SU1654338A1 - Питательна среда дл восстановлени после криоконсервации гибридных клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцентов противогриппозных моноклональных антител - Google Patents

Abstract

Изобретение отнаситс  к гибри- домной технологии и могет быть использовано при восстановлении после криоконсервации гибридомних киеток Изобретение относитс  к гибридом- ной технологии и может быть использовано при восстановлении после криоконсервации гибридомных клеток животных Mus nusculus L. Цель изобретени  - повышение выживаемости клеток при сохранении их продуцирующей способности. Пример, В 1 л коммерческой среды RPMI-1640 добавл ют 3,9 мг 2-меркаптоэтанола, 100 мг гентамици- на, 4,76 г HEPES, 292 мг L-глутамина, 200 мл эмбриональной коровьей сывсротживотных Mus musculus L. Цель изобретени  - повышение выживаемости клеток при сохранении их продуцирующей способности. Дл  этого к 1 л базовой среды - модифицированной по Фибиху среде RPMI-1640 кроме стандартных добавок (Hepes 4,76 г/л, L - глута- мина 292,0 мг/л, 2-меркаптоэтанола 3,9 мг/л, гентамнцина 100,0 мг/л, 20% спчоротки эмбриона крови) добавл ют компоненты, г/л: глютамат натри  170- 340; пируват натри  50-100; А1Ф-3 Na 1,0-2,0; HA,T H2-2-Na ,0-4,0; Fe(NO) 0,1-0,2, РН среды ;,2-/,1. На примерах шестичувствительных к замораживанию гибридом показано, что они не вьгчиваыт на известной среде, но ыскивают и восстанавливают антител опродукцию на модифицированной среде . На примере семи других гибридом (менее чувствительных) показано, .что они вьокивают на обоих вариантах сред, но на предлагаемой среде раньше формируют монослой. ки и получают базовую среду (модификаци  по Фибиху). Эту среду эффективно используют дл  реконсервации гибридом , обладаюшлх низкой чувствительностью к криоповреждени м. Дл  повышени  питательных свойств среды при реконсервации гибридом, от- личаюттихс  повышенной чувствительностью к криоповреждени м, в нее дополнительно внос т (на 1 л базовой среды), мг: глютамат натри  170; пируват натри  50; азотнокислое дев ти- водное железо 0,1; АДФ-3-натри  1; о $ (Л о СП -U со со 00

Description

НАД Н.-2-натри  2. После растворени  среду фильтруют и используют дл  восстановлени  замороженных гибридом.

Среду используют следующим об- разом. Клетки реконсервируемой гибри- домы 5/161 хран т в жидком азоте в стекл нных ампулах, среда дл  замораживани : RPMI-1640 43%, 7% диметил- сульфоксида и 50% сыворотки крупного рогатого скота в исходной концентрации 1x10 клетки в 1 мл на ампулу. Клетки размораживают в вод ной бане при 37°С. Непосредственно после оттаи вани , дл  удалени  криопротектора, размороженную суспензию центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин, осадок ресуспендируют в 1,0 мл охлажденной среды RPMI-1640 и провод т подсчет жизнеспособных клеток путем окраши- вани  1%-ным трипановнм синим в камере Гор ева (дол  живых клеток 18%). Затем клетки разбавл ют в известной среде RPMI-1640 н в разработанной среде в равных количествах до конечной концентрации 0,8x105 кл/мл и разливают в 24-луночные пластины с двухдневной культурой макрофагов из брюшной полости мыши. Культивирование провод т при 37°С в атмосфере с 5% С02. На третий день после размораживани  подсчитывают , число клеток в лунках и определ ют коэффициент прироста. Культивирование осуществл ют до формировани  моносло , после чего восстанавли- ваемые клетки перенос т в стекл нные матрасы.

I

Антителопродукцию определ ют по наличию в культуральной среде специфи- ческих иммуноглобулинов в реакции торможени  гемагглютинации или иммунофер ментным методом с эталонными вирусами гриппа А (Виктори ) 3/75.

Полученные результаты показывают, что после оттаивани  клеток гибридомы 5/161, они полностью погибают в известной среде к концу 2 сут культивировани . В разработанной среде клетки размножаютс  до концентрации 1,2 Ч О6 на третий день (т.е. с коэффициентом прироста, равным 15,0). Формирование моносло  наблюдают на 3 день культивировани , восстановленные клетки сохран ют способность к продукции антител. Клетки гибридомы 5/37 с низкой криочувствительностью на данной среде в 2 раэа скорее образуют монослой .

5

д

0

5

Пример 2. Готов т среду в соответствии с примером 1, но к 1л базовой среды добавл ют компоненты, мг: глютамат натри  255; пируват натри  75; железо азотнокислого дев ти- водного 0,15; АДФ-3 натри  1,5; НАД X к натри  3. После стерилизации рН среды 7,2. Эффективность аналогична результатам примера 1.

ПримерЗ. На 1л базовой среды добавл ют компоненты, мг: пируват натри  100; глютамат натри  340; же- лезо азотнокислое дев тиводное 0,2, АДФ-3-натри  2; НАД Н -2-натри  4, После стерилизации и ультрафильтрации рН среды 7,3. Среда эффективна при восстановлении как мало-, так и высокочувствительных к криоповрежде- ни м гибридных клеток.

Таким образом, культивирование реконсервируемых клеток в модифицированной среде RPMI-1640 повышает надежность восстановлени  гибридных клеток с сохранением продукции моно- клональных антител и увеличивает интенсивность размножени  клеток (коэффициент прироста увеличиваетс  от 9,0 до 20,0), а также сокращает сроки формировани  моносло .

Аналогичные результаты получают еще на 11 гибридомах мышей Mus muscu- lus L. П ть из этих гибридом не вы- |живают на известной среде, но выживают и продуцируют монАТ на модифицированной среде. Шесть гибридом восстанавливают на обеих средах, но на модифицированной вдвое быстрее формируют монослой.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Питательна  среда дл  восстановлени  после криоконсервации гибридных клеток животных Mus musculus L. - продуцентов противогриппозных моно- клональных антител, содержаща  модифицированную по Фибиху среду RPMI- 1640, отличающа с  тем, что, с целью повышени  выживаемости клеток при сохранении их продуцирующей способности, она дополнительно содержит глютамат натри , пируват натри , АДФ-3-натри , НАД Н7-2-нат- ри  и железо азотнокислое дев тиводное при следующем количественном соотношении компонентов, мг/л:

   Глютамат натри 1 /0-340

   Пируват натри 50-100

   АДФ-3-натри  1-2

   51654338

   НАД-Hfc-2-натри  2-4Модифицированна 

   Железо азотнокислоепо Фибиху среда

   дев тиводное0,1-0,2 RPMI-16401 л