SU1720003A1

SU1720003A1 - Способ определени липополисахаридных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови

Info

Publication number: SU1720003A1
Application number: SU904777248A
Authority: SU
Inventors: Светлана Николаевна Скопинская; Сергей Петрович Ярков; Владимир Николаевич Злобин
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения
Priority date: 1990-01-05
Filing date: 1990-01-05
Publication date: 1992-03-15

Abstract

Изобретение относитс к микробиологии и может быть использовано в иммунодиагностике инфекционных заболеваний. Цель изобретени - повышение точности способа. Определ емый антиген обрабатывают 0,1 н.щелочью при нагревании до 95&deg;С в течение 10 мин, встраивают его в мембрану липосом, внутрь липосомы включают маркер, в качестве которого используют водорастворимый флуоресцентный краситель кальци , и определ ют интенсивность флуоресценции маркера после постановки реакции комплементзависимого лизиса и по рассчитанной доле иммунного лизиса по калибровочной кривой определ ют концентрацию липополисахаридных антигенов. Способ позвол ет повысить точность определени в 2-3 раза. 3 табл.

Description

Изобретение относитс к микробиологии и может быть использовано в иммунодиагностике инфекционных заболеваний.

Цель изобретени - повышение точности способа.v

Способ осуществл ют следующим образом .

Осуществл ют встраивание определ емого антигена (АГ) в мембрану липосом, включение маркера внутрь липосомы, проведение реакции комплемент-зависимого лизиса с последующим определением АГ по выходу маркера из лизированных липосом. Перед включением маркера определ емый АГ обрабатывают 0,1 N сцелочью при нагревании до 95°С в течение 10 мин. В качестве маркера используют водорастворимый флуоресцентный краситель кальцин. Определ ют интенсивность флуоресценции маркера после постановки реакции комплемент-зависимого лизиса липосом с контрол ми и рассчитывают долю иммунного лизиса по выражению

ю

о

F6-(F3-Fi) + F5 F2-(F3-Fi) + F4

х 100%, (1)

о ы

где Fi - интенсивность флуоресценции суспензии липосом;

F2 - интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой стандартной антисыворотки и комплемента:

Рз - интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой только стандартной антисыворотки;

F4 интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой только комплемента;

FS - интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой сыворотки больного и комплемента;

Fe - интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой сыворотки боль- ного, комплемента, стандартной антисыворотки.

Концентрацию липополисахаридных антигенов определ ют по калибровочной кривой.

Пример 1. Получение липосомаль- ного иммунореагента.

Раствор липидов - ичный лецитин, холестерин , дицетилфосфат(в мол рном соотношении 2:1, 5:0,22) в смеси хлороформ, метанол (2:1 пообъему)упариваютна роторном- испарителе до образовани липидной пленки. Полученную пленку липидов раствор ют в 1,5 мл диэтилового эфира, добавл ют 0,5 мл раствора липополисахарида (ЛПС), предварительно обработанного 0,1 N NaOH и содержащего 175 мМ кальцеина.

Полученную двухфазную систему подвергают действию ультразвука в дезинтеграторе при частоте 22 кГц в течение 20-30 с. Полученную эмульсию упаривают на роторном испарителе до образовани твердого гел при 35-45 КПа. а затем при 25 КПа до полного удалени эфира. Невключающийс маркер отдел ют гельфильтрацией на колонке с сефадексом G-50. Полученный липосомальный иммунореагент сохран етс при +4°С в течение 3-4 мес цев без утраты своей биологической активности.

П р и м е р 2. Количественное определение содержани ЛПС в сыворотке крови больного.

В две пробирки внос т по 10 мкл сыворотки больного и по 20 мкл антисыворотки с разведением 1:32.

Через 10 мин инкубации при комнатной температуре добавл ют 40 мкл (60 нмолей липида) суспензии липосомального иммунореагента , дополнительно инкубируют 10 мин, после чего внос т 10 мкл триссолевого буфера, содержащего 5 мМ MgCfe и 1,5 мМ CaCl2 и 20 мкл комплемента, в качестве которого используют сыворотку крови морской свинки или кролика. Объем смеси довод т до ТОО мкл трис-солевым буфером. Параллельно став т контроли на неспецифический лизис липисом антисывороткой и исследуемой сывороткой больного в присутствии комплемента. Через 30 мин реакции останавливают 3 мл трис-солевого буфера. Флуоресценцию измер ют в кювете с длиной оптического пути 1 см или пробирке при длине волн эмиссии и возбуждени 493 и 520 нм соответственно.

Расчет величины иммунного лизиса

проводитс по уравнению (1), при этом берутс средние значени двух параллельных измерений. По калибровочной кривой опре- дел ют содержание ОПС-антигена в мкг/мл, которое дл трех образцов сывороток больных сальмонеллезом составило 0,7; 11,2; 29,5 мкг Л ПС/мл образца сыворотки крови больного.

В табл. 1 отражены результаты определени интенсивности флуоресценции и расчет величины концентрации и процента иммунного лизиса дл трех различных сывороток больных с различными содержани ми соматического 0-антигена Salmonella fyphlmurium в сыворотке крови.

П р и м е р 3. Повышение воспроизводимости и точности метода.

Липосомы приготовили, как указано в примере 1, определение антигена провод т,

как указано в примере 2. В табл. 2 приведены значени доли иммунного лизиса и концентрации антигена, определенного с одной партией липосом в сыворотке крови больного, что отражает воспроизводимость

метода.

В табл. 3 приведены значени определени величин иммунного лизиса, соответствующего определенным концентраци м ЛПС-антигена в растворе. Дл проведени

анализа вз ты приготовленные каждый раз заново партии липосомального иммунореагента , что отражает воспроизводимость метода .

П р и м е р 4. Построение калибровочной кривой.

Дл построени калибровочной кривой готов т р д разведений стандартного раствора ЛЛС S. ityphlmurulm в трис-солевом

буфере. 10 мкл раствора ЛПС каждой концентрации смешивают с 20 мкл стандартной антисыворотки. Используют такое разведение антисыворотки, которое дает 90-60% от максимального иммунного лизиса. Определ ют иммунный лизис в тех же услови х, что ис образцами сыворотки больного. Став т также контроли: липосомы только с буферным раствором, липосомы только с антисывороткой , липосомы только с

комплементом. За 100% принимают величину иммунного лизиса липосом в отсутствие ЛПС. Диапазон измер емых концентраций от 0,5 до 200 мкл/ЛПС/мл исходного раствора . Стро т кривую зависимости величины иммунного лизиса от логарифма концентрации Л ПС в растворе.

Предложенный способ позвол ет в 2-3 раза повысить точность в сравнении с известным способом.

Изобретением может быть использовано в практике здравоохранени дл экспресс- диагностики инфекционных заболеваний и определени т жести их протекани контрол загр знени окружающей среды, в научно- исследовательской практике дл изучени динамики антигенемии при экспериментальном инфицировании животных.

Предложенный способ легко может быть автоматизирован, требует малого (10 мкл) количества исследуемой сыворотки.

0

5

Claims

Формула изобретени Способ определени липополисахарид- ных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови, включающий встраивание антигена в мембрану липосом, включение маркера внутрь липосом, проведение реакции комплементозависимого лизиса с последующим определением антигена по выходу маркера, отличающ и и с тем, что, с целью повышени точности способа, липополисахариды перед встраиванием в липосомы обрабатывают 0.1 н.щелочью при нагревании до 95°С в течение 10 мин, в качестве маркера используют кальцеин, невключившийс маркер отдел ют гельфильт- рацией, а выход маркера определ ют флюориметрически.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3