SU1395677A1

SU1395677A1 - Способ определени активности холестеролэстеразы

Info

Publication number: SU1395677A1
Application number: SU864105584A
Authority: SU
Inventors: Грациюшас-Гедиминас Раполович Браженас; Ирина Валентиновна Бахматова; Люция Юозовна Марцинкявичене; Вальдас-Станисловас Альгимантович Лауринавичюс; Марите Винцоана Песлякене; Елена Андреевна Киприанова; Оксана Ивановна Бойко
Original assignee: Институт биохимии АН ЛитССР; Институт Микробиологии И Вирусологии Им.Д.К.Заболотного
Priority date: 1986-08-15
Filing date: 1986-08-15
Publication date: 1988-05-15

Abstract

Изобретение относитс к электрохимическим -методам анализа с использованием Лерментов и может быть использовано в промьппленности при обнаружении холестеролэстеразы в средах ее выращивани , а также в диагностических цел х в медицине. Цель изобре- тени - упрощение способа определени активности холестеролэстеразы. Способ заключаетс в том, что при взаимодействии холестеролэстеразы с субстратом осуществл етс электролиз реакционной смеси в присутствии холе- стеролоксидазы, платинового электрода , покрытого трехслойной мембр иой, при 0,6 В отн. Ag/AgCl электрода сравнени , а определение активности проводитс по скорости увеличени анодного тока в чейке. Способ вл етс пригодным дл анализа окрашен- ; ных, непрозрачных сред микробиологи- ческой промышленности. 3 табл. с (Л

Description

со со ел

О5

Изобретение относитс к электрохимическим методам анализа материалов путем измерени тока при электролизе с использованием ферментов, конкретно к способу определени активности холе сте рол э с те разы, и может быть использовано в промьшшенности дл определени холестеролэстеразы, а также в диагностических цел х в медици-

; не.

Цель изобретени - упрощение спо; соба.

i Способ предусматривает взаимодей- I ствие холестеролэстеразы с субстра- I том - холестериловым эфиром непредельной высшей кислоты в фосфатном буферном растворе в присутствии холе стёролоксидазы и определение активности по величине скорости измене- НИН измер емого параметра, при взаимодействии холестеролэстеразы с субстратом провод т электролиз реакционной смеси в присутствии рабочего электрода,, покрытого трехслойной за- щитной мембраной, при +05,6 В отн. Ag/AgCl электрода сравнени , а активность холестеролэстеразы оцредел

ют по скорости увеличени анодного тока.

В качестве рабочего электрода используют плат 1новый электрод, в качестве буферного раствора - 0,05 М фосфатньй буфер, рН 7,0-9,0, в качестве субстрата - холестерололеат,

В интервале рН 7,0-9,0 раствора обеспечиваетс чувствительность измерений , а в более кисльос средах- уменьшаетс каталитическа активност холестеролоксидазы и уменьшаетс чувствительность способа..

Концентраци холестеролоксидазы составл ет 0,33-0,5 ед/мл концентраци холестерололеата 5-10 мМ. Ниже указанных пределов концентраций наблюдаетс зависимость тока от концентраций холе.стеролоксидазы и холе- стерололеата, в то врем как при определении ток чейки должен полность отражать только активность холестеролэстеразы . Использовать более высокие концентрации экономически невыгодно и нецелесообразно.

Протекают следующие превращени :

Холестерололеат + -------- :--- --- --- Холестерин + Олеинова кислота

холестеролэстераза Холестерин -ь О, -225§ 12Р23° ИДНа Холестенон + ,

Электрохимическое окисление на Pt электроде при 0,6 В отн. Ag/AgCl;электрода сравнени генерирует анодный ток. Скорость увеличени анодного тока пропорцион ьна скорости образовани перекиси водорода, котора пропорциональна скорости гидролиза холестерололеата, т.е. пропорциональна , активности холестеролэстеразы . Угол кинетической кривой отражает скорость гидролиза холестерололеата ..Способ осуществл ют следующим образом j , .

В измерительную чейку, содержащую 1 мл буферного раствора, погружают электрод, ввод т 0,02 мл холесте- рололеата, 0,02 мл холестеролоксидазы . Регистрируют стационарный ток в течение 0,5-1 мин, затем ввод т 0„02 мл исследуемого раствора, содержащего холестеролэстеразу и регистрируют увеличение анодного тока в течение 3-4 мин, рассчитывают ферментативную активность , исход из тан

генса угла наклона кинетической кривой увеличени тока в течение первых 3-4 мин. Из экспериментально полученной величины Д 1д „ , нА/мин и ответа электрода на стандартную концентрацию холестерина (40 мкМ) .в отсутствии холестерололеата и холестеролэстеразы вычисл ют скорость ферментативной реакции (скорость образовани холестерина в чейке в мкмоль/мин)

и удельную активность холестеролэстеразы из трех параллельных измерений . Удельную активность препарата (Е/МГ) можно вычислить также из построенного калибровочного графика

(концентраци фермента - скорость ферментативной реакции). После измерени тока чейка в течение 1,5 мин промываетс буферным раствором, после чего можно проводить следующее измерение .

Пример 1, Определение зависимости величины тока от концентрации холестеролоксидазы.

Электролиз провод т в присутствии 0,2 Mi I холестерина в чейке в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,2 и разных количеств холестеролоксидазы. ,

Полученные данные приведены в

табл. 1.

Данные показывают, что зависимость тока от концентрации холестеролоксидазы наблюдаетс до 0,33 ед/мл., JQ

Пример 2, Определение зависимости величины изменени тока от концентрации холестерололеата.

Электролиз провод т в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,5, в присутствии 5 ,5 ед/гет.холестеролоксидазы, О,14 ед/мл холестеролэстеразы и разных количеств холестерололеата.

Данйые приведены в табл. 2. Из табл. 2 видно, что минимальна 20 концентраци холестерололеата в чейке должна быть 5 мМ.

Пример 3. Определение активности холестеролэстеразы.

Электролиз провод т, как в приме- 25 ре 2, в присутствии 7 м холестерололеата , 0,45 ед/мл холестеролоксидазы. Ввод тс разные объемы раствора холе-- стеролзстеразы и записываютс кинетические кривые изменени тока. о

Дл вычислени скорости ферментативной реакции устанавливают величину , тока при использовании стандартного раствора холестерина (40 мкМ), котора была равна 33,3 нА. При введении в чейку 10 мкл (20 мкг) исследуемого раствора холестеролэстеразы изменение тока составл ет 5,2 нА/мин. Из этих данных вычисл ют скорость ферментативной реакции: 40 мкМ - 33,3 нА, X - 5,2 нА/мин, х 6,24 мкМ/мин (в л), или, 6,24 мкмоль/мин в 1,0 мл -(в чейке). Следовательно, 6,24 ед холестеролэстеразы было в 10 мкл рбраз- .с ца, а в 1 мл препарата было 0,624 ед. фермента. Поскольку исследуемый образец содержал 2 мг/мл белка, то удельа активность фермента, вычисленна з одного измерени , составл ла CQ ,312 Е/мг. Аналогично вычислены и ругие активности.

Дл удобства проведени расчетов ри непрерывном анализе большого коичества проб используют формулу

35

40

55

л / . а. Ь. А, ед/мл k -----,

где k - коэффициент,.равный концент- , рации холестерина, мкМ, кото ,

JQ

5

20

25 - о

.с CQ

35

40

5

,

ра способствует изменению тока в чейке 1 нА; а - измеренное изменение тока,

нА/мин;

b - степень разбавлени исследуемого образпгз., раз. Например, при введении в чейку 10 мкл исследуемой холестеролэстеразы получают

40 мкМ , „ СОЛ/ 5,2.нА/мин;

b ОЬ раз;

. / 1,2«5,2. 100 .. ,, А, ед/мл 0,624.

При введении в чейку 20 мкл получают: k 1,2; а 10,5 нА/мин; b 50 раз

л / 1,2-10,5-50 - ,- А, ед/мл

Аналогично рассчитаны и другие активности . Данные приведены в табл. 3.

I . .

Из табл. 3 видно, что наблюдаетс

строга пр молинейность увеличени тока (л1) от активности холестеролэстеразы в чейке. Вычисленные удельные активности препарата из любой точки близки (среднее 0,308 Е/мг белка ) . Вычисленна удельна активность из построенного калибровочного графика (скорость реакции - количество холестеролэстеразы) составл ет 0,305 Е/мг, т.е. практически совпадает . .

Предлагаемый способ вл етс простым и экспрессным, так как отпадает необходимость приготовлени радиоактивного субстрата или прозрачных образцов , применени пероксидазы и о- дианиз.идина. Метод основан на использовании простого оборудовани и обеспечивает возможность автоматизации процесса. По сравнению с электрофотометрическим методом используетс в 10 раз меньше исследуемого образца, а врем одного анализа в 6 раз короче . Процесс определени можно проводить непрерывно, например при ходе вьщелени или очистки фермента..

Таким образом, упрощение способа заключаетс в сокращении времени определени до 4 мин, в возможности ав- то матизации процесса, в использовании более простого оборудовани , в исключении дополнительного применени пероксидазы и о-дианизидина.

5

формула изобретени Способ определени активности хо лестеролэстеразы, предусматривающий приготовление реакционной смеси, содержащей фосфатньй буфер, раствор фермента и субстрат, инкубацию ее и последующую оценку результатов, о т- дичающийс. тем, что, с це956776

лью упрощени способа, реакционную смесь помещают в электрохимическую чейку и подвергают ее электролизу в с присутствии платинового электрода, покрытого трехслойной защитной мембраной , а холестеролэстеразиую активность оценивают по увеличению анодного тока .

Т а б л и ц а 1.

Claims

формула изобретения Способ определения активности хо~ лестеролэстеразы, предусматривающий приготовление реакционной смеси, содержащей фосфатный буфер, раствор фермента и субстрат, инкубацию ее и последующую оценку результатов, о тдичающийся тем, что, с це лью упрощения способа, реакционную смесь помещают в электрохимическую ячейку и подвергают ее электролизу в g присутствии платинового электрода, покрытого трехслойной защитной мембраной, а холестеролэстеразную активность оценивают по увеличению анодного тока .

Т а б л и ц а 1.

т

Холестеролоксидаза, ед/мп 0,033 0,066 0,130 0,200 0,260 0,330 0,500 Ток электрода, нА 60 120 230 275 290 300 301

Таблица 2 Концентрация холестерололеата, мМ 1 2 3 4 5 7 10 Увеличение тока электрода, нА/мин 0,96 1,41 2,0 2,41 2,80 2,81 2,80

Таблица 3 Количество холестеролэстеразы М, нА/мин Рассчитанная скорость ферментативной реакции в ячейке, мкмоль/мин»мл Рассчитанная удельная активность препарата, А мкл мкг ед/мл Е/мг 10 20 5,2 6,24'· 10~³ 0,624 0,312 20 40 10,5 12,6 .ΙΟ³ 0,630 0,315 50 100 26,0 31,2 -10~³ 0,624 0,312 80 160 41,1 49,3 'Ю~³ 0,617 0,309 100 200 50,4 60,5 40-³ 0,605 0,303 125 250. 62,7 75.2 40^ 0,602 0,301