SU1738847A1

SU1738847A1 - Method for cultivating nonsporogenic bacteria

Info

Publication number: SU1738847A1
Application number: SU894731123A
Authority: SU
Inventors: Виктор Александрович Гусев; Татьяна Владимировна Шильникова; Сергей Анатольевич Пушкарев; Римма Ароновна Шкрабина
Original assignee: Научно-Исследовательский Конструкторско-Технологический Институт Биологически Активных Веществ; Научно-Производственное Объединение "Вектор" Института Катализа Со Ан Ссср
Priority date: 1989-08-24
Filing date: 1989-08-24
Publication date: 1992-06-07

Description

Изобретение бтноситс к микробиологии , в частности к биотехнологии культивировани неспорообразующих микроорганизмов , и может быть использовано в микробиологической и медицинской промышленности.The invention is related to microbiology, in particular to biotechnology for the cultivation of non-spore-forming microorganisms, and can be used in the microbiological and medical industry.

Внедрение биотехнологии в производство биологически активных веществ требует оптимизации развити бактериальных попул ций и максимального использовани культуральных сред0 Ий- тенсификаци процессов культивировани может быть достигнута за счет уменьшени эффекта ингибировани роста клеток продуктами метаболизма.The introduction of biotechnology in the production of biologically active substances requires the optimization of the development of bacterial populations and the maximum utilization of culture media. Intensification of cultivation processes can be achieved by reducing the effect of cell growth inhibition by metabolic products.

Известно, что развитие микроорганизмов в культуральной жидкости прекращаетс задолго до полного исчерпани субстрата вследствие накоплени промежуточных продуктов метаболизма, иигибирующих их рост,В результате вIt is known that the development of microorganisms in the culture fluid ceases long before the complete exhaustion of the substrate due to the accumulation of intermediate metabolic products that inhibit their growth. As a result,

00

СWITH

каждом цикле ферментации тер етс до 50% и более исходного органического субстрата.Кроме того, сброс отработанной культуральной жидкости, содержащей продукты метаболизма, способствует нарушению экологического баланса микрофлоры окружающей среды.each cycle of fermentation loses up to 50% or more of the original organic substrate. In addition, the discharge of the spent culture fluid containing metabolic products contributes to the disturbance of the ecological balance of the microflora of the environment.

Известен диализный способ удалени продуктов метаболизма, ингибиторов роста из культивируемого объема. Способ позвол ет продлить активное размножение клеток в экспоненциальной фазе, в результате чего достигаетс более высока плотность попул ции.A dialysis method is known for removing metabolic products, inhibiting growth from a cultured volume. The method extends the active multiplication of cells in the exponential phase, with the result that a higher population density is achieved.

Однако повышение выхода биомассы с единицы культивируемого объема требует большого расхода культуральной гид- кости. Вследствие этого увеличение количества биомассы отрицательно сказываетс на суммарном количестве использованной культуральной среды. However, increasing the biomass yield per unit of cultivated volume requires a large expenditure of cultural gums. As a consequence, an increase in the amount of biomass adversely affects the total amount of culture medium used.

со ооwith oo

00 Јь 00 Ј

10ten

2020

ду сложности осуществлени в промышленности способ практического применени не находит.Because of the complexity of implementation in industry, the method of practical application is not found.

Наиболее близким к предлагаемому вл етс способ выращивани неспоро- образующих бактерий, предусматривающий инокул цию микроорганизмов в жидкой питательной среде с внесенным в нее высокодисперсным кремнеземом, содержащим на поверхности ОН-группы, в концентрации 0,1-1,0 мг/мл. В результате выход биомассы бактерий повышаетс на 20-711%.The closest to the proposed method is the cultivation of non-porous bacteria, which involves the inoculation of microorganisms in a liquid nutrient medium with highly dispersed silica introduced into it, containing on the surface of an OH group, at a concentration of 0.1-1.0 mg / ml. As a result, the biomass yield of bacteria increases by 20-711%.

Недостатком известного способа в- jj л етс малый прирост биомассы по сравнению с контролем.The disadvantage of the known method is a small increase in biomass compared with the control.

Цель изобретени - повышение выхода биомассы за счет оптимального использовани ресурсов питательной среды .The purpose of the invention is to increase the biomass yield due to the optimal use of nutrient resources.

Поставленна цель достигаетс тем, что выращивание клеток микроорганизмов осуществл ют в жидкой питательной среде в присутствии шариков из активной окиси алюмини в J-модификации с удельной площадью поверхности - 312 м /г в соотношеичи 50:1, которые помещают в перфорированную емкость,выполненную из химически инертного материала , и располагают в потоке аэрирующего газа.The goal is achieved by growing microorganism cells in a liquid nutrient medium in the presence of active alumina balls in J-modification with a specific surface area of 312 m / g in a ratio of 50: 1, which is placed in a perforated container inert material, and disposed in the stream of aeration gas.

Активна окись алюмини в У-модифи- кации, облада амфотерными свойствами и развитой поверхностью, при нейтральных значени х рН способна выполн ть функцию буферной среды и обеспечить удаление всех кислых продуктов метаболизма, ингибирующих рост микроорганизмов . Отсутствие неконтролируемых примесей, неизбежно присутствующих в сорбентах природного происхождени , позвол ет проводить процесс культивировани без изменени отработанных режимов ферментации.The active alumina in the Y-modification, has amphoteric properties and a developed surface, at neutral pH values, is able to perform the function of a buffer medium and ensure the removal of all acidic products of metabolism that inhibit the growth of microorganisms. The absence of uncontrolled impurities that are inevitably present in sorbents of natural origin, allows the cultivation process to be carried out without changing the spent fermentation regimes.

вий аэрации и перемешивани в рабочем (объеме ферментера, обеспечива мас- |соперенос между сорбентом и культу- ральной жидкостью. При соотношении более 50:1 происходит неполное удаление продуктов метаболизма микроорганизмов за счет недостатка сорбцион- ных центров сорбента. При соотношении менее 50:1 вноситс избыточное количество сорбента, требующее повышени интенсивности аэрации и активного перемешивани , что приводит к механическому измельчению сорбентаThis is a result of aeration and mixing in the working volume (the volume of the fermenter, providing a mass between the sorbent and the culture liquid. At a ratio of more than 50: 1, the products of the metabolism of microorganisms are incompletely removed due to the lack of sorption centers excessive amount of sorbent is introduced, which requires an increase in the intensity of aeration and active mixing, which leads to mechanical grinding of the sorbent

Способ осуществл ют следующим образом .The method is carried out as follows.

В ферментер заливают питательную среду и в перфорированную емкость из химически инертного материала помещают сорбент. Затем устанавливают режимы термостатировани , аэрации и перемешивани и внос т посевную дозу клеток. Культивирование микроорганизмов провод т в течение 6-7 м, контролиру оптическую плотность культуральной жидкости и определ число жизнеспособных клеток.A nutrient medium is poured into the fermenter and a sorbent is placed in a perforated container of chemically inert material. Then, thermostatting, aeration, and mixing regimes are established, and a seeding dose of cells is introduced. The cultivation of microorganisms was carried out for 6-7 m, controlling the optical density of the culture fluid and determining the number of viable cells.

Пример 1. В ферментер объемом 1 л помещают 800 мл глюкозы - мине- У. ральной среды М 9, внос т ииокул т I клеток E.coli штамм К-12 в посевной дозе 1:tOO. Культивирование провод т при в течение 6-7 ч.Example 1. In a 1 liter fermenter, 800 ml of glucose — a mineral medium, M 9, is placed, iiokul I is introduced into E. coli strain K-12 cells in a 1: tOO seed dose. Cultivation is carried out for 6-7 hours.

Перемешивание и аэрацию осуществл ют с помощью мешалки и путем подачи 35 стерилоного воздуха с интенсивностью, необходимой дл поддержани нормального роста клеток микроорганизмов. Число жизнеспособных клеток составл ет (2,9±0,М-10эмлStirring and aeration are carried out with a stirrer and by supplying 35 sterile air with the intensity necessary to maintain the normal growth of microbial cells. The number of viable cells is (2.9 ± 0, M-10 ell

Определение динамики роста числа жизнеспособных клеток провод т путем отбора проб через 30 мин с их последовательным разведением и высевом на поверхность агаризованной питательнойThe determination of the dynamics of growth in the number of viable cells is carried out by sampling after 30 min with their serial dilution and seeding onto the surface of the agarized nutrient

2525

4040

Экспериментальные данные по культи- 5 среды п°Дсч ет выросших колоний провод т через 1о ч после инкубировани Experimental data on culture-5 medium n ° Dsch of the grown colonies are carried out 1 h after incubation

вированию клеток E.coli на минималь- .ной среде с добавлением различных образцов у-окиси алюмини , отличающихс площадью поглощающей поверхности Sua, показывают, что при использовании сорбентов с Sya, уравной 1)0 и 312 , концентраци жизнеспособных клеток повышаетс в 5 и 17 раз соответственно по сравнению с контролем .E. coli cells on a minimal medium with the addition of various y-alumina samples differing in the absorption surface of Sua show that when using sorbents with Sya equal to 1) 0 and 312, the concentration of viable cells rises to 5 and 17 times, respectively, compared with the control.

Соотношение среда:сорбент 50:1 обеспечивает сорбцию продуктов метаболизма и при этом не измен ет услопри .The ratio of medium: sorbent 50: 1 provides for the sorption of metabolic products and does not alter the conditions.

5050

5555

П р и м е р 2, Культивирование клеток E.coli провод т, как в примере 1, кроме того, что в ферментер помещают перфорированную емкость из химически инертного материала, заполненную У-окисью алюмини в форме шариков с Бэд Равной . Соотношение объемов сорбента и суспензии 1:50. Аэрацию осуществл ют путем подачи воздуха через сорбент. Число жизнеспоEXAMPLE 2 The cultivation of E. coli cells is carried out as in Example 1, except that a perforated container of chemically inert material filled with U-alumina in the form of balls with Bad Equal is placed in the fermenter. The ratio of the volume of the sorbent and suspension 1:50. Aeration is carried out by supplying air through the sorbent. Life number

00

j j

Пример 1. В ферментер объемом 1 л помещают 800 мл глюкозы - мине- . ральной среды М 9, внос т ииокул т I клеток E.coli штамм К-12 в посевной дозе 1:tOO. Культивирование провод т при в течение 6-7 ч.Example 1. In a 1 liter fermenter, 800 ml of glucose - min- is placed. M 9, iliocult I of E. coli strain K-12 cells in a seed dose of 1: tOO. Cultivation is carried out for 6-7 hours.

Перемешивание и аэрацию осуществл ют с помощью мешалки и путем подачи 5 стерилоного воздуха с интенсивностью, необходимой дл поддержани нормального роста клеток микроорганизмов. Число жизнеспособных клеток составл ет (2,9±0,М-10эмлMixing and aeration is carried out with a stirrer and by supplying 5 sterilized air with the intensity necessary to maintain the normal growth of microbial cells. The number of viable cells is (2.9 ± 0, M-10 ell

5five

00

при .at.

П р и м е р 2, Культивирование клеток E.coli провод т, как в примере 1, кроме того, что в ферментер помещают перфорированную емкость из химически инертного материала, заполненную У-окисью алюмини в форме шариков с Бэд Равной . Соотношение объемов сорбента и суспензии 1:50. Аэрацию осуществл ют путем подачи воздуха через сорбент. Число жизнеспособных клеток составл ет (1,6+0,1) Х10 млEXAMPLE 2 The cultivation of E. coli cells is carried out as in Example 1, except that a perforated container of chemically inert material filled with U-alumina in the form of balls with Bad Equal is placed in the fermenter. The ratio of the volume of the sorbent and suspension 1:50. Aeration is carried out by supplying air through the sorbent. The number of viable cells is (1.6 + 0.1) X10 ml

I Примерз. Культивирование кле- ток провод -т, как в примере 2, ноI froze. Cultivation of the cells of the wire is as in Example 2, but

равнойequal to

173173

J)} 312 мг/г. Число жизнеспособных клетокJ)} 312 mg / g. The number of viable cells

млml

г1r1

используют сорбент с Suse a sorbent with S

знесг составл ет (5,1±Р,9)-1010Snesg is (5.1 ± P, 9) -1010

П р и м е р 4, Культивирование провод т подобно примеру 3, но при соотношении объемов сорбента и суспензии 1:20 и дл поддержани частиц сорбента во взвешенном состо нии увеличивают интенсивность аэрации и перемешивани культуральной суспензии. Это приводит к нарушению оптимума аэрации, измельчению сорбента и по влению мутности суспензии уже через 2 ч после начала культивировани и невозможности контрол за ростом клеток.EXAMPLE 4 Cultivation is carried out similarly to Example 3, but at a ratio of the volumes of the sorbent and the suspension to 1:20 and to maintain the particles of the sorbent in a suspended state, the intensity of aeration and mixing of the culture suspension is increased. This leads to a violation of the optimum aeration, grinding of the sorbent and the appearance of the turbidity of the suspension already 2 hours after the start of cultivation and the inability to control cell growth.

Примерз. Культивирование провод т подобно примеру 3 но при соотношении объемов сорбента и суспензии 1:60. Недостаток массы сорбента не обеспечивает полного удалени продуктов метаболизма. Число жизнеспособных клеток не выше, чем в примере 1.Froze The cultivation is carried out similarly to example 3, but with a ratio of the volumes of the sorbent and suspension of 1:60. The lack of mass of the sorbent does not ensure complete removal of metabolic products. The number of viable cells is not higher than in example 1.

П р и м е р 6. Культивирование провод т подобно примеру 3, но сорбент помещают непосредственно в ферментер.EXAMPLE 6 Cultivation is carried out similarly to Example 3, but the sorbent is placed directly into the fermenter.

88478847

При перемешивании сорбента происходит механическое измельчение сорбента, ввиду чего невозможен спектрофотомет- . рический контроль за ростом клеточной попул ции.When the sorbent is stirred, the sorbent is mechanically crushed, which is why a spectrophotometer is impossible. control over the growth of the cell population.

Таким образом, предлагаемый способ позвол ет оптимально использовать ресурсы питательной среды, повысить вы- jg ход биомассы в 5-17 раз и обеспечить полное удаление кислых продуктов метаболизма Сахаров, ингибирукхцих рост клеток,Thus, the proposed method allows optimal use of nutrient resources, increases the output of biomass by 5–17 times and ensures complete removal of the acidic products of the sugar metabolism, inhibiting cell growth,

Claims

15 The formula of the invention n-and

The method of cultivation of non-sporogenous bacteria in a liquid nutrient medium in the presence of a solid phase in

20 conditions of aeration, revealing that, in order to increase the yield, active alumina balls in the y-modification with a specific area are used as the solid phase

25 surface 140-312 mA / g in the ratio of 50: 1, placed in a perforated container, made of chemically inert material, and dispose of them in the stream of aerating gas.