SU1138097A1 - Способ криоконсервации апексов растений - Google Patents

Abstract

СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ АПЕКСОВ РАСТЕНИЙ, включающий их предварительную подготовку, размещение, в ампуле с поперечной перегородкой, медленное программное замораживание в присутствии криопротектора с использованием затравки кристаллизации раствора криопротектора и последующей стабилизацией температуры до момента образовани  кристаллов льда во всем объеме раствора криопротектора в процессе замораживани  и хранение апексов в жидком азоте, отличающийс  тем, что, с целью повышени  жизнеспособности и способности к регенерации апексов, увеличени  надежности и упрощени  способа , заполн ют разделенные перегородкой верхнюю и нижнюю части ампулы раствором криопротектора раздельно с помощью вставленной в отверстие перегородки труб (Л ки с образованием воздушной прослойки между ними, a затравку производ т путем кратковременного пропускани  жидкого азота через нижние концы ампул.

Description

САЭ 00

О Изобретение относитс  к области биотехнологии , а именно к способам низкотемпературного хранени  тканей и клеток растений , и может быть использовано дл  длительного сохранени  образцов диких и культурных видов растений. В насто щее врем  проблема сохранени  всего разнообрази  растительного мира  вл етс  одной из первостепенных. Полное исчезновение представителей редких видов растений, а также возможность безвозмездной утраты ценных форм из числа наиболее распространенных видов говорит о необходимости безотлагательного решени  этой проблемы. В св зи с этим исследователи р да стран занимаютс  разработкой новых и усовершенствованием уже существующих способов хранени  видов растений. Больщие .надежды возлагают на создание банка генов путем сохранени  апексов (точек роста) растений при сверхнизких температурах . Известны способы сохранени  генофонда растений, основанные на глубоком замораживании апексов 1 и 2. Однако данные способы или рассчитаны на ступенчатое замораживание ампул с апексами, или в случае программного замораживани  дл  проведени  затравки раствора криопротектора исследователи вынуждены нарушать режим замораживани , что может повлечь за собой гибель апексов в результате резкого перепада температур в камере программного замораживател . Кроме того, дл  затравки раствора криопротектора путем внесени  кристалликов льда в ампулу с помощью микропипетки требуютс  стерильные услови . что значительно осложн ет процесс замора- 35 живани . Известен также способ криоконсервации апексов растений, заключающийс  в медленном замораживании апексов в ампулах с проницаемой поперечной перегородкой . После 24 ч инкубации в присутствии 5% диметилсульфоксида (ДМСО) апексы перенос т в верхнюю часть ампулы с поперечной перегородкой, плотно прилегающей к стенкам ампулы.и раздел ющей весь объем раствора ДМСО на две равные части , сообщающиес  между собой через два отверсти  диаметром 0,2 мм в поперечной перегородке. Апексы охлаждают в программном замораживателе со скоростью 0,5°С/мин. При 50 -5°С производ т затравку сразу всех ампул, наход щихс  в специальном штативе, путем погружени  их дна в жидкий азот на 0,1 сек. После этого температуру в камере замораживател  поддерживают на уровне -5°С в течение 20 мин, а затем продолжают ох-55 лаждение апексов с первоначальной скоростью до -40°С, после чего сразу же погружают в жидкий азот (-196°С). Этот спо ;j5 соб позвол ет сохранить жизнеспособность апексов на уровне 84% после цикла замораживани  - оттаивани  3. Однако заполнение ампул с поперечной перегородкой раствором криопротектора  вл етс  трудоемким процессом, так как сначала необходимо заполнить раствором весь объем ампулы под перегородкой через отверстие диаметром 0,2 мм, что требует оп ределенного опыта и сноровки, а затем с помощью пипетки заполн ют раствором 2/3 объема ампулы над перегородкой и только после этого помещают замораживаемый объект в верхнюю часть ампулы. Поперечна  перегородка предотвращает только непосредственный контакт апексов с быстродействующими кристаллами льда в момент затравки, но не снижает в должной мере скорость роста кристаллов льда, которые после проведени  затравки свободно и быстро проникают в верхнюю часть ампулы через два отверсти  диаметром 0,2 мм, без которых нельз  обойтись ввиду того, что через одно отверстие ввод т раствор криопротектора шприцем в нижнюю часть ампулы, а через другое выходит замещаемый на раствор воздух. В результате того, что кристаллы льда после затравки быстро проникают через поперечную перегородку, то затравку кристаллизации можно проводить только в течение 1,0-1,3 сек, а при более продолжительном времени затравки увеличиваетс  опасзамораживаемого ность повреждени  объекта. Дл  проведени  затравки раствора криопротектора в .процессе охлаждени  открывают камеру программного замораживател . извлекают из нее кассету с ампулами и вручную , путем кратковременного погружени  дна сразу всех ампул в жидкий азот, производ т затравку, после чего помещают обратно в камеру, закрывают ее и продолжают охлаждение в заданном режиме. Таким образом , процесс замораживани  прерываетс  на самом ответственном моменте, когда нежелательное снижение или повышение температуры вследствие нарушени  режима замораживани  может повлечь за собой гибель меристематических верхушек. Незначительный перекос штатива с ампулами в момент проведени  затравки может стать причиной гибели апексов из-за того, что при этом часть ампул не будет иметь контакта с хладагентом раствора криопротектора и в ходе дальнейшего охлаждени  апексы погибнут от внутриклеточного льда, образующегос  в результате переохлаждени  воды, в клетках апексов. Целью изобретени   вл етс  повышение жизнеспособности и способности к регенерации апексов растений, увеличение надежности и упрощение способа криоконсервации .

Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу криоконсервации апексов растений, включающему их предварительную подготовку, размещение в ампуле с поперечной перегородкой, медленное программное замораживание в присутствии криопротектора с использованием затравки кристаллизации раствора криопротектора н последующей стабилизацией температуры до момента образовани  кристаллов льда во всем объеме раствора криопротектора в процессе замораживани  и хранение апексов в жидком азоте, заполн ют разделенные перегородкой верхнюю и нижнюю части ампулы раствором криопротектора раздельно с помощью вставленной в отверстие перегородки трубки с образованием воздушной прослойки между ними, а затравку производ т путем кратковременного пропускани  жидкого азота через нижние концы ампул.

В этом случае общий режим замораживани  останетс  неизменным, а кристаллы льда, образующиес  в момент затравки, проникают в верхнюю часть ампулы только по трубке. Это исключает повреждение апексов при проведении такого рода затравки .

Пример. Дл  замораживани  используют апексы культурного тетраплоидного вида картофел  Solanum tuberosum L (сорт Ма {(). Предварительна  подготовка- апексов заключаетс  в культивировании их на жидкой питательной, среде с 5%-ным ДМСО в течение 24 ч. Размер апексов 250-500 мкм. Услови  прекультивировани  - температура 26°С, освещенность 5000 лк, посто нный свет, относительна  влажность 70%. После предварительной подготовки апексы перенос т в верхнюю часть ампулы с поперечной перегородкой, котора  предварительно заполнена раствором криопротекто.ра (0,5 мл охлажденного раствора 5% ДМСО в среде), а затем с помощью плотно вход щей в ампулу пробки перекачивают часть раствора криопротектора в нижнюю часть ампулы по трубке, расположенной по

продольной оси ампулы и одним концом почти касающейс  внутреннего дна нижнего ее отсека, а другим - незначительно выступающей над поперечной перегородкой в верхнем отсеке ампулы. Это обеспечивает образование воздущной прослойки над перегородкой в нижнем отсеке ампулы. После этого ампулы запечатывают и помещают в отверсти  в проточной камере, котора  находитс  внутри камеры замораживател  и полностью изолирована от нее, но сообщаетс  с внещним пространством. Замораживание провод т со скоростью 0,5°С/мин. Когда температура в камере замораживател  достигает - 5°С, провод т затравку дна сразу всех ампул путем подачи порции жидкого азота в проточную камеру . Эта процедура занимает 2,5-3,0 сек. После затравки температуру в камере замораживател  поддерживают неизменной в течение 20 мин, а затем продолжают охлаждение апексов с первоначальной скоростью до -40°С, после чего их быстро перенос т в жидкий азот (-196°С). После хранени  апексов в хладагенте их извлекают из него и размораживают на вод ной бане при 40°С, а затем без отмывки от криолротектора высаживают на агаризованную среду. Услови  .рекультивировани  такие же, как и при проведении прекультивировани . Жизнеспособность апексов после оттаивани  определ ют путем подсчета количества развивающихс  апексов через 7-10 дней рекультивировани .

Предлагаемый способ криоконсервации апексов позвол ет увеличить средний уровень жизнеспособности меристематических верхущек на 11,0%, а способность к регенерации целого растени  - на 49,0% по сравнению с известным способом. Кроме того,  вл етс  более, надежным за счет обеспечени  целенаправленного (по трубке ) роста кристаллов льда после затравки и менее трудоемким, так как упрощает процесс подготовки и проведени  замораживани  за счет исключени  из него р да операций , св занных с проведением затравки путем кратковременного погружени  ампул в жидкий азот на 1,0 сек.

Claims (1)

1. СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ АПЕКСОВ РАСТЕНИЙ, включающий их предварительную подготовку, размещение, в ампуле с поперечной перегородкой, медленное программное замораживание в присутствии криопротектора с использованием затравки кристаллизации раствора криопротектора и последующей стабилизацией температуры до момента образования кристаллов льда во всем объеме раствора криопротекто ра в процессе замораживания и хранение апексов в жидком азоте, отличающийся тем, что, с целью повышения жизнеспособности и способности к регенерации апексов, увеличения надежности и упрощения способа, заполняют разделенные перегородкой верхнюю и нижнюю части ампулы раствором криопротектора раздельно с помощью вставленной в отверстие перегородки трубки с образованием воздушной прослойки между ними, а затравку производят путем кратковременного пропускания жидкого азота через нижние концы ампул.

   >