SU1454855A1 - Способ определени активности термостойких протеолитических ферментов - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к энзимо- логии, в частности к исследованию свойств протеолитических ферментов, и может быть использовано в микробиологической , медицинской, пищевой, кожевенной и кинофотопроььшшенности, а также в сельском хоз йстве. Целью изобретени   вл етс  повьшение чувствительности способа и сокращение времени анализа при определении протеолитической активности. В основе предложенного способа определени  активности протеаз - регистраци  изменений светорассе ни  (светопогт лощени ) в процессе образовани  (Т фаза реакции) и распада (II фаза) агрегатов частично гидролизованных молекул белка. Из экспериментальных данных по измерению интенсивности светорассе ни  в ходе протеолиза активность фермента может быть определена по формуле А kfll: dt k-tgo(, где I - интенсивность рассе нного светового потока в ходе 1 фазы реакции; t - врем ; о( - угол наклона кривой увеличени  интенсивности в ходе реакции к оси абсцисс; k - коэффициент пересчета в соответствующие единицы активности. Изобретение предполагает проведение всей процедуры определени  активности протеазы непосредственно в термостатированной  чейке нефелометра, за счет чего обеспечиваетс  сокращение числа операций в ходе анализа. Кроме того, нефелометрический метод, включенный в способ определени  протеолитической активности, оказываетс  в данном случае более чувствительным , чем широко используеъйгй спектрофотометрический, и не требует длительной инкубации с целью накоплени  определимых концентраций продукта (врем  анализа сокращаетс  в среднем в 3-5 раз). Чувствительность предложенного способа возрастает с повышением температуры реакции, поэтому изобретение целесообразно использовать дл  протеолитических ферментов , обладающих максимальной активностью в интервале температур от 45 до 99°С. 3 ил,, 2 табл. СЛ 00 (У1 ел

Description

Изобретение относитс  к энаимоло- гии, в частности к исследованию свойств протеолитических ферментов, и может быть использовано в микробиологической , медицинской, пищевой, кожевенной и кинофотопромьшшенности, а также в сельском хоз йстве.

Цель изобретени  - повышение чувствительности способа и сокращение времени анализа при определении активности протеолитических ферментов .

На фиг.1 показаны-изменени  оптических характеристик раствора казеина при добавлении протеолитического фермента, момент внесени  протеолитического фермента указан стрелкой; на фиго2 - зависимость междУ протео- литической активностью препарата нейтральной протеиназы Bacillus thekraonon - liquefaciens ТР 1/1 и величиной tgo(; на фиг.З - зависимость протеолитической активности ферментного препарата термолизин и величины tgo(.oT температуры (протео- литическа  активность-н -, величина

tg ai -Xх-}.

Основу предлагаемого способа составл ет регистраци  изменений светорассе ни  (светопоглощени ) в про цессе образовани  (1 фаза реакции) и распада (II Фаза) агрегатов частично гидролизованных молекул Ьелка. Скорость коагул ции продуктов про-- теолиза пропорциональна их концентрации в реакционной смеси, а следовательно , и активности протеазы. Из экспериментальных данных по измере- иию интенсивности светорассе ни  в ходе ферментативного гидролиза белка активность фермента может быть определена по формуле

с

А - К 1 K-tgc/,

де А - протеолитическа  активность вз того дл  анализа количества ферментного препарата

I - интенсивность рассе нного или поглощенного светового потока в ходе 1 фазы реакции (см.фиг.Ог

t - врем ;

4 - угол наклона кривой увеличени  интенсивности во времени к оси абсцисс (см.фиг.1)1 К - коэффициент пересчета в соот- ветствуюдае ад. активности.

5

В отличие от известного способа, где спектрофотометрическому определению продуктов реакции предшеству1от

ее остановка и отделение непрореагировавшего белка фильтрованием или центрифугированием, изобретерме предполагает проведение всей процедуры определени  активности непос0 редственно в термостатированной

 чейке нефелометра, в которую помещают пробирку с раствором субстрата ( 0.25-3%-ный казеш) на буфере с

и г- -. .

0

25

30

CaCl2 , добавл ют исследуемый образец и инкубируют смесь при температуре,, близкой к оптимальной дл  исследуемого фермента. Измерение интенсивности светорассе ни  осуществл етс  в ходе реакции протеолиза. .

Использование изобрете1ш  обеспе- чивает сокрт дение числа операций в процессе огфеделении ферментативной шстивности протсаз.

Кроме тогоJ иефелсшетрический метод в шгучае оказываетс  более чувствительным по сравнению со спектрофотометрическим, т.е. дает возможность определ ть количества продукта, которые не обнаруживаютс  в ана11огнчных услови х по поглощению при 280 нм. Вследствие этого отпадает необходимость в длительной инкубации, преследующей цель накоплени  3 среде достаточной дл  обнаружени  концентрации продукта, и врем  анализа может быть уменьшено в среднем в 3-5 раз

Чувствительность.предлагаемого способа возрастает с повышением температуры реакции, однако при t 99 С измерение оптических характеристик в пробе становитс  невозможным из-за интенсивного образовани  пузырей. Поскольку способ также неэффективен при температурах ниже 45 С, можно заключить, что изобретение обладает положительным эффектом (повьш1еше чувствительности, сокращение времени анализа), дл  протеаз с оптимумом 50 температуры от 45 до 99 С.

П р и м е р 1 . Лд  определеьш  активности нейтральной протеазы, выделенной из культуральной жидкости Bacillus thermononliquefaciens 55 ТР 1/1, готов т 1%-ный раствор казе- ината натри  в 50 мМ трис-НС (рН

35

40

45

iarlcLi а. .f - - -7 0) с 1 мМ СаС, который разливают в пробирки по 2.4 мл. Пробирки помещают в термостатированные  чейки не фелометра и инкубируют при с 0,1 МП раствора фермента в разных разведени х. Измер ют кинетику светорассе ни  в первой фазе реакции. Результаты измерений представлены на фиг.2о Из полученных данных следуеТ; что величина tgc пр но пропорциональна активности фермента,, а величина К ю в дашш1х услови х определени  равна 0,,003.

Примерно Дп  определений активности препарата Протосубтилизин ОХ готов т 1%-иый раствор казеина is в 50 мМ трис-НС буфере (рН 7,0) с 1 мМ CaCl2.o Активность различных разпедеиий препарата определ ют как в примере 1, но инкубацию ведут.при температуре 50 С, Параллельно опреде- 20 л ют активность фермента в анапо- ткчныж уапови х.

Результаты сравнительного анализа представлены в табл. 1 и свидетельст-. вуют о четкой коррел ции между вепичи- 25 ной tgc(и активностью протеазы, опре- ,деленной известным методом и выраженной в соответствующих единицах.

Таблица /

30

BeличJiнa tg « при 50 с

1,,05

1,,06

2,,08

5,,12

Пример 3. Активность термолизина определ ют как в примере 1, но при температурах от 40 до 83 С, Параллельно в аналогичных услови х определ ют активность фермента известным способом и выражают ее в микромол х тирозина, перешедшего в раствор за 1 мин.

Результаты приведены на фиг.З Анализ полученных результатов показывает, что активность протеаз, определ ема  поедлагаемым способом, четко ко.ррелирует с величинами, полученными спектрофотометрическим методом; предлагаемый способ не уступает известному в точности опреде- легш  (см,табл.2), обладает более высокой чувствительностью по сравнению с определением по поглощению в УФ-области; чувствительность его возрастает с повышегшём температуры

Таблица2

Протосуб- 5,2-0,22

Т1-ШИН

1,,05 0,,005 Термоли- 4,,025

ЗИН

1,,05 0,,006

Прототер- 6,,03 мин 1,,03

0,,006

5,,20

1,,05

0,,004

4,86±0,024

1,,045

П,,006

6,,04

1,46-0,03

0,,007

Использование изобретени  позвол ет значительно повысить чувствительность анализа и сократить врем , затрачиваемое на определение активности большой группы протеолити- ческих ферментов (с оптимальной пературой реакции от 45 до ,

широко используемых в различных обаст х народного хоз йства.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ определени  активности термостойких протеолитических ферментов , включающий инкубацию ферментного препарата с раствором ка- з.еина в буфере при оптимальной температуре реакции и определение продуктов гидролиза оптическими методами , отличающийс  тем, что, с целью повьшени  чувствительности способа и сокращени  времени анализа, измер ют интенсивность светорассе ни  непосредственно в реакционной смеси при оптимальной дл  исследуемого фермента температуре в интервале 45-99 С

   Ц «де«М«+ - вйщш -Ц

   t I $ 9 10 -аю ts io«

   tftM (lyMt

   .1

   л« .(й.ГОСТЙ 2в г-Г4

   9ut.l

   «Г «г л &9 65 71 77 85 reftnepeunypa Ct).Л

   л«

   9ut.l