SU1631087A1 - Штамм бактерий СоRYNевастеRIUм меDIоLаNUм, используемый дл трансформации свободных или ацилированных 3 @ -окси- @ -стероидов в 3-кето- @ -стероиды - Google Patents

Description

1

(21)4674646/13

(22)21.02.89

(46) 28.02.91. Виол. № 8 (71)Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Научно-исследовательский институт лекарственных средств и Химико-фармацевтический комбинат Акрихин

(72)В.Н.Крылов, А.С.Яненко, Е.В.Фрейзон, В.З.Ахверд н, Б.И.Демченко, В.И.Тропика, Н.И.Кис- ленко, Н.В. Домрачев, А.НЛ; маков, Е.М.Вайсман, Г.И.Коновалова,

В.В.Козельский, Т.В.Черв к и Э.Ф.Ум- нова

(53) 576.8:577.17.02(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР R- 578334, кп. С 12 Р 33/00, 1976.

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ CORYNEBACTERIUM MEDIOLANUM, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ СВОБОДНЫХ ИЛИ АЦИЛИРОВАННЫХ 3 $-ОКСИ &5-СТЕРОИЛОВ В 3-KETO-Af- СТ ЕРО ИДЫ

(57) Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к микробиологической трансформации стероидов. Цель изобретени  - с тздание штамма, устойчивого к фагу РСМ. Птамм получен путем многоступенчатой селекции на устойчивость к бактериофаг-у РСМ из штамма-прототипа Corynebacterium mediolanum B-964 и депонирован под номером ВКШ N В-4657. Штамм хорошо растет на производственных средах, устойчив к бактериофагу РСМ в концентрации 10 ч/мл, активно трансформирует стероидный субстрат. Выход целевого продукта составл ет 77-88,23% от внесенного стероида.

с

S

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к микробиологической трансформации стероидов.

Цель изобретени  - создание штамма , устойчивого к фагу РСМ.

Штамм Corynebacterium mediolanum СМ-А311 получен путем многоступенчатой селекции на устойчивость к фагу РСМ из штамма С.mediolanum B-964. Штамм СМ-А311 депонирован под номером ВКПМ № В-4657 и характеризуетс  следующими признаками.

Культурально-мор- фологические признаки .

Молодые клетки палочки размером 0,3-0,4x1,6-1,8 мкм, изредка соединенные концами. Старые клетки пред ставл ют собой кокки размером 0,4- 0,5x0,5-0,65 мкмо Спор не образует, неподвижные.

М сопептонный агар На 3-й сутки уоста при 30°С штамм образует круглые колонии диаметром 3-5 мм с ровными кра ми, форма выпукла , конусообразна  с выраженной вершиной, цвета слоновой кости при выдерживании в темноте и лимонно-желтого цвета на свету, пигмента в среду не выдел ет, консистенци  маслообразна , суспензи  в воде равномерна .

Агаризованна  среда СМ-6, Д-глюко- за 3 г, дрожжевой автолизат 6 г, К2НР04 1,8 г, Na HP04x 12 Н40 4 г,

Ф

00

00

NaCl 2 г, дистиллированна  вода по

1 л, агар 15 г, рН 7,3-7,4, рост анЛотичен росту на МНа.

Агаризованна  среда Хоттингера: рост штамма аналогичен росту на МПА.

Физиолого-биохим и ческие свойства.

Молодые клетки грамотрицательные, старые клетки грамположительные. Аэроб дл  оптимального роста требует интенсивной аэрации.

Рост культуры происходит в интервале температур от 20 до 37 С, в интервале рН от 5,5 до 9,5, Оптималь- ный рост культуры происходит при 33 С. Культура хорошо растет при рН 6,8-7,2, оптимум рН составл ет 7,0.

Отношение к источникам азота: усваивает азот в форме мочевины, сульфата аммони , аргинина.

Отношение к источникам углерода; ассимилирует глюкозу, сахарозу, ксилозу , манозу, арабинозу,

Фагоустойчивость: в присутствии 10 частиц фага нормально развиваетс  и осуществл ет процесс трансформации .

Штамм хран т в лиосЬнлизированном состо нии в течение 1 г.

Использование штамма СМ-А311 иллюстрируетс  следукнцими примерами „

Пример 1. Использование штамма C.mediolanum CM-A311 дл  трансформации моноацетата вещества R в вещество S Рейхштейна в присут- ствии фага РСМ.

Трансформационную активность СМ-А311 оценивают в сравнении со штаммом-прототипом в одинаковых услови х. Дл  получени  рабочих культур оба штамма, хран щихс  в лиофильно-высушенном состо нии, вы- рашивают стерильно в течение двух пассажей по 30 ч при Т 33 С в пробирках на скошенных столбиках агари- зованной питательной среды PS (пептон 4,5 г, дрожжевой экстракт 3 г, гидролизат казеина 4 г, м сопептон- ный Ьульон 150 мл, глюкоза 1 г5 агар 0,20 г, вода до 1 л, рН 6,9-7,0). Затем осуществл ют в стерильных услови х накопление посевного материала в конических колбах объемом 50,0 мл со 100 мл жидкой питательной среды СМ 6. Дл  этого рабочую культу ру с поверхности скошенных столбиков агаризованной среды PS смывают 5 мл физиологического раствора и по 055 м полученной суспензии засевают СМ-6

0

Q

Q

5

0 5

5

0

5

в двух колбах, в которых выра-цивают i генерацию культур в течение 24 ч при на круговой качалке с 220 об/мин..Полученную культуру в количестве 0,6% используют в качестве посевного материала дл  выращивани  II генерации культур на среде СМ-6 в аналогичных услови х,

Полученную культуру в количестве 7,5% (объемных) используют дл  выра- гаивани  трансформационной культуры в колбах объемом 500 мл со 100 мл питательной среды ВК-4К (кукурузный экстракт 8 r/jijNa HPO. x 12 HgO 4,65 г/л, 1 г/л, рН 7,1) при 33 С в течение 16 ч и параллельно в лабораторных ферментерах с 5 л питательной среды ВК-4К в присутствии индуктора, в качестве которого используют 0,1 г/л стероидного субстрата в тех же услови х. В колбы параллельно с культурой добавл ют фаг РСМ в конечной концентрации 1,5x10 ч./мл (в качестве контрол  в одну из колб со штаммом-про отипом фаг не добавл ют ) . Контроль за ростом культур осуществл ют по изменению рН и оптической плотности культуральной жидкости (предварительно разведенной в 10 раз)„

Дл  проведени  трансформации стероидный субстрат, предварительно размельченный до размеров частиц 5-15 мкм, внос т по 250 мг (5 г/л) в колбы и по 50 г (10 г/л) в ферментеры . В колбу со штаммом-прототипом, выращенным в присутствии фага РСМ, стероид не внос т, так как культура полностью лизирована с образованием фага в концентрации 10 ч./мл. Трансформацию провод т в тех же услови х, что и выращивание культур под контролем процесса трансформации.

Содержание целевого продукта в культуральной жидкости при использовании штамма CM-АЗ 11 в присутствии фага РСМ составл ет 4,27 г/л (выход 85,4% от загруженного MAR), а при использовании штамма-прототипа в отсутствии фага - 4,23 г/л (84,6%), так как в присутствии фага штамм- прототип лизируетс  полностью.

Процесс трансформации заканчиваетс  через 13 ч как у штамма СМ-А3.11, так и у „штамма-прототипа. Выход конечного продукта при использовании штамма СМ-А311 составл ет 38,20 г вещества Рейхштейна (76,4% от загру-

51

женного субстрата), а при использовании штамма-прототипа - 38,05 г (76,1% от загруженного субстрата).

При использовании СМ-А311; удельный показатель поглощени  при длине волны 241 нм составл ет 458,5; т.пл. 211°С, потери в весе при высушивании 0,25%; хроматографическа  чистота меньше 1% примесей (под УФ) и следовые количества (при опрыскивани хроматограмм серной кислотой).

При использовании штамма-прототипа В-954: Е °М467,7, т.пл. 209°С, потер  в весе при высушивании 0,35%, хроматографическа  чистота 1% примесей (под УФ) и следовые количества (при опрыскивании хроматограмт. серной кислотой).

Пример 2. Использование штамма C.mediolanum CM-A311 дл  трансформации вещества R в вещество S Рейхштейна в присутствии фага РСМ.

Трансформационную активность штамма.СМ-A311 оценивают в сравнении со штаммом-прототипом. Выращивание культур и процесс трансформации.осуществл ют так же, как описано в примере 1. В качестве субстрата используют вещество R Рейхштейна (5-прег- нен-3{3, 1706, 21-триол-20она). Загрузку вещества R производ т в концентрации 4 г/л культуральной жидкости в

76

виде водной суспензии. Добавление фага РСМ производ т в колбы до конечной концентрации 1 ,5x10 ч/мл аналогично тому, как описано в примере 1. Трансформаци  проходит полностью за 10 ч, как в случае штамма СМ-А311, так и в случае штамма-прототипа в отсутствии фага РСМ-15,5 г (77,2% от загруженного вещества R)f В случае выращивани  штамма-прототипа в при- . сутствии фага РСМ наблюдаетс  полный лизис культуры.

Claims (1)

1. Таким образом, штамм-трансформатор СМ-АЗ 11 СВКПМ В-4657), сохран   высокую трансформационную активность как по времени трансформации, так и по выходу целевого продукта, ус- тойчив к фагу РСМ, выделенному в производственных услови х, что позвол ет сократить число фаголизисных операций, приводит к экономии сырь ,, электроэнергии, трудозатрат. Использование штамма обеспечивает стабильность и рентабельность производственного процесса. Формула изобрете.ни 

   Штамм бактерий Corynebacterium mediolanum ВКПМ № Ь-4657. используемый дл  трансформации свободных или ацилированных ЗЙ-окси-Д -стеро- идов в 3-кето-А -стероиды.