SU1363071A1

SU1363071A1 - Способ исследовани молекул рного переноса в клетках крови

Info

Publication number: SU1363071A1
Application number: SU864031508A
Authority: SU
Inventors: Евгений Георгиевич Попов; Зуфар Ахнафович Габбасов; Илья Юрьевич Гаврилов; Армен Гарникович Межлумян; Евгений Яковлевич Позин
Original assignee: Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР
Priority date: 1986-03-03
Filing date: 1986-03-03
Publication date: 1987-12-30

Abstract

Изобретение может быть использовано дл исследовани аппарата накоплени и переноса биогенных аминов клетками крови. Цель изобретени - определение относительного объема грйнул клеток и коэффициентов распределени красител на цитоплазма- тической и гранул рной мембранах. В три образца с суспензией тромбоцитов добавл ют три различные дозы, акридинового оранжевого. После инкубировани проб измер ют интенсивность флуоресценции каждого образца клеток. Излучение регистрируют при возбуждении на 480 нм и длине волны 530 нм. (Л 00 05 САЭ

Description

1

Изобретение относитс к медицине, в частности к методам цитологических исследований, и может быть использовано дл исследовани аппарата накоплени и переноса биогенных аминов клетками крови.

Целью изобретени вл етс определение относительного объема гранул клеток и коэффициентов распределени красител на цитоплазматической и гранул рной мембранах.

Указанна цель достигаетс тем, что согласно способу исследовани молекул рного переноса в клетках крови в идентичные пробы клеток добавл ют три различные концентрации флуоресцентного красител и по измеренным значени м интенсивности флуоресценции этих трех проб вычисл ют относительный , объем гранул клеток йрови и коэффициенты распределени красите л на плазматической и гранул рной мембранах по системе уравнений:

F-(l-V)(Ci)+V4(l-,W)F()4- (),

C Co / -V+Kl V(l-W)+KbI 2 V4Wj; i i 1,2,3,

где F(C) - зависимость интенсивности флуоресценции даного красител от его концентрации;

общее количество красител , добавленного в i-й образец клеток; . С- - концентраци красител во

внеклеточной среде; F. - интенсивность флуоресценции i-ro образца, клеток;

V - относительный объем клеток крови;

W относительный объем гранул;

К 1 коэффициент распределени красител на цитоплазматической мембране; К 2 - коэффициент распределени красител на гранул рной мембране.

Пример . Проводили оценку объема серотонинсодержащих гранул тромбоцитов человека и коэффициентов распределени на плазматической и гранул рной мембранах флуоресцентного красител акридинового оранже- вого (АО). Интенсивность флуоресценции красител измер ли на спектрофлуориметре Хитачи MPF-2 ;

St

,

.

10

63071

кюветное отделение которого было видоизменено , дл измерени сигнала из небольшого объема, прилегаю1цего к передней грани кюветы. Кровь стабилизировали 0,13 М раствором цитрата натри в соотношении 9:1 (9 частей крови на 1 часть антикоагул нта), После центрифугировани крови при 200g в течение 12 мин получали обогащенную тромбоцитами плазму. Супер- натант отбирали пластиковыми пипетками и хранили при комнатной температуре . В три одинаковых образца суспензии тромбоцитов (каждый объем в 1 мл) было добавлено три различные дозы АО. Конечные концентрации АО составили 2; 8 и 15 мкМ. После инкубировани проб при комнатной температуре в течение 90 мин измер ли интенсивность флуоресценции каждого образца клеток-. Излучение регистрировали на длине волны 530 нм при возбуждении на 480 нм. Были получены следующие результаты: F,, - 0,016 отн. ед. при Ср, 2 мкМ; F 0 0,026 отн. ед.

при

15

20

25

30

35

при С 8 мкМ;

F 0,036 отн. ед. при С 15 мкМ. Относительный объем тромбоцитов в суспензии составил 0,95%. Зависимость интенсивности флуоресценции АО от его концентрации бьша сн та в диапазоне концентраций 1 - 1000 мкМ. Крива была приближена полиномом четвертой степени:

2 -3

40

C 16 -F+15, +8,, При этом сумма квадратов относительных ощибок по всем то.чкам составила 3%. Функци зависимости F(C) в данном случае есть функци , обратна полученному полиному. Дл машинного решени системы из трех полученных уравнений была применена комбинаци методов глобального поиска и 45 наискорейшего сггуска. Прогон системы на м:f кpoкoмпьютepe дал следующие результаты: К1 12,5; К2 7000; ,20. Согласно полученным данным, объем гранул составл ет 20% от общего объема клеток.

Пример 2. Эксперимент проводилс аналогично примеру 1, но были изменены конечные концентрации красител в-пробах в пределах вышеуказанного диапазоне концентраций.

50

55

Результаты измерений следующие F 0,009 отн. ед. при С 0,5 мкМ; Гу2 0,017 отн. ед. при С 2 мкМ; |Е З 0,028 отн. ед. при Соз 8 кМ.

31

Относительный объем тромбоцитов в суспензии 0,83%, Дл трех искомых параметров после расчетов были получены следующие значени : ,0; К2 6900; ,19.

I Пример 3, Эксперимент про- родилс аналогично примеру 1, Результаты измерений следующие; F 0,027 отн. ед. при С, 8 мкМ;

Fj 0,038 отн. ед. при 15 мкМ; F 0,046 отн, ед. при 20 мкМ; относительный объем клеток 0,85%. После обсчета результатов получены следующие значени : К1 10,0; W .0,21.

Из п1риведеннык. результатов видно, что предлагаемый способ позвол ет оценить относительный объем гранул клеток и коэффициенты распределени красител на плазматической и гранул рной мембранах.

Claims

Формула изобретени

Способ исследовани молекул рного переноса в клетках крови, включающий добавление в пробу флуоресцентного красител , инкубацию до установлени его равновесного распределени и измерение интенсивности флуоресценции , отличающийс тем, что, с целью определени относит ель-, ного объема гранул клеток и коэффициентов распределени красител на цитоплазматической и гранул рной

мембранах, в идентичные пробы клеток . добавл ют три различные концентрации акридинового оранжевого в интервале 0,5-20 мкМ., затем измер ют соответствующие величины интенсивности

флуоресценции с последукщим расчетом.