SU1257519A1

SU1257519A1 - Способ определени гликозаминогликанов в жидких средах

Info

Publication number: SU1257519A1
Application number: SU843799248A
Authority: SU
Inventors: Ксения Дмитриевна Краснопольская; Ольга Николаевна Одинокова; Сергей Павлович Фещенко
Original assignee: Институт Медицинской Генетики Амн Ссср
Priority date: 1984-10-08
Filing date: 1984-10-08
Publication date: 1986-09-15

Abstract

Изобретение относитс к биологической химии. Цель изобретени - повышение чувствительности способа и сокращение времени анализа. Измер ют флюоресценцию раствора 4,6-днамиди- но-2-фенилиндола. Добавл ют исследуемую пробу. Измер ют флюоресценцию смеси после каждого добавлени пробы. При рН 5,6-6,0 регистрируют снижение интенсивности флюоресценции, по которому рассчитывают общее содержание гликозаминогликанов. При рН 2,0 регистрируют повышение интенсивности флюоресценции, по которому рассчитывают содержание гепарансульфата. 7 табл. в 1(Л с ел «ч ел

Description

Изобретение относитс к биологической химии, а именно к количественному определению гликозаминогли- канов, и может быть использовано в лабораторно-клинических и экспериментальных исследовани х.

Цель изобретени - повышение чувствительности способа и сокращение времени анализа за счет измерени интенсивности флюоресценции раствора А,6-диамидино-2-фенилиндола при добавлении исследуемых проб при определенных значени х рН,

Способ осуществл етс следующим образом.

Измер ют флюоресценцию раствора 4,6-диамидино-2-фенилиндола (ДАФИ), затем добавл ют исследуемую пробу и измер ют флюоресценцию смеси после каждого добавлени пробы. При рН 5,6-6,0 регистрируют снижение интенсивности флюоресценции, по которому рассчитывают общее содержание глико- заминогликанов (ГАГ), при рН 2,0 регистрируют повышение интенсивности флюоресценции, по которому рассчи гьшают содержание гепарансульфата (Г

Пример 1. Определение суммарного содержани ГАГ в моче,

Дл определени берут О,1 мл от- диализованной в течение ночи мочи и 2 мл водного раствора ДАФИ в концентрации S lCJ М с рН 5,6,

В кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см внос т 2 мл водного раствора ДАФИ и измер ют на спектрофлюориметре при длине волны 450 нм (длина волны возбузвдени

0, 10,0

0,2j- 5,0

0. ,3

5

355 нм) интенсивность флюоресценции. Уровень флюоресценции водного раствора ДАФИ Fg выставл ют на шкале прибора как 100% (см, табл, 1), Затем микрошприцем в кювету внос т 5 мкл тестируемого образца мочи и снова определ ют интенсивность флюоресценции F. Процедуру внесени 5 мкл того же образца мочи с последующей регистрацией F повтор ют еще дважды, Результаты измерени изображают графически на масштабной бумаге в координатах F/Fg и объем мочи. По графику определ ют тангенс угла наклона oi начальной части кривой к оси ординат, который равен значению, отсекаемому касательной к кривой на оси абсцисс.

Таблица 1

Объем мочи, вносимой в кювету с ДАФИ, мкл

F/F,

Аналогично стро т калибровочную кривую дл стандартных растворов хондроитинсульфата в координатах: величина, обратна концентрации ГАГ, (мп/мг), tg (и (табл, 2),

Таблица 2

0,97

0,94

0,90.

0,93

0,86

0,79

0,90

150

74

Затем по калибровочной кривой на- ход т соответствующую определенному t тангенсу угла наклона обратную концентрацию ГАГ. Концентрацию ГАГ в образ це мочи рассчитывают по формуле

25

При тангенсе угла d, равном в данном случае 44, обратна концентраци ГАГ составл ет 2,9 мл/мг. Концентра- цию ГАГ в данном образце рассчитывают следующим образом:

ГАГ 0-S--7 0,345 мг/мл. -J 2,9 мл/мг

П р и м е р 2. Определение суммарного содержани ГАГ в растворе протео- гликанов.

Дл определени берут 0,1 мл водного раствора протеогликана в концентрации 0,2 мг/мл и 2 мл водного раствора ДАФИ в концентрации 5 с рН 6,0.

В кварцевую кювету внос т 2 мл водного раствора ДАФИ и исходный

10 м

уровень флюоресценции F, выставл ют на шкале прибора как 100%. Затем в кювету с раствором ДАФИ внос т микрошприцем 5 мкл раствора протеогликана , содержащего ГАГ, и определ ют интенсивность флюоресценции (табл. 3). Процедуру внесени 5 мкл раствора протеогликана с последующей регистрацией интенсивности флюоресценции повтор ют еще дважды. Результа- ты, приведенные в табл. 3, изобража- ют графически на масштабной бумаге IB координатах F/FO - объем раствора протеогликана. Затем определ ют по

Продолжение табл.2

касательной к кривой тангенс угла наклона кривой к оси ординат (tgaj ), и по калибровочной кривой определ ют концентрацию ГАГ в водном растворе протеогликана.

Дл данного образца tg oi .составил 84. Это соответствует по калибровочной кривой обратной концентрации ГАГ

5,56 мл/мг. ГАГ ----I-

5,56 мг/мл

0,18 мг/мл, т.е. в исследованном препарате протеогликана (концентраци 0,2 мг/мл) содержание ГАГ составл ет 90% (О,18 мг/мл).

П р и м е р 3. Определение суммарного содержани ГАГ в амниотической жидкости.

Дл определени берут 0,1 мл от- диализованной в течение ночи амнис- тической жидкости и 2 мп водного раствора ДАФИ в концентрации с рН 5,8.

уровень флюоресценции F выставл ют на шкале прибора как 100%. Затем в кювету с раствором ДАФИ внос т микрошприцем по 5 мкл тестируемого образца амниотической жидкости и on- редел ют интенсивность флюоресценции (табл. 4). Результаты измерени изображают графически на масштабной бумаге в координатах F/Fp - объем амниотической жидкости, определ ют тан- гене угла наклона начальной части кривой к оси ординат (tgci), и по калибровочной кривой определ ют концентрацию ГАГ в амниотической жидкости .

Таблица 4

При тангенсе угла , равном дл данного образца 95, обратна концентраци ГАГ составл ет 6,3 мл/мг,

ГГАГ 0,159 мг/мл

- -1 6,3 мп/мг

Пример 4. Определение концентрации гепарансульфата в смеси ГАГ в моче.

Дл определени берут 0,1 мл мочи (диализ не об зателен) и 2 мл 5 К) М раствора ДАФИ в 0,01 Н , рН 2,0

В кювету с раствором ДАФИ внос т 20 мкл тестируемого образца мочи и определ ют уровень флюоресценции F. Флюоресценци свободного красител FIJ, выставл етс за 100%. Результаты измерени приведены в табл. 3.

Таблица 5

Затем стро т калибровочную кривую дл стандартных растворов ГС в координатах F (концентраци ГС в мг/мл) (табл.6).

Таблица 6

Концентраци ГС (мг/мл)

AF

Поскольку суммарна концентраци ГАГ в том же образце мочи составила 0,345 мг/мл (пример 1), а концентраци ГС при uF, равном 8, составила 0,225 мг/мл, процентное содержание ГС в смеси ГАГ составл ет 65,2%,

П р и м е р 5. Определение концентрации ГС в смеси стандартов ГАГ в растворе.

Дл определени берут 2 мл 5-10 М раствора ДАФИ в 0,01 Н Qi, рН 2,0 и 0,1 мл тестируемой смеси ГАГ, содержащей по 0,25 мг/мл ГС и хондро- итинсульфата.

Пор док проведени титровани во времени такой же, как в примере 4. Результаты определени приведены в табл. 7.

Таблица7

По калибровочной кривой (табл. Ь), наход т концентрацию ГС,соответствующую значению 4F, равному 9 - О, 25 мг/мл.

712575198

Claims

Формула изобретени ла добавл ют исследуемую среду с последующим измерением изменени интен-

Способ определени гликозаминогли- сивности флюоресценции,причем при рН канон в жидких средах путем обработ- 5,6-6,0 определ ют суммарное содер- ки их 4,6-диамидино-2-фенилиндолом, j жание гллкозаминогликанов по сниже отличающийс тем, что, нию интенсивности флюоресценции, с целью повышени чувствительности а при рН 2,0 определ ют содержание способа и сокращени времени анализа, гепарансульфата по повышению ивтен- к раствору А,6-диамидино-2-фенилиндо- сивности флюоресценции.