SU1742325A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к холерному энтеротоксину биотипа эльтор - Google Patents

Abstract

Использование: биотехнологи , иммунологи . Сущность изобретени : штамм получают гибридизацией сплено цитов белых мышей, иммунизированных очищенным препаратом холерного энтеротоксина с миеломой Р3-Х63/Ад8.653. Штамм под номером ВСКК(П) 433Д хранитс  в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР и характеризуетс  следующими признаками: среда культивировани  RPM1-1640 или ДМЕМ, содержаща  10 - 15% тел чьей эмбриональной сыворотки. Посевна  доза клеток 105 - 1,5105 кл/мл, коэффициент рассева 1:4 - 1:5. Модальное число хромосом 87. Титр моноклональных антител (МКА) в культуральной -жидкости 1:256 - 1:512 (ИФА), в асцитической жидкости 1:25600-1:51200 (ИФА), 1:16-1:32 (РП). Нейтрализаци  холерного энтеротоксина в пробе по Крейгу 1:2000, нейтрализаци  холерного энтеротоксина на клетках СНО 1:320 - 1:640. МКА относ тс  к классу Ig С2в. Они вы вл ют энтеротоксин в супернатан- тах штаммов холерных вибрионов биотипа эльтор, не дают перекрестных реакций с энтеротоксинами классического биотипа и E.coli, ЛПС, выделенными из холерных эн- теротоксинов классического и эльтор биотипов , убитыми бактериальными клетками холерных вибрионов. МКА используют в диагностических цел х дл  серологической идентификации холерных энтеротоксинов биотипа эльтор. С/1 С 2 чэ со hO ел

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к гибридомной технологии получени  моноклональных антител (МКА), которые могут быть использованы дл  серологической идентификации холерного энтеротоксина (XT) биотипа эльтор.

Известны способы получени  МКА к холерному токсину классического биотипа.

Штаммы гибридных клеток, продуцирующих МКА к XT биотипа эльтор, в литературе не описаны.

Целью изобретени   вл етс  получение гибридного штамма культивируемых клеток Mus musculus, продуцирующего МКА к холерному энтеротоксину биотипа эльтор.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии Balb/c (массой 16 - 18 г) иммунизируют гомогенным препаратом XT. Дл  получени  XT используют штамм - продуцент XT In vitro Vibrio eltor 1310 серовара Oraea. Лиофилизированный препарат XT раствор ют в фосфатно-солевом буфере (рН 7,2). Схема включает б инъекций. Первые 2 инъекции провод т внутрибрюшинно (в/б) с интервалом в 1 мес в дозе 5 мкг по белку. Перед первой иммунизацией раствор XT эмульгируют с полным адъювантом Фрейн- да (ПАВ), последующую иммунизацию провод т нэтивным раствором XT 1310. Затем через 2 недели 2 дн  подр д внутривенно (в/в) ввод т раствор XT в дозе 5 мкг по белку. Заключительные инъекции раствором XT провод т через неделю два дн  подр д в/б по 20 мкг по белку. Иммунизацию завершают за 3 дн  до сли ни .

Иммунные спленоциты мышей сливают с клетками плазмоцитомы мышей РЗ-Х 63/Ад8.653 в соотношении 2:1. Сли ние клеток миеломы с клетками селезенки мышей провод т с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликол  с мол.массой 4000д. В стерильных услови х извлекают селезенку , измельчают ее с помощью гомогенизатора Даунса. Взвесь фильтруют через капроновое ситечко и обрабатывают 0,83%- ным раствором NhUCI, забуференным трис- буфером, дл  лизировани  эритроцитов. Лимфоциты дважды отмывают средой Игла- МЕМ и смешивают с дважды отмытыми клетками миеломы. Смесь клеток отмывают один раз в 50-миллилитровой центрифужной пробирке, супернатант декантируют и к осадку добавл ют 1 мл 50%-ного раствора полиэтиленгликол  в течение 1 мин по капл м при 42°С(на вод ной бане). После этого в центрифужную пробирку медленно вноситс  бессывороточна  среда RPM1-1640 в объеме до 10 мл, Взвесь клеток инкубируют при 37°С 10 мин, после чего один раз центрифугируют при 800 об/мин 7 мин. Супернатант декантируют и смесь клеток осторожно ресуспендируют в 40 мл ростовой среды (среда RPM1-1640 иди ДМ ЕМ с добавлением 20%-ной сыворотки эмбрионов коров, 5 мМ/мл L-глютамина, 4 г/л глюкозы , 0,1 М пирувата натри ), содержащей компоненты ГАТ (0,0131 мг/мл гипоксантина, 0,000191 мг/мл аминоптерина, 0,00385 мг/ мл тимидина). Суспензию клеток в ГАТ-сре- де разливают по 0,1 мл в 96-луночные плоскодонные планшеты, в лунки которых за сутки внесены в качестве фидерного сло  - перитонеальные макрофаги белых мышей в дозе кл на лунку. Видимые клоны гибридных клеток по вл ютс  на 7 - 10-е сутки . Гибридому культивируют 14 дней на

среде ГАТ, затем 7-10 дней на среде ГТ, после перевод т на ростовую среду без селективных компонентов. Гибридому дважды клонируют методом предельных

разведений на фидере из мышиных перито- неальных макрофагов. В результате клонировани  получают продуктивный штамм гибридных культивируемых клеток мыши, стабильно продуцирующих МКА заданной

0 специфичности.

Штамм обозначают ВСКК (П) 433 Д, он хранитс  в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР и ха5 рактэризуетс  следующими признаками. Морфологические признаки, Гибридные клетки ВСКК (П) 433 Д представл ют собой крупные округлые клетки с узким ободком базофильной цитоплазмы.

0 Ядра гиперхромные, неправильноовальной формы, крупные, с грубой структурой  дерного хроматина.

Культуральные признаки. Культуральные свойства типичны дл 

5 перевиваемых клеток мышиных плазмоци- том. Клетки ВСКК(П)433 Д культивируютс  в виде стационарной суспензии при 37°С в пластиковой или стекл нной посуде при посевной дозе 1,0- 1,5x10 кл./мл в течение 3 0 4 дней до плотности насыщени  8 - 9x105 кл./мл. Клетки пассируют один раз в 3-4 дн  той же дозой. Коэффициент рассева 1:4 - 1:5. Культивирование ведут на питательной среде RPM1-1640 или ДМЕМ, содер5 жащей 10 - 15% эмбриональной сыворотки коров, 2 мМЬтлютамина, 8-10 мМ буфера HEPES.

Культивирование штамма в организме экспериментальных животных.

0 Индукцию асцитных опухолей у интакт- ных беспородных белых мышей и инбред- ных мышей линии Balb/c, внутрибрюшинно праймированных за 2 - 3 недели до введени  гибридомы ПАФ в объеме 0,5 мл/мышь,

5 осуществл ют путем инокулировани  5x10 - 107 гибридных клеток на одно животное в 2 мл среды, Иммунную асцитическую жидкость собирают по мере формировани  асцитных опухолей через 10-14 дней в

0 объеме2-бмл,

Кариологиче ские признаки. Модальное число хромосом 87, С-мар- керы родительской миеломной линии РЗ- Х63Ад8.653.

5 Характеристика моноклональных антител .

МКА относитс  к lgG2. Они вы вл ют энтеротоксин биотипа эльтор, не вступа  во взаимодействие с энтеротоксинами классического биотипа и 026; ЛПС, выделенными из холерных вибрионов классическог и эльтор биотипов, убитыми бактериальными клетками холерных вибрионов Антитела тестируют в твердофазном иммунофермен- тном анализе (ИФА) и реакции преципитации (РП) по Оухтерлонии с XT 1310, по нейтрализации специфического действи  XT 1310 в тесте кожной проницаемости по Крейгу и нейтрализации цитотоксического действи  XT на овариальные клетки китайского хом чка (СНО). Класс иммуноглобулинов определ ют в РП по Оухтерлони или в ИФА с Hibvidoma subisotyping kit, mouse, Calbiochem (США).

Титр МКА в культуральной жидкости 1/265- 1/512 (ИФА); в асцитической жидкости 1/51200 (ИФА), 1/16-1/32 (РП); нейтрализации XT 1310 в пробе по Крейгу 1/2000; нейтрализации XT 1310 на клетках СНО 1/320- 1/640.

Стабильность продукции антител сохран етс  на прот жении пассажей в культуре и пассажей на животных в течение 18 мес (срок наблюдени ).

Контаминаци .

Бактерии и грибы в культуре клеток не обнаруживаютс . Заражение микоплазма- ми и вирусами не исследовали

Криоконсервирование.

Клетки штамма ресуспендируют в среде RPM1-1640, содержащей 50% эмбриональной сыворотки коров и 10% глицерина или диметилсульфоксида, Замораживание провод т ступенчато: после запаивани  ампул - эквилибраци  в течение 2 ч при 4°С, затем 24 ч в парах азота, затем клетки помещают в жидкий азот. Размораживание провод т быстро на вод ной бане при 37°С. Жизнеспособность клеток по включению 0,25%- ного трипанового синего составл ет 80 - 90%.

Иссследование специфичности МКА. . В качестве антигенных препаратов в тестах in vitro и in vivo используют убитые нагреванием бактериальные юлетки холерных вибрионов, ЛПС и энтеротоксины, выделенные из холерных вибрионов классического и эльтор биотипов и Е coli.

При постановке ИФА в качестве твердой фазы используют плоскодонные 96-лу- ночные ИФА-пластины, позвол ющие проводить фотометрический учет реакции. Дл  определени  специфичности МКА ИФА провод т на планшетах, сенсибилизированных гомогенным препаратом XT 1310, XT 569B или энтеротоксином Е.соИ 0,26 (10 - 20 мкг/мл по белку), либо суспензией убитых нагреванием бактерий (V.cholerae 569В. V.eltor 1310 1х108 кл/мл), либо ЛПС (5-10 мкг/мл по массе) в объеме 100 мкл в

0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ) рН 9,6 Сенсибилизацию провод т в течение 18 ч при 4°С В качестве вторых антител используют кроличьи антитела про- 5 тив иммуноглобулина мыши, меченные пе- роксидазой хрена. Субстратом служит ортофенилендиамин в цитратно-фосфатном буфере (рН 4,7) В качестве позитивного контрол  используют иммунную поликло0 нальную антитоксическую мышиную сыворотку , в качестве негативного контрол  - миеломный супернатант или асцитическую жидкость, индуцированную клетками мие- ломы.

5РП по Оухтерлони провод т в микромодификации с использованием 0,8 - 1 %-ного агара (Difco) или сахарозы (Serva), приготовленных на фосфатном буферном растворе (рН 7,4). В слое гел  вырезают лунки

0 на рассто нии 5 мм друг от друга, в центральную лунку внос т МКА, а в периферические - гомо- и гетероантигены в объеме 0.03 мл (нагрузка энтеротоксинов составл ет 25 - 30 мкг по белку на 1 лунку; цельных

5 убитых клеток 2 - 3x10 м.к. на 1 лунку). Контрол ми служат: позитивным - антитоксическа  холерна  сыворотка; негативными - миеломна  асцитическа  жидкость, развод ща  жидкость.

0Биологическую активность и специфичность МКА исследуют также в тесте проницаемости сосудов по Крейгу и на культуре клеток СНО.

В предварительных опытах определ ют

5 сосудистую проницаемость XT путем внут- рикожного (в/к) введени  кроликам последовательных разведений XT в объеме 0,1мл. Дл  смеси XT - МКА используют наименьшую дозу XT, дающую четкую зону посине0 ни  диаметром 7-8 мм. Дл  нейтрализации

используют МКА из асцитической жидкости

и лиофилизированные МКА. 0,1 мл XT в по- роговой дозе объедин ют с 0,1 мл МКА в

последовательных разведени х (в фосфат5 но-солевом буфере, рН 7,2), инкубируют 1 ч при 37°С, после чего 0,1 мл полученного , материала ввод т в/к кроликам. Через 24 ч в/в ввод т синьку Эванса и через 1 ч измер ют диаметр окрасившейс  зоны. Реакцию

0 нейтрализации считают положительной, если зона посинени  будет диаметром не более 4 мм. Каждый опыт сопровождают положительным (нейтрализаци  XT гомологичной экспериментальной кроличьей

5 антитоксической сывороткой (АТС) и отрицательным (сосудиста  проницаемость пороговой дозы XT) контрол ми.

Дл  определени  специфической антитоксической активности МКА в цитотоксиче- ском тесте на клетках СНО используют

препараты XT в минимальной дозе, оказывающей четкое цитотоксическое действие, 0,1 мл XT соедин ют с 0,1 мл МКА в последовательных разведени х (в среде Игла с 1% инактивированной эмбриональной сыворотки коров), инкубируют 2 ч при 37°С, затем по 0,1 мл смеси внос т в плоскодонные лунки 96-луночной панели дл  культуры клеток. В каждую лунку добавл ют по 0,1 мл суспензии клеток СНО в дозе 3x10 кл. Дл  контрол  специфического действи  XT используют экспериментальную кроличью АТС. В качестве отрицательного контрол  используют контроль культуры клеток СНО. Пластины помещают в эксикатор во влажную атмосферу с 5% СОз, выдерживают 18 ч при 37°С. Учет провод т по 4-крестной Системе.

В РП по Оухтерлонии МКА ВСКК (П) 433 Д на 7 с формируют в агаре одну четкую линию преципитации с XT биотипа Эльтор и не взаимодействует с другимугиспользованны- ми антигенами и микроорганизмами.

В ИФА МКА ВСКК(П) 433 Д взаимодействуют только с гомологичным энтеротокси- ном. Показатели экстинкции реакции с XT 569В, XT 569 (Calblochem), ЛПС, а также С цельными клетками штаммов: V.cholerae 569В, V.eltor 1310, имеют значение фонового сигнала.

П р и м е р 1.96-луночные ИФА-планше- ты сенсибилизируют гомогенным препаратом XT биотипа эльтор (10 - 20 мкг/мл по белку) в КББ (рН 9,6), полученным по известному методу. Дл  получени  XT используют штамм - продуцент XT In vitro. Планшеты выдерживают 1 ч при 37°С или 18ч при 4°С. Промывают пластины фосфатно-солевым буфером (ФСБ) рН 7,4, содержащим 0,05% Твина-20 и раститровывают по 0,1 мл асци- тическую жидкость, содержащую МКА, в ФСБ с 1%-ным бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 0,05% Твина-20. Инкубируют 2 ч при 37°С. Св завшиес  комплексы

антигена с антителом вы вл ют антимышиными глобулинами, меченными пероксида- зой хрена. Оптическую плотность измер ют на многоканальном спектрофотометре

Multiskan MK 11 (Flow, UK) при длине волны 492 нм или визуально. Ярко-желтое или оранжевое окрашивание лунок пластины при бесцветных отрицательных контрол х расценивают как специфическое. При наличии специфического окрашивани  позитивного контрол , основанного на использовании антитоксической холерной сыворотки к XT биотипа эльтор, делают заключение о том, что асцитическа  жидкость

содержит М КА к энтеротоксину биотипа эльтор .

П р и м е р 2. Цельные супернатанты культур холерных вибрионов, выращенных по известному методу, внос т в объеме 0,1

мл в лунки 96-луночных планшет, сенсибилизированных МКА и XT биотипа эльтор (10-20 мкг мл) в КББ (рН 9,6). Инкубируют 1 ч при 37°С. Пластины трижды промывают ФСБ, содержащим 0,05% Трина-20. В лунки

добавл ют конъюгированные с пероксида- зой хрена МКА к XT биотипа эльтор в рабочем разведении и оставл ют дл  контакта на 1 ч при 37°С. Приготовленный ex tempore субстрат по 0,1 мл добавл ют в лунки и помещают пластины в темный шкаф на 15 - 20 мин при комнатной температуре дл  цветового про влени  реакции. Положительным контролем  вл етс  реакци  между МКА и очищенным препаратом XT к биотипу

эльтор. Дл  отрицательного контрол  используют гетерологичные энтеротоксины и развод щую жидкость.

Результаты учитывают аналогично примеру 1.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L ВСКК(П)433 Д-продуцент моноклональных антител к холерному энтеротоксину биотипа эльтор.