SU1652336A1 - Защитна среда дл лиофильного высушивани облигатно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микробиологии и может быть использовано при хранении микробных культур в лиофильно высушенном состо нии. Цель изобретени  - повышение выхода жизнеспособных микробных клеток. Среда содержит, г/л: белок молока 1,8-5,5; трис-сол нокислый буфер с рН 6,4 73-91: многоатомный спирт 61-137; бидистиллированна  вода до 1 л. В качестве источника белка молока среда содержит жидкое или сухое порошковое молоко, подвергнутое обезжириванию центрифугированием , а в качестве многоатомного спирта - адонит, сорбит или маннит. Среда обладает универсальностью, так как позвол ет длительно сохран ть в лиофилизированном состо нии микробные клетки независимо от их биохимических особенностей. Допускаетс  хранение лиофилизированных культур без вакуума при комнатной температуре или при высокой остаточной влажности, хот  наилучшие показатели выживаемости достигнуты при хранении под вакуумом при 0-4°С и остаточной влажности 0,5-3,0%. 1 з.п.ф-лы, 2 табл. Ё

Description

Изобретение относитс  к микробиологии и может быть использовано при хранении микробных культур в лиофильно высушенном состо нии.

Цель изобретени  - повышение выхода жизнеспособных микробных клеток.

Защитную среду готов т следующим образом .

Дл  обеспечени  содержани  в среде белка молока 1,8-5,6 г/л берут 150-400 мл обрата или 3,0-8,0 г сухого порошкового молока и довод т бидистиллированной водой до 500 мл. Раствор сухого порошкового молока обезжиривают центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин. Параллельно в 300 мл бидистиллированной воды раствор ют 73-91 г трис-основани  и довод т до рН 6,4 сол ной кислотой плотностью

1,18 г/см3, затем в полученном буфере раствор ют 73-137 г многоатомного спирта и оба раствора раздельно автоклавируют при . 0,6 атм 45-50 мин. После остывани  растворы асептически смешивают в стерильном мерном стакане и довод т до 1 л стерильной бидистиллированной водой. Бактериальную массу получают на плотных или в жидких питательных средах. Анаэробные бактерии выращивают при 37°С в атмосфере 80% азота, 10% водорода и 10% углекислого газа. Защитной средой бактерии смывают с поверхности плотной питательной среды или ресуспёндируют в среде осадки бульонных культур микроорганизмов до конечной концентрации 10 -1011 бактерий в одной пробе (1650-300 мкл). Манипул ции с облигатно анаэробными бактери ми произО

ел го со со

I

вод т в токе газовой смеси дл  выращивани  анаэробных бактерий. Суспензии микроорганизмов внос т в стекл нную ампулу или другой подход щий сосуд и замораживают в смеси этанол - тверда  углекислота в течение 15-20 мин. Замороженные пробы помещают в холодную (минус 20°С и ниже) камеру под вакуум 0,01-0,005 атм на 12-18 ч. По окончании высушивани  проба содержит не более 0,5-3,0% исходного количества воды. После запитывани  ампул под вакуумом культуры пригодны дл  длительного хранени  (1-2 года и более) при 0-4°С без релиофилизации.

П р и м е р 1. Берут белок молока 3,7 г, дл  чего 275 мл обрата довод т до 500 мл бидистиллированной водой. Параллельно в 300 мл бидистиллированной воды из 82 г трис-основани  и сол ной кислоты плотностью 1,18 г/см готов т трис-сол нокислый буфер с рН 6,4, в котором раствор ют 96 г адонита. Растворы автоклавируют раздельно при 0,6 атм 45-50 мин. После остывани  растворы асептически сливают в стерильном мерном стакане и довод т объем до 1 л стерильной бидистиллированной водой. Полученным раствором смывают с плотных питательных сред культуры микроорганизмов так, чтобы в 150-300 мкл суспензии содержалось не менее 109-1011 бактерий. Из полученной суспензии готов т 10-кратные разведени  в свежерегенерированном цистеин-рингеровском растворе и высевают на соответствующие плотные питательные среды дл  определени  количества живых клеток до лиофилизации. Остальное количество суспензии распредел ют по 100-300 мкл в стекл нные ампулы, взвешивают дл  определени  среднего веса ампул дл  каждой культуры и замораживают ампулы в смеси этанол - тверда  углекислота в течение 20 мин. Замороженные пробы помещают под вакуум 0,01-0,005 атм при минус 20°С и ниже на 16 ч. Высушенные ампулы взвешивают вновь, определ   остаточную влажность как разность между средним весом ампул до лиофилизации и после нее. Ампулы запаивают под вакуумом и хран т при . Остаточна  влажность проб не превышает 0,5-3,0%. Результаты представлены в табл.1.

П р и м е р 2. Берут белок молока 1,8 г, дл  чего 3,0 г сухого порошкового молока развод т в 500 мл бидистиллированной воды и центрифугируют при 5000 д, затем удал ют скопившийс  сверху жир, сохран   вод ную фазу. Параллельно в 300 мл бидистиллированной воды из 73 г трис-основани  и сол ной кислоты плотностью 1,18 г/см3 готов т трис-сол нокислый буфер с

рН 6,4, в котором раствор ют 73 г маннита. Оба раствора стерилизуют раздельно при 0,6 атм в течение 50 мин. Далее все манипул ции осуществл ют согласно примеру 1. Остаточна  влажность проб при этом не превышает 0,5-3,0%.

П р и м е р 3. Берут белок молока 5,6 г, дл  чего 400 мл обрата довод т бидистиллированной водой до 500 мл. Параллельно в 300 мл бидистиллированной воды из 91 г трис-основани  и сол ной кислоты плотностью 1,18 г/см готов т трис-сол нокислый буфер с рН 6,4, в котором раствор ют 137 г

сорбита. Оба раствора стерилизуют раздельно при 0,6 атм 45 мин. Далее все манипул ции осуществл ют согласно примеру 1. В указанных услови х выживаемость культур отличаетс  от значений по примеру 1 не

более чем в 10 раз дл  каждой высушенной культуры соответственно. Остаточна  влажность проб не превышает 0,5-0,3%.

В табл.1 показан видовой спектр обли- гатно анаэробных и микроаэрофильных бактерий .лиофильно высушенных в предлагаемой защитной среде.

В табл.2 показано вли ние состава защитной среды на выживаемость анаэробных и микроаэрофильных бактерий после 12

мес хранени  при 0-4°С в вакууме.

Из полученных данных следует, что защитна  среда превосходит известные среды по сохранности лиофилизированных

культур облигатно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов, допускает хранение проб под вакуумом при 0-4°С в течение длительного времени без существенного снижени  выживаемости бактерий,

позвол ет упростить процедуру хранени  без утраты лиофилизированных культур при небольших сроках хранени  (от 2 мес до 1 г.), а также обеспечивает хорошую сохранность микроорганизмов различных таксономических групп, включа  облигатно анаэробные бактерии.

Claims (2)

1. Защитна  среда дл  лиофильного высушивани  облигатно анаэробных и

микроаэрофильных микроорганизмов, содержаща  белок молока и бидистиллиро- ванную воду, отличающа с  тем, что. с целью повышени  выхода жизнеспособных микробных клеток, она дополнительно

содержит трис-сол нокислый буфер с рН 6,4 и многоатомный спирт при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

Белок молока1,8-5,6

Трис-сол нокиг.лый

2. Среда по п.1,отличающа с  тем,

Примечание. Культуры хран т под вакуумом при .

Примечание. В числителе дано количество микробных клеток (м.кл) в пробе до лиофилизации; в знаменателе - количество микробных клеток в той же пробе после лиофи- лизации.

Таблица 2