SU1719387A1 - Штамм бактерий ВRаDYRнIZовIUм Sp.(НеDYSаRUм) дл получени бактериального удобрени под копеечник альпийский - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к сельскохоз йственной микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам повышени  урожайности бобовых культур . Целью изобретени   вл етс  создание штамма Bradyrhizoblum sp. (Hedysarum) дл  получени  бактериального удобрени  под копеечник альпийский. Штамм бактерий Bradyrhizoblum sp. (Hedysarum) выделен из клубеньков копеечника альпийского, депонирован во ВНИИСХМ Мг 1406 (дл  получени  бактериального удобрени  под копеечник альпийский). Штамм позвол ет увеличить урожай зеленой массы копеечника альпийского на 6,9 ц/га или на 109,5% по сравнению с контролем. Штамм улучшает качество урожа  за счет значительного повышени  содержани  в нем белка на 7,9%. 4 табл. ч- Ё

Description

Изобретение относитс  к сельскохоз йственной микробиологии и биотехнологии. в частности к микробиологическим средствам повышени  урожайности бобовых культур .

До насто щего времени активных и специфичных штаммов Rhlzoblum дл  усилени  симбиотической азотфиксации у копеечника альпийского не было предложено .

Известен и используетс  дл  инокул ции л двенца - кормовой бобовой культуры. произрастающей в ареале распространени  копеечника альпийского, штамма Bradyrhizoblum sp. (Zotus) 476.

Однако он не может быть использован в качестве микросимбионта копеечника альпийского , так как не вступает в активный симбиоз с этой культурой.

Целью изобретени   вл етс  создание штамма Bradyrhlzobium sp. (Hedysarum) дл  получени  бактериального удобрени  под копеечник альпийский.

Клубеньковые бактерии штамма 1406 выделены из клубеньков копеечника альпийского .

Штамм идентифицирован по определителю Берги.

Штамм Bradyrhizobium sp. (Hedysarum) 1406 депонирован в коллекции клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохоз йственной микробиологии под номером 1406.

Штамм 1406 растет на питательных средах следующего состава:

ю со

00

VJ

1.Гороховый агар (г/л): горох 100,0; сахароза 20,0; агар 20,0; рН среды 6.8-7,0.

2.Маннитно-дрожжевой агар (г/л); ман- нит 10,0; К2НР04 0.5; MgSO ix7H20 0,2; NaCI 0,1; дрожжевой экстракт 0,4; агар 15,0; рН среды 6,8-7,0.

3.Маннитно -дрожжевой агар с бромти- молсиним (г/л): маннит 10,0; К2НР04 0,5; MgS04x7H20 0,2; NaCI 0,1; дрожжевой экстракт 0,4; агар 15,0; бромтимолсиний 5 мл 0,5%-ного спиртового раствора; рН среды 6,8-7,0.

Культу рал ьно-морфологические признаки .

На косом гороховом агаре с рН 6.8-7,0 при 26-28° С трехсуточна  культура имеет форму слегка изогнутых палочек с закругленными концами; величина клеток 1,8-2,4 х 0,6-0,7 мкм, грамотрицательные, до 48 ч подвижные, затем по мере старени  к 4 сут - тер ет подвижность, монотрихи. Медленнорастуща  культура.

Образование специализированных клеток - при старении культуры на гороховом агаре с рН 6,8-7.0 и температурой 26-28°С в возрасте 10 сут и более образуютс  бактероиды ветвистой формы.

Характеристика роста на плотной среде а) по штриху; б) колонии.

1.Гороховый агар, рН 6,8-7,0, Т 26-28°С.

а)Штрих п тисуточной культуры обиль-. ный, бесцветный, слизистый, стекающий, плоский;

б)колонии по вл ютс  на 7-е сутки; на 10-е сутки колонии имеют размер 3--4 мм. отнотипныё, круглые, выпуклые, с ровными кра ми, слабо растекающиес , слизистые. S-формы, беловатые.

2.Маннитно-дрожжевой агар, рН 6,8- 7.0, Т 26-28°С;

а)Штрих обильный, бесцветный, слизистый , сильно стекающий;

б)Колонии по вл ютс  на 7-е сутки; на 10-е сутки имеют размер 4-5 мм, однотипные , круглые, выпуклые, с ровными кра ми, растекающиес , слизистые, S-формы, беловатые .

3.Маннитно-дрожжевой агар с бромти- молсиним, Т 26-28°С, рН 6,8-7,0.

а)Штрих обильный, желтоватый, слизистый , сильно стекающий;

б)Колонии по вл ютс  на 7-е сутки; на 10-е сутки имеют размер 4-5 мм, однотипные , круглые, выпуклые, с ровными кра ми, растекающиес , слизистые, S-формы. желтоватые , среда желтовата .

Рост в жидкой среде. Молоко с лакмусом, Т - 26-28°С - среду не пептонизирует, подщелачивает. Начина  со вторых суток, окраска измен етс  в сторону синего спектра, максимальное изменение окраски молока отмечаетс  на 15-е сутки. На поверхности лакмусового молока через 3 сут образуетс  слизиста  прозрачна  зона, котора  достигает максимальных размеров 10 мм через 15 сут.

Физиолого-биохимические свойства.

Микросимбионт. Микросимбионт - бо- 0 бовое растение копеечник альпийский.

Отношение к:

а)кислороду - аэроб

б) Т максимальна  40°С

минимальна  10° С 5 оптимальна  26-30°С

с) рН максимальна  7.5

минимальна  5,0

оптимальна  6,8-7,0

Источники углерода: 0Де

ГлюкозаАк (-)

ГалактозаАк (-)

СахарозаАк (-)

ЛактозаАщ (-)

5 МаннитАк (-)

СорбитАк (-)

РамнозаАк (-)

КсилозаАк (-)

МальтозаАк (-)

0 Клетчатка

Крахмал

Жидка  среда Норриса, Т 26-28°С.

Источники азота

NaNOa+

5 (NH4)2S04+

Тирозин+

МПА

Азот фиксирует в симбиозе с копеечником альпийским.

0 Другие характерные физиологические особенности обмена.

Воздействие на диагностические субстраты: желатину не разжижает. Штамм не патогенен.

5 Штамм 1406 хранитс  на бобовом агаре указанного выше состава рН 6,8-7,0 при 4°С и пересеиваетс  один раз в 6 мес.

Оценку симбиотических свойств штамма 1406- вирулентности, азотфиксирующей 0 активности и эффективности, симбиоза - провод т в услови х микровегетационных и вегетационных опытов.

Вирулентность определ ют по количеству и морфологии клубеньков, образован- 5 ных при инокул ции копеечника альпийского, опытными штаммами клубеньковых бактерий.

Азотфиксирующую активность определ ют по величине активности нитрогеназы. В свою очередь нитрогеназную активность

измер ют ацетиленовым методом (по редукции ацетилена) на интактных растени х .

Эффективность симбиотической азот- фиксации определ ют по общему накоплению азота растени ми на сосуд, а также по величине урожа  зеленой массы копеечника альпийского и содержанию в ней азота, который определ ют с помощью системы Кьельтек-ауто-Текатор (Швеци ).

Пример 1. Микровегетационный опыт.

В большие пробирки с 5 г стерильного вермикулита добавл ют 11 мл среды Кра- сильникова-Корен ко следующего состава , г/л: К2НРСМ 1,0; MgS04x7H20-1,0; Саз(Р04),2; 1 мл смеси микроэлементов по прописи М.В. Федорова, г/л: НзВОз 5,0; (NH4)2Mo04 5.0; KJ 0.5; NaBr 0,5; ZnS04x7H20 0,3; AI2(S04)3x18H20 0,3; MnS04 0,2; CuS04 0,2. Стерилизуют в автоклаве . Семена копеечника альпийского ви- дообразца из ВИЛР скарифицируют и стерилизуют концентрированной серной кислотой в течение 3 мин, промывают стерильной водой и раскладывают на увлажненные стерильной водой бумажные фильтры в чашках Петри дл  прорастани . Через двое суток проращивани  в асептических услови х раскладывают в пробирки со средой (по 2 проростка). Опыты став т в 10-ти кратной поверхности. Клубеньковые бактерии дл  инокул ции растений выращивают на косом гороховом агаре в пробирках в течение 3 сут при 28°С и суспендируют в растворе микроэлементов. Через двое суток после посева сем н в каждую пробирку с растени ми внос т по 1 мл инокулюма, имеющего концентрацию 107 клеток в 1 мл. Растени  выращивают в фитотроне при 22-24°С. Через 48 дней пробирки герметично закрывают и ввод т шприцом ацетилен до концентрации 10% по объему. Количество этилена, образовавшегос  в результате восстановлени  ацетилена нитрогеназной клубеньковых бактерий, определ ют через 24 ч на газовом хроматографе Цвет- 100. Величину нитрогеназной активности клубеньков, котора  характеризует азотфиксирующую активность штаммов, выражают в микромол х СзН4 за 24 ч на сосуд. Результаты представлены в табл. 1.

Как показывает табл. 1, бактерии предлагаемого штамма 1406 вирулентны на копеечнике альпийском: они образуют на его корн х типичные дл  этого растени  клубеньки , а бактерии известного штамма 476 в этих услови х слабовирулентны: образуют белые, мелкие клубеньки не на всех растени х .

Штамм 1406  вл етс  активным азот- фиксирующим микросимбионтом копеечника альпийского: нитрогеназна  активность клубеньков, образованных бактери ми это- 5 го штамма на копеечнике альпийском, на 3 пор дка выше, чем у растений, инокулиро- ванных штаммом 476.

Нитрогеназна  активность копеечника альпийского, инокулированного штаммом 10 476, была на уровне контрольных растений, следовательно, бактерии этого штамма не обладают азотфиксирующей активностью в симбиозе с данной бобовой культурой.

Результаты микровегетационного 15 опыта по определению общего накоплени  азота копеечником альпийским, бактеризованным вышеупом нутыми штаммами, представлены в табл. 2.

Как показывают данные этой таблицы, в 0 результате активной фиксации атмосферного азота клубеньковыми бактери ми штамма 1406 в симбиозе с копеечником альпийским улучшалась обеспеченность растений азотом, благодар  чему общее 5 накопление азота в них было на 124% выше , чем при использовании штамма 476. При этом урожай зеленой массы растений, инокулированных штаммом 1406, повысилс  на 36,2%, а содержание азота в ней 0 на 1.25%.

В клубеньках растений, инокулированных штаммом 476, симбиотическа  азотфиксаци  отсутствовала, растени  дополнительно не снабжались азотом из воз- 5 духа, в результате продуктивность копеечника альпийского в этом варианте не увеличилась.

Приведенные материалы свидетельствуют о том, что активна  симбиотическа  0 азотфиксаци  у копеечника альпийского может быть получена только при онокул - ции специфичными дл  него штаммами клубеньковых бактерий. Ввиду этого в дальнейшем опыты штамм 476 не включал- 5 с .

Пример 2. Вегетационный опыт проводили в сосудах с 6 кг дерновоподзоли- стой почвы с внесением солей по прописи Пр нишникова, но без азота, г/кг почвы: KCI 0 0.15; MgS04 0,06; СаНРСМ 0,172; MnSU4 0.003; борна  кислота 0,003 (NH MoO/i 0,001. Повторность опыта 4 кратна . Использовали семена копеечника альпийского видообразца из ВИЛР. Дл  инокул ции 5 сем н использовали чистую культуру бактерий на скошенном гороховом агаре. Культуру в пробирках с титром 4-5 млрд смывали водопроводной водой, затем суспензию наносили на семена копеечника альпийского, разложенные в лунки, еделанные в почве каждого сосуда. В сосуд вносили 108 клеток.

Данные по эффективности инокул ции копеечника альпийского в вегетационном опыте штаммом 1406 представлены в табл. 3.

Из табл. 3 следует, что штамм 1406 вступает в эффективный симбиоз с копеечником альпийским, усиливает у него процесс симбиотической аэотфиксации и благодар  этому свойству способен увеличивать продуктивность растени -хоз ина: урожай зеленой массы повысилс  на 124,4%, содержание азота в растени х на 1,02%.

Пример 3. Получение препарата на основе штамма 1406.

Посевную культуру выращивают на качалке в колбах или п тилитровых бутыл х в течение 2 сут на среде следующего состава, мас.%: гороховый отвар 10,0; сахар (пищевой ) 1,0; (NH4)2S04 0,5; КН2Р04 0.05; К2НР04ХЗН20 0.05; MgS04x7H2O 0,02; СаСОз 0,1; вода водопроводна  до 100.0; рН после стерилизации (1,0 эти, 30 мин) 6.8-7,0. Титр клеток 4-5 млрд/мл. Посевную культуру используют дл  приготовлени  жидкой рабочей культуры. Ее готов т в п тилитровых бутыл х или ферментаторах на среде следующего состава, мас.%: кукурузный экстракт 1; меласса 2,0; (NN4)2804 0,1; КН2Р04 0,025; К2НР04ХЗН20 0,025, MgS04x7H200,02; СаСОзО.1; вода водопроводна  до 100,0; рН после стерилизации 6,8-7,0.

Бутыли и ферментаторы засевают посевной культурой клубеньковых бактерий в количестве 5%. Бутыли встр хивают на качалке в течение 48-60 ч. В ферментаторах бактерии выращивают 36-48 ч при 28-30°С. Титр 4-5 млрд/мл. После микробиологического контрол  культуральную жидкость из бутылей или ферментаторов - инокулюм - используют дл  смешивани  с торфом.

Подготовка торфа. Размолотый низин- ный торф, нейтрализованный мелом до рН 6,8-7,0, с влажностью 30-40% в полиэтиленовых пакетах по 200-400 г стерилизуют гамма-облучением при дозе 2,5 Мрзд Стерильный торф в пакетах инокулируют инъекцией смеси: культуральна  жидкость + меласса (6%) из расчета исходного титра бактерий в торфе 0,3-0,5 торфа и влажности 45-60%. Затем пакеты загружают в Специальные смесители, при вращении которых перемешиваетс  их содержимое . Культуру в торфе подращивают, выдержива  пакеты 3-5 сут при 15-20°С. Ризоторфин хран т при 3-8°С в темном сухом помещении отдельно от  дохимикатов.

Характеристика готового продукта.

Ризоторфин дл  копеечника альпийского на предлагаемом штамме представл ет собой по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета, без запаха, нерастворимую в воде. Влажность готового препарата 50-55%. Ризоторфин содержит 3-4 млрд клубеньковых бактерий на 1 г торфа . Срок годности препарата 6 мес со дн  изготовлени . Расход препарата 200 г на гектарную норму сем н.

Пример 4.

Конкретное использование штамма в полевых услови х.

Вли ние штамма 1406 на урожай копеечника альпийского изучают в полевом опыте на дерново-подзолистой почве. Площадь дел нки 20 м2. повторность опыта 4-кратна . Внос т минеральные удобрени 

P120K120.

Используэт семена копеечника альпий- ского. Семена обрабатывают торф ным препаратом-ризоторфином, изготовленным на предлагаемом штамме. Доза препарата 200 г на гектарную норму сем н, титр препарата 4 млрд/г.

- Способ внесени  препарата: 200 г ризо- торфина развод т в 1,0 л водопроводной воды и, не дава  суспензии отстаиватьс , нанос т ее на гектарную норму сем н. Затем семена тщательно перемешивают дл  равномерного распределени  препарата. Обработанные ризоторфином семена высевают в тот же день во влажную почву.

Эффективность симбиотической азот- фиксации штамма 1406 с копеечником альпийским определена по величине урожа  зеленой массы растений так называемого лекарственного сырь , куда вход т листь , тонкие стебли, бутоны и цветы, а также по содержанию белка в сырье.

Штамм 1406  вл етс  видоспецифич- ным по отношению к копеечнику альпийскому , по сравнению с ранее описанным, т. е. известный штамм не вступает в эффективный симбиоз с копеечником альпийским. Поэтому в полевом опыте было лишь два варианта: контроль, где растени  могли инфицироватьс  природной попул цией ризо- бий, и вариант с инокул цией штаммом 1406.

Данные табл. 4 показывают, что штамм 1406  вл етс  высокоэффективным симбио- тическим азотфиксатором. Улучшение азотного питани  копеечника альпийского за счет более интенсивного поступлени  биологического азота оказывает положительное вли ние как на урожайность растени -хоз ина, так и на его качество. Урожай зеленой массы копеечника альпийского при инокул ции этим штаммом повышаетс  на 6,9 ц/гз или на 109,5%. Штамм улучшает качество урожа  за счет значительного повышени  содержани  в нем белка на 7,9 %.

Таким образом штамм Bradyrhlzobium sp. (Hedysarum) 1406 существенно увеличивает азотфиксирующую активность копеечника альпийского, повышает его продуктивность, что указывает на то, что предлагаемый штамм  вл етс  активным

азотфиксирующим микросимбионтом копеечника альпийского и может быть использован дл  получени  бактериального удобрени  под это растение.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм бактерий Bradyrhlzobium sp. (Hedysarum) ВНИИСХМ 1406 дл  получени  бактериального удобрени  под копеечник альпийский.

   Таблица 1

   Вирулентность и азотфиксирующа  активность штаммов 1406. 476

   р-4.3%.

   НСРо.95

   0,30 мкмоль/сосуд Таблица 2

   Эффективность симбиотической азотфиксации штаммов 1406 и 476

   р 3,0 %; HCPos 2.2 мг/сосуд

   Таблица 3

   Эффективность симбиоза штамма 1406 с копеечником альпийским

   НСРо.95

   11171938712

   Таблица 4

   /

   Вли ние штамма 1406 на урожайность копеечника альпийского