SU1686372A1 - Способ определени активности рецепторов нейтрофилов человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к медицине, преимущественно к иммунологии, и может быть использовано дл  оценки функциональной активности Fc-рецепторов и СЗв рецепторов нейтрофилов человека. Целью изобретени   вл етс  упрощение и ускорение определени . Способ включает подготовку частиц-носителей, св занных с IgG, либо СЗв-фактором комплемента, стимул цию этими частицами нейтрофилов, наход щихс  в составе разведенной крови, в соотношении 1:50-1-: 150 и оценку функциональной активности Fc-рецепторов и СЗв- рецепторов нейтрофилов по интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции. Способ позвол ет в несколько раз уменьшить объем исследуемой крови, исключить сложные предварительные процедуры обработки крови, сократить в 2-2,5 раза врем  определени .

Description

СО

с

Изобретение относитс  к области медицины , преимущественно к иммунологии, и может быть использовано в качестве дополнительного теста при оценке эффекторных свойств нейтрофилов.

Целью изобретени   вл етс  упрощение и ускорение определени .

В качестве носител  IgG используют убитые бактериальные клетки Staphylococcus aureus, штамм 141, либо пептидогликан Staphylococcus aureus, штамм 885.

Суточную культуру Staphylococcus aureus, штамм 141, выращенную на м со - пептонном агаре, трижды отмывают стерильным физиологическим раствором, прогревают 30 мин при +80°С, довод т концентрацию до 20 млрд. бакт. клеток/мл и хран т при +4°С (срок хранени  до 12 мес.).

Пептидогликан получают из клеточных стенокStaphyloccucus aureus, штамм885 по методу Peterson et at.( Peterson P.P., Wilkinson B.I., Kim Y. et al. The Key cole of peptidoglycan in the opsonisatlort of S. aureus. - I.CIIn.Twest. - 1978. - № 61. - p. 597-609). Суточную культуру бактерий, выращенную на м сопептинном агаре, трижды отмывают дистиллированной водой, взвешивают в физиологическом растворе в концентрации 200 млрд бакт. клеток/мл и разрушают в гомогенизаторе Л-17 К 33 МИ стекл нными бусами диаметром 0,7 мм (20 мин при 0°С, 1000 оборотов/мин).После трехкратного отмывани  дистиллированной водой и удалени  неразрушенных клеток (дифференциальное центрифугирование при 4000 g в течение 10 мин) клеточные

О 00

с

со

VJ

го

стенки ресуспендируют в 100 мл 2%-ного раствора додецилсульфата натри  (Serva, США) и инкубируют 18ч при комнатной температуре . Осадок четырехкратно отмывают при 8000 g в течение 15 мин, взвешивают в 100 мл 0,05 М трмс-НОбуфера (рН 7,4). содержащего 0,005 М MgCIa, добавл ют 20 мкг/мл РНК-азы (Reanal, ВНР), 20 мкг/мп ДНК-азы { Реахим, СССР), инкубируют 60 мин при +37°С, затем внос т 200 мкг/мл трипсина (Spopha, ЧСФР) и продолжают инкубацию еще 4 ч при 37°С. Клеточные стенки отмывают трижды при 8000 д по 15 мин. Осадок ресуспендируют в 5 мл дистиллированной воды, добавл ют равный объем 80%-ного раствора фенола и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. После трехкратного отмывани  (8000 д, 15 мин) осадок ресуспендируют в 5 мл дистиллированной воды, внос т 5 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и инкубируют 90 мин при +60°С. Затем пептидогликан отмывают дистиллированной водой до рН 6,0 м взвешивают в растворе Хенкса до концентрации 100 мгк/мл,

Фракцию IgG выдел ют из коммерческого иммуноглобулина путем хроматографии на ДЭАЭ-то поле(Тоуо Soda, Япони ) при помощи элюции 0,01 М фосфатным буфером , рН 6,5. Опсонизацию объектов-но- ситвлей (конечна  концентраци  стафилококка-5 млрд. бактерий/мл, пепти- догликана - 10 мгк/мл) иммуноглобулинами G (конечна  концентраци  IgG 10 мг/мл) провод т при + 37°С и течение 30 мин, трижды отмывают физиологическим раствором и взвешивают а растворе Хенкса: стафилококки до концентрации 1 млрд/мл, пептидогликан - 10 мкг/мл. Препараты хран т при +40С {срок хранени  3 мес).

В качестве объекта-носител  СЗв-фрак- ции комплемента используют зимозан (Реахим , г. Олайне). Зимозан, св занный с СЗа-фактором комплемента, получают по методике Stossel et al. (Stossel T,P., Field R.i., Gitlin I.D. et al. The opsonic fragment of the thlre component of human complement (C3). - I. Exp. Med. - 1975, v, 141. p. 1329- 1347).

Зимозан взвешивают в физиологическом растворе рН 7,2-7,4 в концентрации 10 мг/мл, прогревают при 100°С в течение 15 мин. После трехкратного отмывани  физиологическим раствором (центрифугирование и;ч/ ЮООд в течение 15 мин) зимозан опсо- низируют пулом сывороток 40 доноров при +37°С з течение 30 мин, трижды отмывают физиологическим раствором (центрифуги- рс анм© при ЮООд п течение 15 мин), взве- шиаают s 2 М растворе NaCI и инкубируют

при +100°С в течение 10 мин; после трехкратного отмывани  препарат довод т раствором Хеикса до концентрации 10 мг/мл. Хран т при +4°С. В качестве контрол  используют зимозэн, обрабатанный пулом сывороток по указанной методике в присутствии 0,01 М этилендиаминтетраацета- тз, т.е. в услови х, исключающих активацию комплемента и св зывание СЗв-фактора с зи0 мозаном.

Периферическую кровь забирают путем укола иглой-скарификатором в м коть дис- тальной фаланги III пальца левой руки в стерильных услови х. Микропипеткой,

5 обработанной гепарином, забирают 0.12 мл крови и развод т ее в 12 мл раствора Хенкса , содержащего 0,1 % желатины. Таким образом получают разведение крови 1:100, Дл  полного исключени  вли ни  опсо0 нических факторов плазмы при оценке функциональной активности Fc - рецепторов нейтрофилов форменные элементы отдел ют от плазмы и ресуспендируют в растворе Хенкса. Дл  этого полученную вышеуказан5 ным способом кровь развод т раствором Хенкса в соотношении 1:50-1:150 центрифугируют 4 мин при 400д, удал ют надоса- дочную жидкость и развод т 100-кратным объемом раствора Хенкса, содержащего

0 0,1 % желатины. Все манипул ции с кровью производ т в дважды силиконированной стекл нной посуде.

Интенсивность люминолзависимой хе- милюминесценции регистрируют на жидко5 стно-сцинтилл ционной счетчика Бета-1 (ПО Медаппаратура, Киев) в течение 30 мин при +37°С. К 1 мл разведенной крови либо форменных элементов, взвешенных в растворе Хенкса, добавл ют 0,1 мл

0 раствора люминола (Реахим, Ереван), инкубируют 15 мин при +37°С дл  стабилизации спонтанной хемилюминесценции. Стимул цию провод т объектами, св занными с IgG либо с СЗв-фактором компле5 мента. Использование в качестве носител  IgG микробных клеток золотистого стафилококка , штамм 141, значительно упрощает получение объекта-носител . Однако, стафилококки , как и любые другие микроорганизмы , относительно неоднородны даже

0 внутри штамма и подвержены изменчивости . В качестве более стандартного носител  IgG можно использовать пептидогликан золотистого стафилококка, штамм 885. Пептидогликан данного штамма имеет хорошо

5 изученную химическую и антигенную структуру и  вл етс  более стандартным объектом дл  использовани  в реакци х с нейтрофилами, но процесс получени  пеп- тидогликана более трудоемок и длителен.

К реакционной взвеси (1 мл разведенной крови с 0,1 мл раствора люмино ла или 1 мл форменных элементов, взвешенных в растворе Хенкса, с 0,1 мл раствора люминола) добавл ют по 0,1 мл взвэси объектов, св занных с IgG или СЗв-фактором (концентраци  lgG-опсонизи- рованного стафилококка и пептидогликана - соответственно500 млн. бакт.клеток/мл и 10 мкг/мл, зимозана - 10 мг/мл). В качестве контрол  используют объекты, не обработан- ные IgG либо СЗв-фактором комплемента (в соответствующих дозировках). Каждую пробу исследуют в трех повторени х. Хемилюми- несценцию измер ют при красном свете. При оценке функциональной активности Fc-pe- цепторов хемилюминесценцию измер ют через 30 мин после внесени  стимул тора, при оценке СЗв-рецепторов - через 10 мин после внесени  стимул тора. Результаты учитывают по разнице между максимальны- ми показател ми хемилюминесценции, индуцированной объектами, св занными с IgG или СЗв, и уровнем хемилюминесценции при стимул ции объектами, необработанными IgG и СЗв, на тех же сроках.

Необходимо оценить функциональную активность Fc-рецепторов и СЗв-рецепторов нейтрофилов периферической крови.

Пример 1. (Выписка из протокола № 102 от 30 марта 1987 года, донор крови - Чекуров А.А., 19 лет). Пор док исследовани : в качестве носител  IgG использовали бактериальные клетки золотистого стафилококка , штамм 141. Дл  этого взвесь убитых прогреванием бактериальных клеток (кон- центраци  - 5 млрд/мл) опсонизировали при 37°С раствором иммуноглобулина G (конечна  концентраци  -10 мг/мл)(30 мин) трижды отмывали физиологическим раствором и ресуспендировали в растворе Хенкса в концентрации 500 млн. микробных тел/мл. Суспензию зимозана опсонизировали пулом сывороток крови человека при +37°С в течение 30 мин, трижды отмывали физиологическим раствором и ресуспенди- ровали в растворе Хенкса в концентрации 10 мг/мл. 0,12 мл гепаринизированной крови , полученной уколом из пальца, разводили раствором Хенкса, содержащим 0,1% желатины, в соотношении 1:100. В стандар- тные стинцил ционные флаконы вносили по 1 мл разведенной крови и 0.1 мл раствора люминола, инкубировали 15 мин при +37°С. Дл  оценки Fc-рецепторов к реакционной смеси добавл ли 0,1 мл взвеси IgG-on- сонизированного золотистого стафилококка (концентраци  500 млн. бактер.клеток/мл) и измер ли хемилюминесценцию через 30 мин. Дл  оценки СЗв-рецепторов нейтрофилов к

реакционной смеси добавл ли 0,1 мл взвеси СЗв-опсонизированного зимозана (концентраци  210 мг/мл) и измер ли хемилюминесценцию через 10 мин. В качестве контрол  использовали необработанные стафилококки и зимозан в соответствующих дозировках. Каждую пробу делали в трех повторени х.

Результаты: при стимул ции IgG-onco- низированными бактери ми (стафилококками ) хемилюминесценци  составила в среднем (по результатам трех проб) 434865 имп/мин, при стимул ции неопсонизиро- ванным стафилококком - 244 415 имп/мин. При стимул ции СЗв-опсонизированным зимозаном хемилюминесценци  составила 1.200 610 имп/мин, при стимул ции неопсо- низированным зимозаном - 265 435 имп/мин. Заключение: Fc-рецепторы и СЗв- рецепторы нейтрофилов исследуемой крови функционально активны, так как стимул ци  через эти рецепторы вызывает значительное усиление хемилюминесценции.

Пример 2. (Выписка из протокола № 104 от 11 апрел  1987 года, донор - Коныш- кина Т.М.). Пор док исследовани  - тот же.

Результаты: при стимул ции IgG-onco- низированными стафилококками хемилюминесценци  составила 475 562 имп/мин. при стимул ции неопсонизированными стафилококками-221 540 имп/мин При стимул ции СЗв-опсонизированным зимозаном хемилюминесценци  составила 1 544 655 имп/мин, неопсонизированным зимозаном - 187 767 имп/мин. Заключение: Fc-рецепторы и СЗв-рецепторы нейтрофилов исследуемой крови функционально активны, так как стимул ци  через эти рецепторы вызывает значительное усиление хемилюминесценции .

Пример 3. (Выписка из протокола № 118 от 21 10.87 года, донор - больной Сергеев А.А.). Пор док исследовани  - тот же. Результаты: при стимул ции lgG-опсонизи- рованными стафилококками чемилюминес- ценци  составл ла 273 506 имп/мин, при стимул ции неопсонизированными стафилококками - 272 387 имп/мин. При стимул ции СЗв-опсонизированным зимозаном уровень хемилюминесценции составл л 227 981 имп/мин, при стимул ции неопсонизированным зимозаном - 224 749 имп/мин. Заключение: Fc-рецепторы и СЗв-рецепторы нейтрофилов исследуемой крови  вл ютс  функционально неактивными, так как не наблюдаетс  значительной разницы между показател ми хемилюминесценции, инициированной lgG-опсонизированными и неопсонизированными объектами.

Необходимо оценить функциональную активность Fc-рецепторов нейтрофилов.

Пример 4. (ЕЗыпискэ из протоколе № 106 от 14.04.87 года, донор-Чеботарь И.В,). Пор док исследовани : в качестве носител  IgG использовали пептидогликан золотистого стафилококка, шгамм 885. Пептидогликан (конечна  концентраци  10 мгк/мл) опсонизировали раствором иммуноглобулина G (конечна  концентраци  10 мг/мл) при +37 С в течение 30 мин, трижды отмывали физиологическим раствором и ресус- пендировали в растворе Хенкса в концентрации 10 г/мл. Пор док подготовки крови дл  измерени  хемилюминесценции тот же (см. пример 1). К реакционной смеси добавл ли по 0,1 мл взвеси lgG-обработан- ного пептидогликана (концентраци  10 мкг/мл) и измер ли хемилюминесценцию через 30 мин. В качестве контрол  использовали пептидогликан, не обработанный IgG. Результаты: при стимул ции lgG-обра- ботанным пептидогликаном хемилюминес- ценци  составл ла 1 2(3 331 имп/мин, при стимул ции необработанным пептидогликаном - 234 220 имп/мин. Заключение: Fc- рецепторы нейтрофилов исследуемой крови функционально активны, так как наблюдаетс  значительна  разница между показател ми хемилюминесценции при стимул ции lgG-опсонизированным и неопсонизиро- ванным пептидогликаном.

Пример 5. (Выписка из протокола № 116 от 19 июн  1987 года, донор крови - Невм туллин А.Л., 30 лот). Пор док исследовани : 0,12 мл гепарииизированной крови, полученной уколом из пальца, разводили раствором Хенкса в соотношении 1:50, при помощи центрифугиррвани  отдел ли форменные элементы крови от плазмы и ресус- пендировали форменные элементы в 100-кратном объеме (от исходного обьема крови) раствора Хенкса, содержащего 0,1 % желатины. Пор док подготовки полученных форменных элементов до  измерени  хемилюминесценции аналогичен описанному выше (см. пример 1). В качестве объекта-носител  IgG использовали убитые прогреванием бактериальные клетки золотистого

стафилококка (штамм 141). Пор док стимул ции и измерени  хемилюминесценции описан в примере 1. Результаты: при стимул ции lgG-обработанными стафилококками хемилюминесценци  составила 2 368 555

имп/мин, необработанными стафилококками - 407 730 имп/мин. Заключение: Fc-pe- цепторы нейтрофилов исследуемой крови функционально активны, так как наблюдаетс  значительна  разница между показател ми хемилюминесценции, индуцированной lgG-обработанными и необработанными стафилококками.

Claims (1)

1. Таким образом, изобретение позвол ет в несколько раз уменьшить объем исследуемой крови, исключить сложные предварительные процедуры обработки крови, сократить в 2-2,5 раза врем  определени . Формула изобретени  Способ определени  активности рецепторов нейтрофилов человека, включающий забор периферической крови, обработку нейтрофилов специфическими дл  их Fc и СЗв-рецепторов стимул торами, св занными с частицами-носител ми, инкубацию суспензии клеток с последующим измерением люминолзависимой хемилюминесценции по сравнению с контролем, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  и ускорени  определени  используют цельную периферическую кровь при разведении физиологической средой в соотношении 1:50-1:150.

   Штамм S. aureus № 141 со слабыми адгезивными свойствами в отношении нейтрофилов человека депонирован в научно-исследовательском институте стандартизации и контрол  медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича МЗ СССР в  н- варе 1983 г., штамму присвоен № 120.