SU1707541A1

SU1707541A1 - Иммуноферментный способ определени миоглобина в крови

Info

Publication number: SU1707541A1
Application number: SU884426870A
Authority: SU
Inventors: Сергей Петрович Смотров; Ирина Николаевна Шарипова; Дмитрий Борисович Сапрыгин; Фаик Гадирович Ислам-Заде; Пинхас Моисеевич Аширов
Original assignee: Таджикский государственный университет им.В.И.Ленина; Институт сердечно-сосудистой хирургии им.А.Н.Бакулева
Priority date: 1988-05-12
Filing date: 1988-05-12
Publication date: 1992-01-23

Abstract

Изобретение относитс к медицине, в частности к иммунодиагностике, и но-, жет быть использовано а кардиологии, хирургии и клинической медицине дл диагностики степени разрушени мышечных клеток. Цель изобретени заключаетс в повышении точности иммунобер- ментного способа определени мио гло- бииа з крови. Сущность изобретени состоит в том, что при иммунсЛермент- ном анализе исследуемую пробу плазмы, сыворотки или цельной крови предвари- Тельнд смешивают с раствором Формаль- дегида до его конечной концентрации 3 Мкг/мл и инкубируют в течение 1 ч при 30 С, диалИзуют и добавл ют к сорбированным на твердой фазе антителам к ммуноглобулину. Отмывку твррдой фазы после каждой операции осуществл ют раствором казеина концентрацией 0,5 мг/мл. Предлагаемый способ поэ ио- л ет повысить точность определени миоглобина в 7 раз по сравнению с прототипом. 4 табл. Ј с

Description

Изобретение относитс к медицине, в частности к иммунодиагностике, и может быть использовано в кардиологии, хирургии и клинической медицине дл диагностики степени .разрушени мышечных клеток.

Целью изобретени вл етс повыше- ние точности способа.

Способ осуществл етс следующим образом .

Очищенными антителами к миоглобнну в концентрации 7.1 мг/мл при рЯ 9,6 в объеме 3- мкл : t.iudiov гл;.лг. гиро- ловый планшет п иммунологических реакций при 4°С п течение 18 ч. Одновременно обрабатывают миоглобин-стандарт и пробу крови формальдегидом. Дл этого к ЗОТ мкл миоглобина-стан- дарта с концентрацией 1 мг/мл добавл ют 30 мкл 3%-ного раствора Лормаль- дегида и смесь инкубируют в течение 1 ч при 30 С. После этого смесь подвергают диализу против 0,05 М ного буфера рН 7,2 в течение 40- 60 мин при перемешивании и частой смене диализируюцего раствора. Диалогичным образом к 300 мкл предварительно разведенной в 10 рач платмы кроим добавл ют 30 мкл 3%-ного РЯС вора Формальдегида и сме.ь инкубируют в течение 1 ч при 30°С. После этого смесь диапиз-уют против фосфатного

|

о i

СЛ Јь

3

буфера рН 7,2. Приготовленный таким образом миоглобнн-стандарт используют дл построени калибровочной кри- , вой, а пробу - дл иммуноферментного определени уровн мкоглобина.

Пример 1. В лунки планшета, содержащие антитела к многлобину, добавл ют обработанный формальдегидом миоглобинсодер ащий раствор плазмы крови пациента в объеме 50 мкл на лунку и инкубируют в течение ДО мин при 37°С. После отмывки водой лунки обрабатывают 350 мкл раствора казеина с концентрацией 0,5 мг/мл в 0,01 М фос- фатном буфере рН 7,2 в течение 3 мин.. После этого в каддую лунку добавл ют по 50 мкл разведенных 1:500 меченых пероксидазой антител к миоглобину человека и инкубируют в течение 40 мин при 37°С. После отмывки водой лунки обрабатывают раствором казеина с концентрацией 0,5 мкг/мл в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2 в течение 3 мин. Определ ют пероксидазную активность по общеприн той методике в присутствии хромогена 0-фенилендиамина. Врем экспозиции составл ет 20 м н, а после остановки ферментативной реакции 50%-ной серной кислотой.измер ют ОПТИ ческую плотность при 492 нм. По ре- :эультатам оптической плотности растворов-стандартов стро т калибровочную кривую и по ней рассчитывают концентрацию миоглобина в испытуемой плазме крови.

Пример 2. Анализ уровн миоглобина в цельной кропи и пробе сыворотки крови пациента провод т по при

-

15 20 25 JQ ботки 35

75414

тимальной и однозначной концентрацией казеина вл етс 0,5 мг/мл, о чем свидетельствует наиболее низка оптическа плотность раствора в холостом опыте.

Показано, что значени коэффициента вариации, характеризующего точность метода, рассчитанные дл каждой определ емой концентрации миоглобина, дл предлагаемого способа значительно меньше, чем дл прототипного. Это указывает на более высокую точность предлагаемого способа. Более нагл дно это видно из соотношени значений этого коэффициента прототипа/CV предлагаемого ) дл каждой определ емой концентрации . Это соотношение лежит в пределах 2,55 - 13,31. Среднее значение соотношени составл ет 7,651:4,09. Это говорит о том, что предлагаемым способом можно определить уровень миоглобина с точностью, более чем в 7 раз. превышающей точность известного способа .

Оптимальность предлагаемых параметров способа - концентрации Аормаль- дегида 3 мг/мл, времени обработки Формальдегида 1 ч, температуры обра- иллюстрируют -табл. 1-4.

30°С ботки

Claims

Формула изобретени

Иммуноферментный способ определени миоглобина в крови, включающий сорбцию антител к миоглобину на твердую фазу, инкубацию с исследуемой пробой крови, добавление меченых пе- роксидаэой антител к миоглобину, от

меру 1. По результатам анализа уровень40 мывку после каидой стадии, внесение

миоглобина в цельной крови и пробе сыворотки крови составл ет 37,9± ±0,9 нг/мл и 38,1Ј1,0 нг/мл.

Дл доказательства оптимальности концентрации казеина в промывочном растворе (0,5 мг/мл) используют ре- эультаты измерений холостого опыта. Этот опыт представл ет собой измерение оптической плотности окрашенного раствора в результате проведени им- муноЛерментного анализа в отсутствии миоглобина. Из табл. 4 видно, что опсубстрата пероксидазной реакции и регистрацию изменени оптической плотности раствора, отличаю щий- с тем, что, с целью повышени точности способа, исследуемую пробу

предварительно смешивают с растиором формальдегида до его конечной концентрации 3 мг/мл и инкубируют в течение 1 ч при 30 С, диализуют и добавл ют

к сорбированным на твердой фазе антителам к миоглобнну, а отмывку твердой фазы осуществл ют раствором казеина с концентра иен 0,5 мг/мл.

фор мл

Таблица 1

Оптическа плотность раствора при 49Г. нм дл концентрации миоглобина 80 нг/мл, отн.ед.

0,68

0,97

1,16

0,84

0,86

0,78

Т а б л и ц л 3

Оптическа плотность раствора при 49Л нм дл концентрации миоглобина 80 нг/мл, отн. ед.

,53 ,51 ,54 ,85 ,60

,38

Таблица2

Таблица

Концентраци -казеина , в промывочном растворе,- мг/мл

Оптическа плотность раствора в холостом oiTbtve при 492 нм, отн.ед.

0

М

о,з

0,5 0,7 0,9

0,45

0,31

0,20

0,19

0,19