SU1659474A1 - Method for culture of cow oocytes - Google Patents
Method for culture of cow oocytes Download PDFInfo
- Publication number
- SU1659474A1 SU1659474A1 SU884393657A SU4393657A SU1659474A1 SU 1659474 A1 SU1659474 A1 SU 1659474A1 SU 884393657 A SU884393657 A SU 884393657A SU 4393657 A SU4393657 A SU 4393657A SU 1659474 A1 SU1659474 A1 SU 1659474A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- oocytes
- cells
- cultivation
- degenerated
- mnsb
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к области экспериментальной эмбриологии млекопитающих и биотехнологии. Целью изобретени вл етс повышение созревших ооцитов с неповрежденным генетическим аппаратом. Дл этого культивирование ооцитов осуществл ют одновременно с клетками грануле- зы, в культуральной среде ТС-199 с 20% фетальной сыворотки, использу в качестве полипептидного фактора роста мозговой нитритстимулирующий белок в концентра- ции 100-250 нг/мл. 3 табл.This invention relates to the field of mammalian experimental embryology and biotechnology. The aim of the invention is to enhance matured oocytes with an intact genetic apparatus. For this, the cultivation of oocytes is carried out simultaneously with granulose cells, in a culture medium of TC-199 with 20% fetal serum, using as a polypeptide growth factor a brain nitritostimulating protein at a concentration of 100-250 ng / ml. 3 tab.
Description
Изобретение относитс к области экспериментальной эмбриологии млекопитающих и биотехнологии.This invention relates to the field of mammalian experimental embryology and biotechnology.
Целью изобретени вл етс повышение выхода созревших ооцитов с неповрежденным генетическим аппаратом.The aim of the invention is to increase the yield of matured oocytes with intact genetic apparatus.
Способ состоит в следующем. Из ичников коров путем надреза фолликулоз (не менее 0,5 мм в диаметре) выдел ют ооциты в комплексе с гранулезными клетками и помещают в культуральную среду ТС-199 на растворе Хэнкса с гепарином 2 ед/мл и антибиотиками 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 50 мкг/мл. Промывают ооциты от посторонних клеток в той же среде и помещают во флакончики с теми же компонентами. Затем во флакончики с клетками , наход щимис в культуральной среде, добавл ют20% фетальной сыворотки и мозговой нейритстимулирующий белок в различной концентрации: от 50 до 375 нг/мл. В качестве контрол одновременно в одном опыте берут ооциты и культивируют в той жеThe method consists in the following. Oocytes in a complex with granulosa cells are isolated from the ovaries of cows by incision of folliculoosis (not less than 0.5 mm in diameter) and placed into the culture medium of TC-199 in Hanks solution with 2 U / ml of heparin and antibiotics 100 U / ml of penicillin and streptomycin 50 mcg / ml. Oocytes are washed from foreign cells in the same medium and placed in vials with the same components. Then, 20% of fetal serum and brain neuritis-stimulating protein are added to the flasks with cells in the culture medium in various concentrations: from 50 to 375 ng / ml. As a control, oocytes are taken simultaneously in one experiment and cultured in the same
среде, но только в присутствии 20% фетальной сыворотки без факторов роста. Флакончики с клетками помещают в термостат дл инкубировани при 37°С в атмосфере 5% С02- По мере культивировани в течение 30 ч провод т, цитогенетический анализ ооцитов на разных стади х мейоза, т.е. подсчи- тывают процент созревших и дегенерированных ооцитов. Окрашивание и фиксацию клеток провод т по методу Тарковского .medium, but only in the presence of 20% fetal serum without growth factors. The flasks with the cells are placed in a thermostat for incubation at 37 ° C in an atmosphere of 5% C02. As the cells are cultured for 30 hours, the cytogenetic analysis of oocytes at different stages of meiosis, i.e., is performed. calculate the percentage of matured and degenerate oocytes. Cell staining and fixation was performed according to the Tarkovsky method.
Результаты приведены в табл. 1.The results are shown in Table. one.
Под термином ооциты всегда имеетс в виду комплекс ооцитов с гранулезными клетками. Низкий уровень дегенерации ооцитов свидетельствует о благопри тных услови х культивировани клеток.The term oocytes always refers to a complex of oocytes with granulosa cells. The low level of oocyte degeneration indicates favorable cell culture conditions.
П р и м е р 1. Через 5 ч культивировани ооцитов в среде ТС-199 с добавлением 200 нг/мл МНСБ, большинство клеток, как в опытной так и в контрольной группах (80 и 85,5% соответственно) наход тс на стадии диплотены. Дегенераци в опытной и контслExample 1 After 5 hours of oocyte cultivation in TC-199 medium with the addition of 200 ng / ml ISBR, most cells, both in the experimental and control groups (80 and 85.5%, respectively) are at the stage of diplotenes. Degeneration in trial and control
сwith
ON СЛON SL
2 22 2
рольной группах составл ет статистически недостоверные величины (26,5 и 27,5%),groups is statistically unreliable (26.5 and 27.5%),
П р и м е р 2. 81,2% ооцитов в опытной группе через 10 ч культивировани инициировали мейоз, дегенераци при этом составл ет 28,1 %. В контрольной группе 50% ооцитов на тех же стади х развиваютс , а дегенераци составл ет 30%.Example 2: 81.2% of the oocytes in the experimental group after 10 hours of cultivation initiated meiosis, and the degeneration was 28.1%. In the control group, 50% of the oocytes at the same stages develop, and degeneration is 30%.
П р и м е р 3. Через 15ч культивировани ооциты в опытной группе в основном достигают стадии метафазы I (58,1%), клетки с дегенерированными хромосомами составл ют 22,6 против 24,1% в контроле.Example 3: After 15 hours of culture, the oocytes in the experimental group mainly reach the metaphase I stage (58.1%), the cells with degenerated chromosomes are 22.6 against 24.1% in the control.
Пример 4, 20 ч культивировани ооцитов опытной группы характеризуютс синхронным выходом клеток на стадию те- лофазы - 78,8% и достоверно меньшим числом ооцитов с дегенерированным хромосомным материалом по сравнению с контрольной группой (21,2 против 31,1% в контроле).Example 4, 20 h of cultivation of oocytes of the experimental group are characterized by a synchronous exit of cells to the telophase stage — 78.8% and a significantly smaller number of oocytes with degenerated chromosomal material compared to the control group (21.2 vs. 31.1% in the control).
П р и м е р 5. Более половины ооцитов опытной группы достигают стадии метафазы II через 25 ч культивировани , в контрольной группе их число достигает 22,6%. Продолжает оставатьс достоверной разница между контрольной и опытной группами по выходу ооцитов с дегенерацией хромосом (11.8% в опыте по сравнению с 22,6% в контроле).PRI me R 5. More than half of the oocytes of the experimental group reach the metaphase II stage after 25 h of cultivation, in the control group their number reaches 22.6%. The difference between the control and experimental groups in the output of oocytes with chromosomal degeneration remains significant (11.8% in the experiment compared to 22.6% in the control).
П р и м е р 6. Через 30 ч культивировани 87,9% ооцитов опытной группы наход тс на завершающих стади х развити (телофз- за+метафаза II), в контрольной группе завершают свое созревание 75,7% ооцитов В контрольной группе зафиксирован высокий уровень клеток с признаками хромосомной дегенерации (43,2%), в то врем как в опытной группе уровень дегенерации продолжает оставатьс довольно низким (на уровне исходного состо ни попул ций ооцитов, поставленных на культивирование - 26,8 против 25% дегенерированного хромосомного материала на 0 ч - начало культивировани ). В начале культивировани при выделении ооцитов и в зависимости от техники обработки, чистоты среды и др., часть ооцитов гибнет.EXAMPLE 6 After 30 hours of cultivation, 87.9% of the oocytes of the experimental group are in the final stages of development (telophsis + metaphase II), 75.7% of the oocytes complete their maturation in the control group. In the control group high level of cells with signs of chromosomal degeneration (43.2%), while in the experimental group the level of degeneration continues to remain quite low (at the level of the initial state of oocyte populations set for cultivation - 26.8 against 25% of the degenerated chromosomal material at 0 h - the beginning of the cultiv irovani). At the beginning of cultivation during the isolation of oocytes and, depending on the processing technique, purity of the medium, etc., part of the oocytes die.
Таким образом, как видно из таблицы, через 25-30 ч культивировани с МНСБ ооциты достигают стадии нуклеарного созревани , т.е. более половины ооцитов достигают стадии метафазы II с низким уровнем хромосомной дегенерации (пример 5, 6) по сравнению с контролем. Дегенераци в конце культивировани в опыте примерно в 2 раза ниже, чем в контроле (через 25-30 ч). Данные по определению разницы между количеством дегенериро- ванных ооцитов в начале (на 0 ii) и концеThus, as can be seen from the table, after 25-30 hours of cultivation with the MNSB, the oocytes reach the stage of nuclear maturation, i.e. more than half of the oocytes reach the metaphase II stage with a low level of chromosomal degeneration (example 5, 6) compared with the control. Degeneration at the end of cultivation in the experiment is about 2 times lower than in the control (after 25-30 hours). Data to determine the difference between the number of degenerated oocytes at the beginning (at 0 ii) and the end
культивировани (абсолютный прирост де- генерированных клеток) свидетельствует о том, ню через 30 ч ооциты в 10 раз меньше дегенерируют а присутствии МНСБ (1,8% вcultivation (absolute growth of degenerated cells) suggests that after 30 h, oocytes degenerate 10 times less in the presence of MNSB (1.8%
опыте м 18,2% в контроле).experience m 18.2% in the control).
Если после завершени мейоза, т.е. при достижении ооцитами стадии метафазы I (через 30 ч) оставить ооциты в той же среде культивировани до 60 ч, то наблюдаетс If after completion of meiosis, i.e. when the oocytes reach the metaphase I stage (after 30 h), leave the oocytes in the same culture medium for up to 60 h, then
0 резкое повышение дегенерировакных ооцитов в контроле (без МНСБ) по сравнению с ооцитами в среде, содержащей МНСБ: 75% в контроле и 29,6% в опыте. Этот факт свидетельствует о положитель5 ном вли нии МИСБ на поддержание жизнеспособности клеток ооцитов в культуре.0 a sharp increase in degenerative oocytes in the control (without ISMR) compared with oocytes in a medium containing ISMR: 75% in the control and 29.6% in the experiment. This fact indicates a positive effect of MISB on maintaining the viability of oocyte cells in culture.
МНСБ также оказывает положительное вли ние на выход биологически полноценных (по состо нию хромосом) ооцитов, син0 хрониэацию процесса мейоза, а также позвол ет определить врем , необходимое дл протекани каждой из стадий мейоза. Кроме того, низкий процент дегенерированных ооцитов в присутствии МНСБ свиде5 тельствует также с положительном вли нии МНСБ на культуру ооцитов, на созревание этих клеток.The MNSB also has a positive effect on the release of biologically valuable (according to the state of the chromosome) oocytes, synchronizing the process of meiosis, and also allows you to determine the time required for each of the stages of meiosis to proceed. In addition, a low percentage of degenerated oocytes in the presence of MNSB also testifies to the positive influence of MNSB on the culture of oocytes on the maturation of these cells.
В табл. 2 привод тс данные по результатам культивировани в присутствииIn tab. 2 summarizes the results of cultivation in the presence of
0 МНСБ и без него. В примерах 7 и 8 показаны стадии созревани , процент их созревани (выход созревших ооцитов) и процент деге- нерированных ооцитов (по состо нию хромосом ).0 IOMS and without him. Examples 7 and 8 show the maturation stages, the percentage of their maturation (the yield of mature oocytes) and the percentage of degenerated oocytes (according to the state of the chromosomes).
5 П р и м е р 7, В данном эксперименте через 30 ч культивировани почти все ооциты (88,6%) достигают завершающей стадии мейоза (метафазы II) в присутствии оптимальной концентрации МНСБ, причем с5 EXAMPLE 7 In this experiment, after 30 hours of cultivation, almost all oocytes (88.6%) reach the final stage of meiosis (metaphase II) in the presence of the optimal concentration of MNSB, and
0 низким уровнем дегенерации (в 2,3 раза ниже , чем в контроле: 33,9% в контроле по сравнению с 14,8% в присутствии МНСБ), Следует отметить, что на стадии метафазы ii болыиинст ъо клеток в культуре ооцитов ока5 зываетс в значительной степени синхронизированной , т.е. большинство клеток находитс на стадии метафазы II.0 low level of degeneration (2.3 times lower than in the control: 33.9% in the control compared to 14.8% in the presence of the ISMR). It should be noted that at the metaphase ii stage, most of the cells and cells in the oocyte culture turn out to be largely synchronized, i.e. most cells are in metaphase II stage.
Примере, Применение в качестве добавки в культуральную среду с ооцитамиExample, Use as an additive to the culture medium with oocytes
0 МНСБ приводит к получению высокого процента выхода созревших ооцитов на завер- шающихстади хразвити 0 MNSB results in a high percentage of mature oocytes on the completion stage of development
(телофаза+метафаза II) 95,2%, что на 15,2% выше по сравнению с контролем (7У,6%).(telophase + metaphase II) 95.2%, which is 15.2% higher compared with the control (7U, 6%).
5 Абсолютный прирост дегенерированных клеток в опыте (с МНСБ) примерно в 7 раз ниже, чем в контроле (3% по сравнению с 22,1%).5 The absolute increase in degenerated cells in the experiment (with ISBR) is about 7 times lower than in the control (3% compared to 22.1%).
П р и м е р 9. Мозговой нейритстимули- рующий белок, вли ние которого изучаетс PRI me R 9. Brain neuritis stimulating protein, the effect of which is studied
на модели ооцитов, выделен из мозга крупного рогатого скота, представл ет собой ка- тионный гидрофобный белок с мол.мае. 15000 Д. Биологическа активность МНСБ 5 (нейритостимулирующа ) сохран етс при термокислотной обработке. Белок выделен с помощью кислотной экстракции, ультра- Фильтрации, препаративного электрофореза , хроматографии на гепаринсефарозе. 10on a model of oocytes, isolated from the brain of cattle, is a cationic hydrophobic protein with mol.mae. 15000 D. The biological activity of MLB 5 (neurostimulating) is maintained during thermo-acid treatment. The protein was isolated by acid extraction, ultrafiltration, preparative electrophoresis, and chromatography on heparin sepharose. ten
Таким образом, помещение ооцитов в комплексе с гранулезными клетками в куль- туральную среду, а также добавление туда МНСБ дл улучшени условий культивировани в совокупности с цитогенетическим 15 тестированием хромосомного, аппарата клетки, позвол ет повысить информацию об уровне качества культивировани и повысить качество культивировани .Thus, placing oocytes in a complex with granulosa cells in the culture medium, as well as adding the INSM there to improve the culture conditions in conjunction with cytogenetic testing of the chromosomal, cell machinery, improves information on the quality level of the culture and improves the quality of the culture.
В табл. 3 отражены данные эксперимен- 20 тов по вли нию МНСБ в разной концентрации (50-375 нг/мл) на созревание ооцитов на стади х мейоза. Состо ние ооцитов оценивают по проценту созревани и проценту дегенерации ооцитов. В примерах 10-17 от- 25 ражены данные по вли нию разных концен- траций МНСБ на качество культивировани In tab. 3 shows experimental data on the effect of MNSB in different concentrations (50-375 ng / ml) on the maturation of oocytes at meiosis stages. The state of the oocytes is estimated by the percentage of maturation and the percentage of oocyte degeneration. Examples 10-17 reflect the data on the effect of different concentrations of INSM on the quality of cultivation.
ооцитов.oocytes.
Пример 0. При культивировании ооцитов в среде без МНСБ через 18 ч куль- 30 тивировани 51,8% ооцитов продвигаютс в своем развитии со стадии диплотены на стадии диакинез метафаза I, причем 29,6% клеток имеют признаки дегенерации. Example 0. When cultivating oocytes in an environment without MNSB, after 18 hours of cultivation, 51.8% of the oocytes progress in their development from the diplotene stage at the diakinesis stage of metaphase I, and 29.6% of the cells show signs of degeneration.
Пример. При введении в культу- 35 ральнуюсреду 75 нг/мл МНСБ,40% ооцитов наход тс на стадии диплотены, а в состо нии дегенерации 28,6% клеток.Example. When 75 ng / ml of MNSB is introduced into the culture medium, 40% of the oocytes are in the diplotena stage, and 28.6% of the cells are in a state of degeneration.
П р и м е р 12. Применение МНСБ в концентрации 100 нг/мл обеспечивает 40 94%-ю инициацию мейоза (диакинез+мета- фаэа I) и меньшее количество ооцитов с де- генераци ми хромосом (15,2%).PRI me R 12. The use of MLSB at a concentration of 100 ng / ml provides 40 to 94% initiation of meiosis (diakinesis + metafaea I) and a smaller number of oocytes with chromosome de-generations (15.2%).
П р и м е р 13. При использовании МНСБ в концентрации 150 нг/мл все ооциты через 45 18ч проход т стадию диплотены, а процент дегенерации составл ет 16,2%.EXAMPLE 13: When using the INS at a concentration of 150 ng / ml, all oocytes go through a diplotena stage after 45 hours to 18 hours, and the percentage of degeneration is 16.2%.
П р и м е р 14. 95,1 % ооцитов вступают в стадии диакинеза и метафазы I через 18ч культивировани в среде Т С-199 с добавкой 200 нг/мл МНСБ, причем основна часть 50Example 14: 95.1% of oocytes enter the stages of diakinesis and metaphase I after 18 hours of cultivation in T-199 medium supplemented with 200 ng / ml of MNSB, with the main part 50
клеток находитс на стадии метафазы 1 - 80,5%. Число дегенерированных клеток а среде с фактором роста почти в 2 раза меньше , чем в контрольной группе (14,6% в опыте по сравнению с 29,6% в контроле).cells are at the metaphase 1 stage - 80.5%. The number of degenerated cells in the medium with growth factor is almost 2 times less than in the control group (14.6% in the experiment compared with 29.6% in the control).
П р и м е р 15. 96,3% ооцитов продвигаютс в своем развитии при концентрации МНСБ -250 нг/мл, достигнув стадий диакинеза , метафазы I, анафазы, а количество клеток с дегенерированными хромосомами при этом составл ет 14,8%.EXAMPLE 15 96.3% of oocytes advance in their development at an INS concentration of -250 ng / ml, reaching the stages of diakinesis, metaphase I, anaphase, and the number of cells with degenerated chromosomes is 14.8%.
Пример16. Культивирование ооцитов в присутствии 300 нг/мл МНСБ позвол ет 97,3% ооцитов достичь стадий диакинеза и метафазы I, у 24,3% клеток наблюдаетс дегенераци хромосом, т.е. по выходу ооцитов с признаками дегенерации опытна группа не имеет достоверных различий с контрольной (24,3% против 29,6%).Example 16. Cultivation of oocytes in the presence of 300 ng / ml MNSB allows 97.3% of the oocytes to reach the stages of diakinesis and metaphase I, in 24.3% of the cells chromosome degeneration is observed, i.e. in the output of oocytes with signs of degeneration, the experimental group has no significant differences with the control group (24.3% versus 29.6%).
П р и м е р 17. Культивирование ооцитов в присутствии 375 нг/мл МНСБ уменьшает процент созревших ооцитов и резко увеличивает процент дегенерированных ооцитов 61,8%.PRI me R 17. Cultivation of oocytes in the presence of 375 ng / ml of the ISR reduces the percentage of mature oocytes and dramatically increases the percentage of degenerated oocytes 61.8%.
Таким образом, концентраци МНСБ 200 нг/мл вл етс оптимальной, так как количество дегенерированных клеток составило лишь 14,6%. Следует отметить, что оценка состо ни ооцитов по % созревани и дегенерации независима одна от другой, так как под термином созревани ооцитов имеетс ввиду только нуклеарное созревание , а дегенераци ооцитов оцениваетс по самым разным признакам аномалии мейоза , которые были перечислены ранее.Thus, an MNSB concentration of 200 ng / ml is optimal, since the number of degenerated cells was only 14.6%. It should be noted that the assessment of the state of oocytes in% maturation and degeneration is independent of each other, since the term oocyte maturation refers only to nuclear maturation, and oocyte degeneration is evaluated according to the various signs of meiosis abnormality that were listed earlier.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU884393657A SU1659474A1 (en) | 1988-03-18 | 1988-03-18 | Method for culture of cow oocytes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU884393657A SU1659474A1 (en) | 1988-03-18 | 1988-03-18 | Method for culture of cow oocytes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1659474A1 true SU1659474A1 (en) | 1991-06-30 |
Family
ID=21361802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU884393657A SU1659474A1 (en) | 1988-03-18 | 1988-03-18 | Method for culture of cow oocytes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SU (1) | SU1659474A1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2602448C1 (en) * | 2015-08-25 | 2016-11-20 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных | Method for extracorporeal cultivation of oocytes in cows |
-
1988
- 1988-03-18 SU SU884393657A patent/SU1659474A1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| D. Gospodarowlcz, H. Blaleckl, 1 Endocrinology, 1979. v. 104, № 3, p.p. 757764. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2602448C1 (en) * | 2015-08-25 | 2016-11-20 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных | Method for extracorporeal cultivation of oocytes in cows |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bergmann | Growth and division of single cells of higher plants in vitro | |
| US6255106B1 (en) | Process for simultaneous cultivation of different mammalian cells | |
| Kane | A low molecular weight extract of bovine serum albumin stimulates rabbit blastocyst cell division and expansion in vitro | |
| JPS60500400A (en) | tissue culture medium | |
| Oyeleye et al. | Basics of animal cell culture: Foundation for modern science | |
| Tesařík et al. | Nucleic acid synthesis and development of human male pronucleus | |
| SU927126A3 (en) | Process for producing urokinase | |
| Deusser et al. | Biological sciences: ribosomal proteins: variation of the protein composition in Escherichia coli ribosomes as function of growth rate | |
| ATE67787T1 (en) | METHOD FOR PRODUCING PROTEINS USING INDUCIBLE EXPRESSION SYSTEMS IN IN VIVIVUM-PROPULAR GENETICALLY MODIFIED EUKARYOTIC HOST CELLS. | |
| WILLIAMS et al. | Scanning Electron Microscopy of Cytoskeletal Elements in the Oral Apparatus of Tetrahymena 1 | |
| SU1659474A1 (en) | Method for culture of cow oocytes | |
| US4169761A (en) | Process for the cultivation of viruses | |
| US7229789B1 (en) | Methods and compositions for extracting proteins from cells | |
| Osborn et al. | Cell interactions and actin synthesis in mammalian oocytes | |
| JP3736517B2 (en) | Somatic cell nuclear reprogramming factor | |
| Dyban et al. | The silver-stained NOR and argentophilic nuclear proteins in early mouse embryogenesis: a cytological study | |
| Whitson et al. | Cell culture of mammalian endometrium and synthesis of blastokinin in vitro | |
| CN114807008A (en) | Preparation method and application of tomato leaf protoplast single cell suspension | |
| RU2039816C1 (en) | Preparation for detaching contact-dependent cells from substrate | |
| US3930944A (en) | Urokinase production | |
| US4912200A (en) | Extraction of granulocyte macrophage colony stimulating factor from bacteria | |
| US3170839A (en) | Culture process in vitro placental tissue growth medium | |
| Cheng et al. | Asynchronous cytoplast and karyoplast transplantation reveals that the cytoplasm determines the developmental fate of the nucleus in mouse oocytes | |
| NZ237412A (en) | Electrical stimulation of cell cultures | |
| GB1563284A (en) | Production of mutant of aujeszky's virus |