SU1698285A1

SU1698285A1 - Method to conserve recombinant pseudomonas species strain of @@@-interferon producent

Info

Publication number: SU1698285A1
Application number: SU894678191A
Authority: SU
Inventors: Юрате Ионо Римкявичене; Кястутис Ляоно Вилутис; Эгидиюс-Владас Владо Башкис; Владас-Альгирдас Владо Бумялис; Саулюс Ленгино Григишкис; Эугениюс-Арвидас Андряус Янулайтис; Станиславас-Брониславас Александро Пунтежис
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии
Priority date: 1989-04-11
Filing date: 1989-04-11
Publication date: 1991-12-15

Description

Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано дл хранени генноинженерных штаммов.The invention relates to biotechnology and can be used to store genetically engineered strains.

Цель изобретени - повышение выход а а-2 интерферона.The purpose of the invention is to increase the yield of a-2 interferon.

Сущность изобретени заключаетс в том; что дл продуцентов а-2 интерферона - рекомбинантных штаммов Pseudomonas species, есть оптимальна точка консервации культур - 15-30 мин после достижени максимальной скорости роста дл длительного хранени в жидкой среде с 15%-ным глицерином и антибиотиками в замороженном состо нии при (-70)-(-196)°С, способствующа .повышению выхода рекомбинантного интерферона а-2 в последующих фер- ментаци х.The essence of the invention is; that for a-2 interferon producers - recombinant strains of Pseudomonas species, there is an optimal point of preservation of cultures - 15-30 min after reaching the maximum growth rate for long-term storage in a liquid medium with 15% glycerol and antibiotics in a frozen state (-70 ) - (- 196) ° С, contributing to an increase in the yield of recombinant interferon a-2 in subsequent fermentations.

П р и м е р 1. Приготавливают дл ферментера Biostat E фирмы В.Вгаиш Melsungen емкостью 13,7 л с рабочим объемом 10 л питательную среду (10 л) следующего состава, г/л: гидролизат казеина (ФС-42-632-72 МРТУ 42) 120 мл/л; гидро- лизат пекарских дрожжей 5; калий фосфорнокислый деузамещенный трехводный 1,5; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,6; аммоний сернокислый 3; натрий хлористый 0,5; магний сернокислый семиводный 0,25; кальций хлористый 0,011; тетрациклин 0,05; стрептомицин 0,15.PRI me R 1. Prepared for fermenter Biostat E firm V.Vgaish Melsungen with a capacity of 13.7 l with a working volume of 10 l nutrient medium (10 l) of the following composition, g / l: casein hydrolyzate (FS-42-632- 72 MRTU 42) 120 ml / l; Baker's yeast hydrolyzate 5; potassium phosphate disubstituted three-water 1.5; potassium phosphate monosubstituted 0.6; ammonium sulfate 3; sodium chloride 0.5; semi-magnesium sulfate magnesium 0.25; calcium chloride 0,011; tetracycline 0.05; streptomycin 0.15.

юYu

|оо| oo

СПSP

1 л этой среды разливают в 4x250 кача- лочные колбы и засевают (по 1 л) жидкоза- консервированной культурой Pseudomonas species, несущей плазмиду pVG-З (штамм депонирован во Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики). Колбы помещают на 20-22 ч в термостатирующие качалки при 30-35°С. Полученным инокул - том засевают ферменту.1 l of this medium is poured into 4x250 pumping flasks and seeded (1 l each) with liquid-canned culture of Pseudomonas species carrying the plasmid pVG-3 (the strain was deposited at the All-Union Research Institute of Genetics). The flasks are placed for 20-22 hours in a thermostatic rocking chair at 30-35 ° C. The resulting inoculum is seeded with the enzyme.

Ферментацию провод т при 3Q-35°C, рН среды поддерживают автоматически на уровне 7,0-7,1, пеногашение на уровне датчика , р02 измен ют по Динамике роста от 40 до 70% до насыщени .Fermentation is carried out at 3Q-35 ° C, the pH of the medium is automatically maintained at 7.0-7.1, defoaming at the level of the sensor, p02 is changed according to the growth dynamics from 40 to 70% to saturation.

Каждые 30 мин берут пробы дл измерени оптической плотности и определени скорости роста клетокSamples are taken every 30 min to measure optical density and determine cell growth rate.

V(k)V (k)

X(k)-X(k-i) t(k)-t(k-i)X (k) -X (k-i) t (k) -t (k-i)

где Х(к), Х(к-1) - оптическа плотность в моменты времени.where X (k), X (k-1) is the optical density at times.

Полученное значение скорости роста бактерий V(k) сравнивают с предыдущим значением V(k-i). Спуст 15-30 мин после удовлетворени условию V(k) - V(M) 0 культуру готов т к консервированию.The obtained value of the growth rate of bacteria V (k) is compared with the previous value of V (k-i). After 15-30 minutes after satisfying the condition V (k) - V (M) 0, the culture is prepared for canning.

Дл этого в стерильных услови х центрифугируют 400 мл культуральной среды, осадок клеток ресуспендируют в 200 мл свежей среде указанного состава, добавл ют антибиотики и 200 мл стерильного растао- ра глицерина. Полученную суспензию клеток разливают по 1 мл в пластмассовые пробирки типа Эппендорф емкостью 1,5 мл. Емкость с пробирками помещают в холодильник глубокого охлаждени при -20°С на 22-24 ч, а потом перемещают в кельвинатор и хран т при температуре (-70...75) - (-196)°С в течение 1,5 года.For this purpose, 400 ml of culture medium is centrifuged under sterile conditions, the cell pellet is resuspended in 200 ml of fresh medium of the indicated composition, antibiotics and 200 ml of sterile rastara glycerin are added. The resulting cell suspension is poured into 1 ml of plastic Eppendorf-type tubes with a capacity of 1.5 ml. The container with the tubes is placed in a deep-cooled refrigerator at -20 ° C for 22-24 hours, and then transferred to kelvinator and stored at (-70 ... 75) - (-196) ° C for 1.5 years .

Динамику биосинтеза рекомбинантно- го а-2 интерферона определ ют иммунным методом.The dynamics of recombinant a-2 interferon biosynthesis is determined by an immune method.

Результаты экспериментальных исследований приведены в тзбл.1 и.отображены на чертеже, где на графике 5 исходного варианта отмечены цифрами в кружках точки консервировани . Консерванты, полученные в этих точках, были использованы дл The results of experimental studies are shown in tsbl.1 and shown in the drawing, where in chart 5 of the initial version are marked with numbers in circles canning points. Preservatives obtained at these points were used for

осуществлени четырех ферментации, которые в табл.1 обозначены соответствующими вариантами.the implementation of four fermentation, which in table 1 are denoted by the corresponding options.

Из экспериментальных данных, представленных на чертеже и в табл.1, следует, что по сравнению с исходной ферментацией в последующих ферментаци х 1-4 биосинтетические свойства повышаютс . Во 2-м варианте, где консерваци осуществле0 на при максимальной скорости роста, выход продукта повышаетс на 7%, а в 3-м варианте , где консерваци произведена через 30 ммн после достижений максимальной скорости роста, - на 20%,From the experimental data shown in the drawing and in Table 1, it follows that, compared with the initial fermentation, in subsequent fermentations 1-4, the biosynthetic properties increase. In the 2nd variant, where the preservation was carried out at the maximum growth rate, the yield of the product increased by 7%, and in the 3rd variant, where the preservation was made 30 mmn after reaching the maximum growth rate, by 20%,

5 П р и м е р 2. Результаты обработки экспериментальных данных, приведенные в табл.2, показывают, «то предлагаемый способ консервации рекомбинантного штамма Pseudomonas species VG-84 - лро0 дуцентаа-2 интерферона, позвол ет повысить выход продукта по сравнению с известным в 1,74 раза.5 PRI mme R 2. The results of processing the experimental data given in Table 2 show that “the proposed method of preserving the recombinant strain Pseudomonas species VG-84 — interferon-2 disinfecta-2”, improves the yield of the product in comparison with the known 1.74 times.

Предлагаемый способ пригоден дл других штаммов Pseudomonas sp.- проду5 центов рекомбинантного интерферона (2-2. э именно штэмм ауксотроф по аденину, другие два - по треонину. Каждый штамм обла- дает специфически обработанными плазмидами. Активность рекомбинантногоThe proposed method is suitable for other strains of Pseudomonas sp. - products of recombinant interferon (2-2. E, namely, ammotroph auxotroph for adenine, the other two for threonine. Each strain has specifically treated plasmids. Recombinant activity

0 интерферона а -2 в ферментаци х, засе нных культурами законсервированными по предлагаемому способу, повышаетс в о 0,5-1.74 раза по сравнению с известным способом.0 of interferon a -2 in fermentations cultured with mothballed by the proposed method, increases by about 0.5-1.74 times as compared with the known method.

5five

Claims

The invention The method of preserving the recombinant strain of Pseudomonas species-

0 a-2 interferon producer, which provides for the separation of freshly grown cells by centrifuging them, resuspending the precipitate in fresh medium with glycerin and antibiotics, preserving in glass or paste-ampoules and storing at - (70) - (-196) ° С , characterized in that, in order to increase the yield of interferon, preservation takes place 15-30 minutes after

0 as the growth rate reaches its maximum value.

Table 1

Noting out. t is time;

X is the concentration of microorganisms (bacteria); V is the growth rate of bacteria ;, INF is the concentration of interferon.

Just one day

table 2

a INF

i (f№ / A

5h

0

418

ten

12

14WIB

Rel. wholesale