SU1479510A1

SU1479510A1 - Strain of hybrid cultivated cells of mus musculus as producer of monoclonal antibodies to hemagglutinine of a-influenza virus

Info

Publication number: SU1479510A1
Application number: SU874307632A
Authority: SU
Inventors: Игорь Александрович Попов; Александр Викторович Червонский; Юрий Семенович Кривошеин; Юрий Леонидович Криворутченко
Original assignee: Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР; Крымский Медицинский Институт
Priority date: 1987-07-23
Filing date: 1987-07-23
Publication date: 1989-05-15

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии, а именно к медицинской вирусологии. Целью изобретени вл етс получение гибридомного культивируемого штамма клеток, продуцирующего моноклональные мышиные антитела к гемагглютинину - поверхностному гликопротеину вируса гриппа А /Ленинград/ 385/80 (H3N2). Дл этого сливают клетки мышиной миеломы Х63-AQ 8-653 с клетками селезенки мышей, иммунизированных препаратом гемагглютинина вируса гриппа А /Ленинград/ 385/80 (H3N2). Полученный штамм культивируемых гибридных клеток имеет стабильные характеристики и депонирован в коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) 157Д. Продуцируемые им моноклональные антитела обладают высокой специфичностью, взаимодейству только с штаммом вируса гриппа А/Ленинград/ 385/80 и не реагиру с другими штаммами вируса гриппа, относ щимис к типу H3N2. 1 ТАБЛ.This invention relates to biotechnology, namely medical virology. The aim of the invention is to obtain a hybridoma cultured cell strain producing monoclonal mouse antibodies to hemagglutinin, a surface glycoprotein of influenza A / Leningrad / 385/80 (H3N2). To do this, merge the cells of the mouse myeloma X63-AQ 8-653 with the spleen cells of mice immunized with the hemagglutinin preparation of influenza A / Leningrad / 385/80 (H3N2). The resulting strain of cultured hybrid cells has stable characteristics and is deposited in the cell culture collection of the Institute of Cytology of the Academy of Sciences of the USSR under the number VSKK (P) 157D. The monoclonal antibodies produced by him have high specificity, interact only with the influenza A / Leningrad / 385/80 strain and do not react with other H3N2 type strains of the influenza virus. 1 TABLE

Description

Изобретение относитс к биотехнологии , а точнее к медицинской вирусологии .This invention relates to biotechnology, and more specifically to medical virology.

, Цель изобретени - получение гиб- ридомного культивируемого штамма клеток , продуцирующего моноклональные мышиные антитела к гемагглютинину - поверхностному гликопротеину вируса гриппа А (Ленинград)385/80 (H3N2).The aim of the invention is to obtain a hybridoma cultured cell strain producing monoclonal mouse antibodies to hemagglutinin, a surface glycoprotein of influenza A virus (Leningrad) 385/80 (H3N2).

Полученный штамм гибридных клеток обозначен АН-РСК-4Н8.The resulting strain of hybrid cells is designated AH-PCK-4N8.

Штамм хранитс в коллекции клеточных культур Института Цитологии АН СССР (Ленинград) под номером 157D.The strain is stored in the cell culture collection of the Institute of Cytology, USSR Academy of Sciences (Leningrad) under the number 157D.

Штамм имеет следующие паспортные характеристики.The strain has the following passport specifications.

Культуральные свойства. Среда дл культивировани - среда RPM1-1640 или минимальна среда Игла в модификации Дальбенко с добавлением 20% эмбриональной тел чьей сыворотки, 2мМ глютамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина; рН 7,4, t 37°С; 5% углекислоты в атмосфере или без углекислоты. Посевна доза 10 клеток в 1 мл. Дл выращивани штамма можно использовать стекл нную или пластиковую культуральную посуду.Cultural properties. The culture medium is RPM1-1640 medium or the minimum Eagle medium in a modification of Dalbenko with the addition of 20% fetal calf serum, 2 mM glutamine, 100 units / ml penicillin and 100 µg / ml streptomycin; pH 7.4, t 37 ° C; 5% carbon dioxide in the atmosphere or without carbon dioxide. Seed dose of 10 cells in 1 ml. Glass or plastic culture dishes can be used to grow the strain.

елate

Ивх&Iwh &

ОABOUT

Во Лпакон объемом 25 см3 засевают 5 ) клеток штамма и 5 мл среды. Провод т пассаж 1 раз в 4 дн той же дозой клеток. Без подсчета клеток 1:3-1:5. Через 3-4 дн концентраци антител л культуральной жидкости достигает 30-40 мкг/мп.5) cells of the strain and 5 ml of medium are seeded in a volume of 25 cm3. The passage was carried out once every 4 days with the same dose of cells. Without counting cells 1: 3-1: 5. After 3-4 days, the concentration of antibodies in the culture fluid reaches 30-40 µg / mp.

Дл выращивани опухоли из штамма используютс мыши линии BAL В/с. Свежим мышам за 5-25 дней до инъекции клеток штамма ввод т внутрибрюшинно 0,5 мл пристава. Клетки штамма инъецируют внутрибрюшинно по 5 х 107 клеток на мышь в 0,5-1,0 мл среды 199. Асцитическую жидкость собирают по мере по влени (на 12-14 день) многократно от живых мышей. Делают не менее трех вз тий от каждого животного, объем асцита 4-6 мл. Концентраци антител в асцитической жидкости 6,0- 7,5 мг/мл, при определении методом торможени радиоиммуиоадсорбции. Из асцита штамм перевиваетс на свежих мышей по 5 х 101 клеток на мышь. BAL B / s mice are used to grow the tumor from the strain. Fresh mice for 5-25 days before the injection of cells of the strain is injected intraperitoneally with 0.5 ml of the bailiff. The cells of the strain are injected intraperitoneally at 5 x 107 cells per mouse in 0.5-1.0 ml of medium 199. Ascitic fluid is collected as it occurs (12-14 days) many times from live mice. At least three doses from each animal should be taken, the volume of ascites 4-6 ml. The concentration of antibodies in ascitic fluid is 6.0-7.5 mg / ml, as determined by the method of inhibition of radio-immune adsorption. From ascites, the strain is transplanted in fresh mice of 5 x 101 cells per mouse.

Кариологическа характеристика. Модальное число хромосом в клетках описываемого гибридомного штамма 78 с областью варьировани от 76 до 86.Karyological characteristic. The modal number of chromosomes in the cells of the described hybridoma strain 78 with a region of variation from 76 to 86.

Продуктивность. Стабильна секре- ци полезного продукта сохран етс до 30 пассажей in vitro с концентрацией антител в культуральной жидкости 30 мкг/мл и до 6 пассажей in vivo с с концентрацией антител в асцитической жидкости 6,0 мг/мл. чProductivity. The stable secretion of the useful product is maintained up to 30 in vitro passages with an antibody concentration in the culture fluid of 30 µg / ml and up to 6 passages in vivo with an antibody concentration in the ascitic fluid of 6.0 mg / ml. h

Контаминаци . Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не вы- влено по окрашиванию красител ми на ДНК и тимидиновой метке в культуральной среде.Contamination Bacteria and fungi in culture were not detected during long-term observation and culture on nutrient media. Infection with mycoplasma was not detected by staining with dyes on DNA and thymidine tag in culture medium.

Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в бычьей сыворотке, содержащей 10% диметилсульфотссида (концентраци клеток 5 клеток (в 1 мл), разливают в пластиковые ампулы при 4°С, помещают с толстостенную коробку из полипеноуретана и выдерживают 24 ч при -70°С, затем клетки перенос т на хранение в жидкий азот. Возможно также программное замораживание со снижением температуры на 1°С в 1 мин до -40°С с последующим перено- сом в жидкий азот.Cryoconservation Cells of the strain are resuspended in bovine serum containing 10% dimethylsulfosside (cell concentration 5 cells (1 ml), poured into plastic ampoules at 4 ° C, placed with a thick-walled polyurethane box and kept for 24 hours at -70 ° C, then the cells are transferred t for storage in liquid nitrogen. It is also possible to programmatically freeze it with a decrease in temperature of 1 ° C per minute to -40 ° C, followed by transfer to liquid nitrogen.

Размораживание осуществл етс в течение 1 мин при 37°С. Клетки развод т в Ю мл среды дл культивироDefrosting is carried out for 1 min at 37 ° C. Cells are diluted in 10 ml of culture medium.

Q 5 0 5Q 5 0 5

0 0

Q Q

г 0g 0

5 five

5five

вани , осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды и перенос т в посуду дл культивировани . Жизнеспособность клеток по включению трипанового синего составл ет 70-80%.The vans are precipitated by centrifugation, resuspended in 5 ml of the same medium, and transferred to culture dishes. The cell viability of trypan blue incorporation is 70-80%.

Характеристика целевого продукта. Моноклональные антитела, продуцируемые штаммом, относ тс к 1q G1 подклассу и св зывают гемагглютинин цельного вируса гриппа А (Ленинград) 385/80(H3N2) и выделенный с помощью детергента дезинтегрон-0. Взаимодействие антител с гемагглютинином вируса гриппа может быть вы влено способом , при котором гемагглютинин используетс в качестве антигена как поверхностный гликопротеин вириона (твердофазный иммуноферментный анализ ) или методом торможени гемагг пго- тинации, использующим МкАТ к гемаг- глютинину в качестве конкурирующего агента.Characteristics of the target product. Monoclonal antibodies produced by the strain belong to the 1q G1 subclass and bind the hemagglutinin of the whole influenza A virus (Leningrad) 385/80 (H3N2) and disintegron-0 detergent. The interaction of antibodies with the hemagglutinin of the influenza virus can be detected by a method in which hemagglutinin is used as an antigen as a virion surface glycoprotein (enzyme-linked immunosorbent assay) or by haemaggic inhibition method using MCAT to hemaglutinin as a competing agent.

Использование штамма АН-РСК-4Н8 иллюстрируетс следующими примерами.The use of strain AN-PCK-4H8 is illustrated by the following examples.

Пример 1. Моноклональные антитела используют в иммуноферментном анализе. Дл этого полихлорвиниловые 96-луночные платы покрывают препаратом гемагглютинина вируса гриппа А (Ленинград)385/80 (H3N2) или вирусными концентратами в забуференном фосфатами изотоническом растворе натри хлорида (ЗФР) в концентрации 30 мкг/мп по 50 мкл на лунку. Спуст 8 ч, лунки промывают в трех сменах ЗФР в течение 10 мин. В дальнейшем отмывают аналогично. Инкубируют везде при комнатной температуре. Свободные валентности платы насыщают в течение одного часа 1%-ным раствором человеческого сывороточного альбумина в ЗФР, после чего лунки отмывают и добавл ют в них культуральную среду от штамма, продуцирующую моноклональное антитело к гемагглютиннну вируса гриппа, по 50 мкл на лунку на 1 ч. Лунки отмывают и инкубируют с кроличьей антисывороткой против иммуноглобулинов мыши, разведенной в 100 раз в ЗФР в течение 1 ч. Избыток антисы- воротки1 отмывают и добавл ют ПАП- реагент на 1ч. ПАП-реагент получают , готов смесь культуральной среды от гибридомы АР - FC -2В4, продуцирующей моноклональное антитело против пероксидазы хрена, с перокси- дазой хрена (конечна концентраци Example 1. Monoclonal antibodies used in the enzyme immunoassay. For this, polyvinyl chloride 96-well plates are coated with the hemagglutinin preparation of influenza A virus (Leningrad) 385/80 (H3N2) or viral concentrates in phosphate buffered isotonic sodium chloride solution (PBS) at a concentration of 30 µg / mp, 50 μl per well. After 8 hours, the wells are washed in three shifts of PBS for 10 minutes. Later washed similarly. Incubate everywhere at room temperature. The free valencies of the plate are saturated for one hour with a 1% solution of human serum albumin in PBS, after which the wells are washed and the culture medium from the strain producing monoclonal antibody to hemagglutinne influenza virus is added to them, 50 µl per well for 1 hour. The wells are washed and incubated with mouse anti-mouse immunoglobulin antiserum diluted 100-fold in PBS for 1 hour. The excess antiserum is washed and the PAP reagent is added for 1 hour. PAP reagent is prepared, a mixture of culture medium from hybridoma AP - FC -2B4 producing monoclonal antibody against horseradish peroxidase, with horseradish peroxidase (final concentration

514514

50 мкг/мп). После удалени избытка ПАП-реагента отмывкой пероксидазную активность вы вл ют добавлением окрашиваемого субстрата по 100 мкл на лунку.50 µg / mp). After removing the excess PAP reagent by washing, the peroxidase activity is revealed by adding the substrate to be stained, 100 µl per well.

Приготовление субстрата. К смеси 5,1 мл 0,2 М Na2liro4 и 4,4 мл 0,1 М лимонной кислоты добавл ют 9,5 мл дистиллированной воды, рН довод т до 5,0 концентрированной ортофосфорной кислотой. В раствор добавл ют 0,04% ортофенилендиамина (Sigma) и 0,05% перекиси водорода. Положительна реакци про вл лась желто-коричневым окрашиванием. Реакцию останавливают через 20 мин концентрированной серной кислотой (по 10 мкл на лунку).Substrate preparation. To a mixture of 5.1 ml of 0.2 M Na2liro4 and 4.4 ml of 0.1 M citric acid was added 9.5 ml of distilled water, the pH was adjusted to 5.0 with concentrated phosphoric acid. 0.04% orthophenylenediamine (Sigma) and 0.05% hydrogen peroxide are added to the solution. A positive reaction was indicated by a yellow-brown stain. The reaction is stopped after 20 minutes with concentrated sulfuric acid (10 μl per well).

Оптическую плотность в каждой лунке оценивают с помощью спектрофото- метра при длине волны 495 им. В контрол вместо моноклональкых антител к гемагглютинину вируса гриппа обработку провод т культуральной средой от миеломной линии с одной стороны и кроличьей сывороткой против вируса гриппа с другой. The optical density in each well is estimated using a spectrophotometer at a wavelength of 495 im. In the control, instead of monoclonal antibodies to the hemagglutinin of the influenza virus, the treatment was carried out with culture medium from the myeloma line on one side and rabbit serum against the influenza virus on the other.

Пример 2. Вместо вирусных антигенов на полихлорвиниловую плату адсорбируют кроличью сыворотку против вируса гриппа А (Ленинград) 385/80 (H3N2), разведённую в 100 раз ЗФР, при комнатной температуре. Спуст 8 ч, ее избыток отмывают, свободные валентности насыщают 1%-ным раствором человеческого сывороточного альбумина в ЗФР, лунки отмывают спуст 1 ч и добавл ют вирусные антигены и другие компоненты, tак описано в примере 1.Example 2. Instead of viral antigens, polyvinyl chloride boards are adsorbed on rabbit serum against influenza A virus (Leningrad) 385/80 (H3N2) diluted 100 times in PBS at room temperature. After 8 hours, its excess is washed, free valencies are saturated with 1% human serum albumin solution in PBS, the wells are washed after 1 hour, and viral antigens and other components are added, as described in Example 1.

П р и м е р 3. Моноклональные антитела к гемагглютинину вируса гриппа используют дл торможени гемаг- глютинации с препаратом гемагглюти- нина А (Ленинград) 385/80 (H3N2) и различными вирусными концентратами в реакции торможени гемагглютинации.PRI me R 3. Monoclonal antibodies to the hemagglutinin of the influenza virus are used to inhibit hemaglutination with the hemagglutinin A preparation (Leningrad) 385/80 (H3N2) and various viral concentrates in the hemagglutination inhibition reaction.

Дл постановки реакции торможени гемагглютинации готов т рабочее разведение антигена, в 50 мкл которого содержитс 4 агглютинирующие единицы (АЕ) вируса. С этой целью исходный антиген развод т изотоническим раствором (ИР) во столько раз, сколько получаетс от делени его гемагглюти- национного титра на 4.For setting the haemagglutination inhibition reaction, a working dilution of the antigen is prepared, 50 µl of which contains 4 agglutination units (AE) of the virus. For this purpose, the initial antigen is diluted with an isotonic solution (IL) as many times as is obtained from dividing its hemagglutination titer by 4.

Перед постановкой основной реакции провер ют, действительно ли в 50 мкл выбранного разведени содержитс Before setting the main reaction, it is checked whether 50 µl of the selected dilution contains

5 five

0 5 0 5

о 0about 0

5 five

0 g 0 g

5five

106106

4 АЕ. Дл этого в 4 лунки разливают по 50 мкл ИР. В первую из них добавл ют 50 мкл рабочего разведени антигена , после смешивани 50 мкл перенос т во вторую лунку, из нее - в третью, затем в четвертую Из четвертой лунки 50 мкл жидкости выпивают. После этого в каждую лунку приливают по 50 мкл ИР и по 100 мкл 1%-ной суспензии эритроцитов курицы. Таким образом , в 1-й лунке содержалось 2 АЕ, во 2-й - 1 АЕ, В 3-й4- 0,5 АЕ и в 4-й - 0,25 АЕ. В п той лунке став т контроль эритроцитов - 100 мкл ИР со 100 мкл 1%-ной суспензии эритроцитов. Реакцию оставл ют на 45 мин при комнатной температуре (до оседани эритроцитов в контроле).4 AE. For this, 50 µl of IR is poured into 4 wells. To the first of these, 50 µl of the working dilution of the antigen is added, after mixing 50 µl is transferred to the second well, from it to the third, then to the fourth. 50 µl of liquid is drunk from the fourth well. After that, 50 μl of IL and 100 μl of 1% chicken erythrocyte suspension are poured into each well. Thus, in the 1st well there were 2 AE, in the 2nd - 1 AE, in the 3rd 4-0.5 AE and in the 4th - 0.25 AE. Erythrocyte control is placed in the fifth well - 100 µl of IL with 100 µl of 1% erythrocyte suspension. The reaction is left for 45 minutes at room temperature (until the erythrocytes settle in the control).

При правильном выборе рабочей дозы антигена (4 АЕ) в 1-й и во 2-й лунках наблюдают полную агглютинацию, в 3-й лунке агглютинаци была частичной или отсутствовала, в 4-й лунке агглютинации не было.With the correct choice of the working dose of antigen (4 AE), complete agglutination is observed in the 1st and 2nd wells, in the 3rd well the agglutination was partial or absent, in the 4th well there was no agglutination.

Готов т двукратные разведени моноклональных антител к гемагглютинину, инактивированных при 566С в течение 30 мин, по 50 мкл на лунку. Количество р дов двукратных разведений моно- клональных антител соответствуют количеству антигенов, к которым тестировали моноклональные антитела.Twofold dilutions of monoclonal antibodies to hemagglutinin, inactivated at 566 C for 30 min, 50 µl per well are prepared. The number of rows of twofold dilutions of monoclonal antibodies correspond to the number of antigens to which monoclonal antibodies were tested.

После того как мококлональные антитела разведены, во все лунки начального р да внос т по 50 мкл рабочего разведени одного из антигенов, во все лунки следующего р да разведений этих же антител по 50 мкл рабочего разведени др. антигена и т.д. Плату оставл ют на 1 ч при комнатной температуре. После этого во все лунки всех р дов вносили по 100 мкл 1%-ной суспензии эритроцитов и оставл ют на 45 мин при комнатной температуре . Титром моноклональных антител считают их последнее разведение, давшее полную задержку гемагглютинации . В контрол х обработку вместо моноклональных антител провод т культуральной средой от миеломной линии и кроличьей сывороткой против вируса гриппа А (Ленинград) 385/80(H3N2).After the mokoclonal antibodies are diluted, 50 µl of the working dilution of one of the antigens are poured into all the wells of the initial row, 50 µl of the working dilution of the other antigen, etc. into each well of the next row of the same antibodies. The plate is left for 1 hour at room temperature. After that, 100 µl of 1% erythrocyte suspension was added to all wells of all rows and left for 45 min at room temperature. The titer of monoclonal antibodies is considered their last dilution, which gave a complete delay of hemagglutination. In controls, the treatment instead of monoclonal antibodies was carried out with the culture medium from the myeloma line and rabbit serum against influenza A virus (Leningrad) 385/80 (H3N2).

Claims

The results of the haemagglutination inhibition reaction are presented in the table. Invention Formula

The strain of hybrid cultured animal cells Mus musculus No. VSKK

No. VSKK (P) 157G - producing monoclonal antibodies to hemagglutinin vi

influenza A virus (Leningrad) 385/80 (H3N2).

Hemagglutinin preparation of influenza A virus (Leningrad) 385/80 / (H3W2)

Influenza A virus (Leningrad) 385/80 (H3N2) Influenza A virus (Chile) 1/83 R2 (H1N1) Influenza A virus (Prague) 1/84 (H2N2)

1000 2000