SU121909A1

SU121909A1 - Method for industrial production of purified and concentrated (adsorbed) tetanus toxoid

Info

Publication number: SU121909A1
Application number: SU576762A
Authority: SU
Inventors: К.И. Матвеев; Л.И. Могильникова; Т.В. Орешкина; Г.С. Сойкина; Л.Н. Стовичек; Н.В. Хатунцева; Е.А. Щекочихина
Original assignee: К.И. Матвеев; Л.И. Могильникова; Т.В. Орешкина; Г.С. Сойкина; Л.Н. Стовичек; Н.В. Хатунцева; Е.А. Щекочихина
Priority date: 1955-05-27
Filing date: 1955-05-27
Publication date: 1958-11-30

Description

Известны способы промышленного изготовлени очищенного и концентрированного столбн чного анатоксина.Methods are known for the industrial production of purified and concentrated tetanus toxoid.

Предлагаемый способ дает возмол ность получени высокоактивного столбн чного токсина. Это достигаетс тем, что используют гидролизатную (безм сную) питательную среду, приготовленную на основе смеси кислотных гидролизатов казеина, рыбокостной и кукурузной муки , и адаптированный к этой среде штамм столбн чной палочки «Колле № 8, полученный в результате выращивани при 35° на прот жении б-10 суток, токсин перевод т в анатоксин обычным способом обработкой формалином, а затем очищают и концентрируют комбинированным осаждением растворами хлористого натри и сол ной кислоты с последующей адсорбцией на гидроокиси алюмини и дальнейшей обработкой и использованием готового анатоксина по известным схемам.The proposed method makes it possible to obtain highly active tetanus toxin. This is achieved by using a hydrolyzate (cloudless) nutrient medium, prepared on the basis of a mixture of acidic hydrolyzates of casein, fish and bone meal, and a strain of tetanus bacillus Collet No. 8, adapted to this medium, obtained by growing 10 to 10 days, the toxin is converted into toxoid in the usual way by treatment with formalin, and then purified and concentrated by combined precipitation with solutions of sodium chloride and hydrochloric acid, followed by adsorption on aluminum hydroxide and lneyshey processing and use of finished toxoid according to known schemes.

Способ осуществл етс следующим образом.The method is carried out as follows.

Приготовление кислотного гидролизата казеина. 8 кг сухого казеина раствор ют в 100 л водопроводной воды; к этому раствору добавл ют 1 кг концентрированной чистой сол ной кислоты, уд. в. 1,18. Смесь перемешиваетс и нагреваетс до 80°, вторично перемешиваетс и кип титс 20 мин., после чего производ т гидролиз при 1 атм давлени в течение 20 мин.Preparation of acid casein hydrolyzate. 8 kg of dry casein is dissolved in 100 liters of tap water; To this solution add 1 kg of concentrated pure hydrochloric acid, spd. at. 1.18. The mixture is stirred and heated to 80 °, stirred again and boiled for 20 minutes, after which hydrolysis is carried out at 1 atm pressure for 20 minutes.

Приготовление кислотного гидролизата рыбной муки и кукурузы. 10 Кс рыбной муки и 3,3 кг размолотой кукурузы суспендируют в 100 л водопроводной воды, добавл ют 1,3 кг концентрированной сол ной кислоты, перемешивают и ведут гидролиз в течение 4 час. при давлении 1,5 илм.Preparation of acid hydrolyzed fish meal and corn. 10 Kc of fish meal and 3.3 kg of ground corn are suspended in 100 liters of tap water, 1.3 kg of concentrated hydrochloric acid is added, mixed and hydrolyzed for 4 hours. with a pressure of 1.5 ilm.

Кроме гидролизата из рыбной муки и кукурузы готов т гидролизаты из одной рыбной муки по такой же прописи.In addition to the hydrolyzate, fish hydrolyzates from fish meal and corn are prepared from the same fish meal according to the same recipe.

jYo 121909jYo 121909

Из указанных гидролизатов готов тс среды с 40Vo гидролизата казеина и рыбо-казеинова среда по следующим пропис м.From these hydrolysates, media with 40Vo casein hydrolyzate and fish-casein medium are prepared according to the following registry.

Приготовление казеиновых сред с кукурузным экстрактом. Берут гидролизата казеина, добавл ют 56% воды, тщательно перемешивают и нагревают до 80°. Добавл ют 3iVo кукурузного экстракта и 0,4% поваренной соли, смесь довод т 20%-ным раствором щелочи до рН 7,2 и кип т т 5 мин. После кип чени рН довод т до 7,2 и добавл ют по O.rVo НРО4 и К2НРО4, перемещивают и кип т т 10 мин. Фильтруют в гор чем виде. Стерилизуют среду при 0,5 атм. в течение 30 мин.Preparation of casein media with corn extract. Casein hydrolyzate is taken, 56% of water is added, mixed thoroughly and heated to 80 °. 3iVo of corn extract and 0.4% sodium chloride are added, the mixture is adjusted to pH 7.2 with 20% alkali solution and boiled for 5 minutes. After boiling, the pH was adjusted to 7.2 and O.rVo HPO4 and K2HPO4 were added, displaced and boiled for 10 minutes. Filtered in hot form. Sterilize the medium at 0.5 atm. within 30 min.

Среды К20 и КШ приготовл ют аналогично тому, как готов т среду с 40% гидролизата казеина с той лищь разницей, что в одном случае берут 20Vo гидролизата (К20) и в другом 10% гидролизата по описанной ПрОПИСИ.The K20 and KS media are prepared in the same way as a medium with 40% casein hydrolyzate is prepared, with the difference that in one case 20Vo hydrolyzate (K20) is taken and in the other 10% hydrolyzate according to the described PROPISI.

Приготовление рыбо-казеиновой среды.Cooking fish-casein environment.

Берут г дрол 1зата рыбной муки и 5% гидролизата казеина, добавл ют воды, неремещивают и нагревают до 80°. Добавл ют 3% кукурузного экстракта и 0,4Vo NaCl, смесь довод т 2QVo-nbiM раствором NaOH до рН 7,2 и кип т т 5 мин. После кип чени рН довод т до 7,2 и добавл ют по 0, Na2HPO4 и К2НРО4 перемешивают и кип т т 10 мин. Фильтруют в гор чем виде. Среда стерилизуетс при 0,5 атм. в течение 30 мин.They take a g of 1 ml of fishmeal and 5% casein hydrolyzate, add water, dislodge and heat to 80 °. 3% of corn extract and 0.4Vo of NaCl are added, the mixture is adjusted to pH 7.2 with 2QVo-nbiM solution of NaOH and boiled for 5 minutes. After boiling, the pH is adjusted to 7.2 and 0 is added, Na2HPO4 and K2HPO4 are mixed and boiled for 10 minutes. Filtered in hot form. The medium is sterilized at 0.5 atm. within 30 min.

Химический состав по азотистым компонентам в казеиновых средах отличаетс от рыбо-казеиновых сред по количеству нерасщепленного белка. В среде с 40% гидролизата казеина нерасщепленного белка почти к двое больще по сравнению с рыбо-казеиновой средой.The chemical composition of the nitrogenous components in casein media differs from fish-casein media in the amount of undigested protein. In an environment with 40% casein hydrolyzate, the undigested protein is almost twice as large as fish-casein medium.

Приготовление нативных столбн чных анатоксинов на безм сных средах.Preparation of native tetanus toxoids on cloudless media.

Путем адаптации щтамма столбн ка «Колле № 8 к казеиновым средам получают штамм, дающий на казеиновых средах с 40/о гидролизата токсин, активностью 500 тыс. - 1 млн. в 1 мл, а на рыбо-казеиновой среде от 1 до 4 млн. в 1 мл. Максимальна сила столбн чного токсина на этих средах наблюдаетс на 6-10 день культивировани . Возраст посевного материала от одних суток до 2 лет. Выращивание производитс при 35° С.By adapting the column “Collet No. 8 to casein media, a strain is obtained that gives toxin on casein media with 40 / o hydrolyzate, with an activity of 500 thousand - 1 million in 1 ml, and on fish-casein medium from 1 to 4 million. in 1 ml. The maximum strength of tetanus toxin on these media is observed on days 6-10 of cultivation. The age of seed from one day to 2 years. Cultivation takes place at 35 ° C.

Полученные токсины перевод т в анатоксины путем добавлени 4% формалина и выдерживани в термостате при 38°. Полное обезвреживание анатоксинов на 40Vo гидролизата казеина и рыбо-казеиповой среде происходит за 10-13 дней.The resulting toxins are converted into toxoids by adding 4% formalin and incubating in a thermostat at 38 °. Complete neutralization of toxoids on 40Vo casein hydrolyzate and fish-caseip medium occurs in 10-13 days.

Столбн чные анатоксины, приготовленные на безм сных средах, подвергались концентрации и адсорбции. Дл концентрации столбн чното анатоксина применен метод осаждени анатоксина однонормальным раствором в изоэлектрической точке. Непосредственно перед осаждением нативный анатоксин сепарируют дл удалени из него микробных тел. К прозрачному раствору анатоксина добавл ют 15% сухой поваренной соли при непрерывном помещивании раствора. После полного растворени соли осторожным добавлением сол ной кислоты рН понижают до 3,5. Осажденный анатоксин оставл ли в комнате (температура 20-22°) на 16-18 час. Образовавщийс осадок отдел ют на центрифуге или Сепараторе от маточного раствора и раствор ют в фосфатном буфере (рН 7,40) из расчета 25-30-кратной концентрации по объему. РП полученного концентрата в зависимости от серии и среды колеблетс в пределах 6,50-4,20.Columnar toxoids prepared on cloudless media were subjected to concentration and adsorption. For the concentration of tetanus toxoid toxoid, the toxoid deposition method with a single-normal solution at the isoelectric point has been applied. Immediately prior to precipitation, the native toxoid is separated to remove microbial cells from it. To a clear solution of toxoid, add 15% dry table salt while continuously placing the solution. After the salt is completely dissolved by careful addition of hydrochloric acid, the pH is reduced to 3.5. The precipitated toxoid was left in the room (temperature 20-22 °) for 16-18 hours. The precipitate formed is separated in a centrifuge or separator from the mother liquor and dissolved in phosphate buffer (pH 7.40) at a rate of 25-30 times volume. The RP of the concentrate obtained, depending on the series and medium, ranges from 6.50 to 4.20.

В тех случа х, когда при растворении осадков в фосфатном буфере рН сдвигаетс ниже 5,20, растворение осадков бывает неполным, чтоIn cases where the pH shifts below 5.20 when the precipitate dissolves in the phosphate buffer, the precipitate dissolves