использоватьс  как в чистом виде, так и в виде двух или более упом нутых соединений, при этом количество этих веществ незначительно по сравнению с количеством газообразных углеводородов.

В качестве источника азота примен ют различного типа неорганические либо органические соли или соединени , такие как мочевина, аммиак, аммонийные соли (хлористый аммоНИИ , сернокислый аммоний, азотнокислый аммоний , фосфат аммони  и т. п.), или одну или несколько аминокислот в комбинации с натуральными соединени ми, содержащими азот, кукурузный, дрожжевой, м сной экстракты, пеитон, рыбную муку, казаминокислоту, рыбные растворимые иродукты, экстракт рисовых отрубей, рибонуклеиновую кислоту и т. п. Зти соединени  можно употребл ть как в чистом виде, так и в виде различных сочетаний . В качестве неорганических соединений примен ют сульфат магни , фосфат натри , нервичный кислый фосфорнокислый калий, вторичный фосфорнокислый калий, сульфат железа или другие соли железа, хлористый магний, хлористый кальций и т. п. Дл  ускорени  роста могут быть введены биотин или аминокислоты (глютаминоза  или аспарагинова ). Ферментацню нровод т в аэробных услови х , в частности нри аэробном встр хивании культуры или при перемешивании погруженной в питательную среду культуры, при температуре в пределах 20-50°С и рН среды 4,0-9,0. Получаемые по предлагаемому способу аминокислоты включают такие соединени , как глютаминова  кнслота, валин, лизин и аланин , а получаемые сахариды включают такие соединенн , как глюкоза, трегалоза. Кроме того, могут быть получены также витамины - рибофлавнн (витамин Е), органические кислоты (лимонна  кислота, аденозин5-фосфат . дифосфат аденозина и трифосфат аденозина). Дл  получени  аминокислот н относ щихс  к классу кислот циклических соединений в ферментативную среду следует вводить значительные колнчества источника азота, и кроме того, различные антибиотики, поверхностно активные вещества, жирные кислоты, спирты. Изобретение иллюстрируетс  следуюодими примерами. Пример 1. В трехгорлой колбе емкостью 250 мл приготовл ют 20 мл питательной ферментативной среды сле.1,ующего состава: NH4N082% Ь;а2НРО4-12Н2О0,05% КНоРО..0,05% MgSd4-7H200.01% MnS04-H2O0,001% FeS04-7H2O0,001% MnSO4-7H2O0,001% CaCl2-2H2O0,001% CuSO4-51-12050Y/1 НзВОзlOv/l Na2MoO.r2H2OIQy/l Экстракт кукурузный0,1% Значение рИ питательной АТСС 15587 в услови х аэробного встр хивани  инокулируетс  в ферментативной среде, после чего эту среду встр хивают при температуре 30°С с помощью термостатического смесител . Затем в среду ввод т газовую смесь нормального бутана с воздухом, при этом концентраци  бутаиа в ней составл ет нредпочтительно 50% по объему. Неиспользованный бутан может быть направлен на рециркул цию и совместно с порци ми свежего бутана вводитьс  в ферментативную среду. По истечеиии трех дней культивировани  в среду ввод т 0,1% бромида цетилтриметиламмони , иосле чего провод т дальнейщее культивирование в теченне четырех дней. В результате чего в ферментативной среде образуетс  0,30 г/дцл левовращающей глютаминовой кислоты , 0,12 г/дцл аланина, 0,05 г/дил валина и 0,00 г/дцл лизина. Культивирование осуществл ют в п тидес ти трегорлых колбах емкостью 250 мл и полученный G результате культивированн  сироп сливают из всех колб с последующ.им отделе щем от клеточного материала микроорганизмов (что производ т путем центрифугировани ) и получают полностью сброженный сироп . Затем рП среды 1 л полученного сиропа довод т до «2,0 путем добавлени  сол ной кислоты, обрабатывают в колонке с ионообменной смолой катионного тииа Амберлит УК 120 (тина Н), после чего ироизвод т выделение индивидуальных аминокислот методом элюировани  посредством последовательного повышени  значений рН. После этого концентрируют сироп и получают 0,8 г аланина. 0,4 г валина и 5 мл лизина. Кро.ме того, выдел ют 4 г сухого клеточного материала микроорганизмов . Пример 2. В ферментативной среде, котора  используетс  в ходе проведени  процесса, описанного в примере 1, осуществл ют инокулирование Brevibacterium ketoglutamicum АТСС 15587, после чего в услови х, описанных в примере 1, производитс  культивирование. По истечении суточного процесса культивировани  в ферментативную среду ввод т 50 ед/мл пенициллина G, и культивирование продолжают в течение 6 час. По завершении процесса культивировани  выдел ют 0,45 г/дцл левовращающей глютаминовой кислоты, 0,1 г/дцл трегалозы и 0,001 г/дцл глюкозы. Полученную L-глутаминовую кислоту подвергают адсорбции в колонне с ионообменной смолой, заиолненной Амберлитом 1R-120 (Н-тииа) так же, как в примере 1, с целью ее выделени . Затем 1 л вытекающей жидкости пропускают через другую колонну с ионообменной смолой, заполненную диалоном SA-1B (тииа борной кислоты ), и колонну со смолой элюируют 0,005- 0,03 мол. раствором борной кислоты дл  фракционировани  трегалозы и глюкозы, нри это.м получают 0.8 г кристаллов трегалозы и 5 мг кристаллов глюкозы.

Пример 3. Производ т инокулирование Brevibacterium ketoglutamicum АТСС 15587 в ферментативной среде, состав которой аналогичен составу ферментативной среды, используемой в ходе проведени  процесса по способу, описанному в примере 1, за исключением того, что концентраци  азотнокислого аммони  в данном случае доводитс  до 0,2%, а концентраци  экстракта кукурузы доводитс  до 0,01%После этого ферментативна  среда подвергаетс  встр хиванию в течение 7 дней в услови х, в которых проводитс  аналогична  операци  в ходе осуществлени  процесса, описанного в примере 1. По завершении указанного процесса в ферментативной среде образуетс  0, а-кетоглутаровой кислоты и 0,001 г/дцл лимонной кислоты. 1 л натуральной жидкости пропускают через колонну со смолой, заполненную Диалионом SA-11 RA (ОН-типа), что приводит к образованию лимонной кислоты и сс-кетоглутаровой кислоты, которые адсорбируютс  на указанной смоле, а затем колонну со смолой элоируют водой или водным раствором аммиака (до 1 н раствора), что нриводит к фракционированию смеси на лимонную кислоту и сс-кетоглутаровую кислоту.

К раствору элюата добавл ют примерно 1 г СаСЬ дл  отделени  кальциевых солей, соответственно , лимонной и а-кетоглутаровой кислоты , при этом получают 5 мг цитрата кальци  и 2 г а-кетоглутарата кальци .

Пример 4. Процесс ферментации осуществл ют в услови х, идентичных услови м, описанным в примере 2, в результате чего в ферментативном сиропе образуетс  5 мл рибофлавина (витамин 82). К 1 -л культуральной жидкости добавл ют 4 н раствора НС1 до рН 1,0 и образующуюс  муть удал ют с помощью центрифуги . Фильтрат концентрируют до примерно 100 мл и рП концентрированного фильтрата довод т до нужной величины добавлением едкого натра. Затем раствор выдерживают в течение п ти дней в холодном месте, при этом получают 4,5 мг кристаллов рибофлавина.

Характеристика щтамма Brevibacterium ketoglutamicum АТСС 15587.

Морфологи :

палочки размером 0,7-0,9X0.8-3,0 мк, встречаютс  удлиненные клетки, спор не образуют , неподвижны, грам-положительпые.

Культурные признаки:

а) колонии на питательном агаре: п тнистые , гладкие, сплошные, непрозрачные, блест щие; б) на скощенном агаре; умеренный рост, нитевидный, блест щий, розовато-оранжевого цвета, масл нистый; в) на жидкой питательной среде: немного .мутный, с пленчатой поверхностью, образует плотный осадок.

Физиологические характеристики:

растет при температуре 25-37°С (оптимальна  37°С); оптимальна  величина рН 6,0-8,0; Аэробные или анаэробные.

Отношение к различным веществам:

Лакмусовое молоко - не измеи ет, или имеет И1,елочну1о реакцию: .келатии-не сжнжает; стероводород-не образует; нндол-не образует; крахмал-не гидролизует; каталаза-положительно; уреаза-положительно; щтамм хорощо растет па Н. парафинах в качестве единственного источника углерода и образует кетоглутаровую кислоту, глутаминовую кислоту и аланин; в весьма малых количествах из глюкозы , фрукто.зы и сахарозы образует кислоты, мальтозу не усваивает.

Предмет изобретени 

Способ получени  биологически активных веществ путем выращивани  их продуцентов Brevibacterium ketoglutamicum в питательной среде, содержащей углеводородные фракции нефти, источники азота, неорганические солн в присутствии стимул торов роста, например биотина, отличающийс  тем, что в качестве продуцента биологически активных веществ используют Brevibacterium ketoglutamicum АТСС 15587.