SU1127888A1 - Способ получени аденозин-5-монофосфата,меченного фосфором-32 - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕН031Щг -5 -МОНОФОСФАТА, МЕЧЕННОГО ФОСФОРОМ 32 , путем облучени  нейтронами на полоний-бериллиевом источнике нейтронов смеси, содержащей 2 ,3-0-анизилиденаденозин , четыреххлористый углерод в качестве хлорсодержащего соединени  - источника фосфора-Э2 и органический растворитель, с последуюпщм удалением защитных групп гидролизом , отличающийс  тем, что, с целью увеличени  выхода целевого продукта, в качестве органического растворител  используют Ы,К-диметилформамид или димет тилсульфоксид в концентрации 0,20 ,5 мол.% и процесс провод т в присутствии конденсирующего агента трихлорацетонитрвла в концентрации 0,,0 мол.%. к -ч| 00 00 00

Description

Изобретение относитс  к получению аденозин-5 -монофосфатов, конкретно к усовершенствованному способу получени  аденозин-З-монофосфата меченного фосфором-32 (З- р-ДМФ) общей формулы нсГ-р-осНг N . ОН ОН Применение нуклеотидов, меченных фосфором-32(),  вл етс  весьма значительным во многих исследовани  В частностиi аденозин-5-монофосфорна  киЬлота (5-АМФ) с меткой Р используетс  дл  изучени  строени  и метаболизма нуклеиновых кислот и их компонентов С0 также  вл етс  исходным продуктом дл  син теза Р -аденозинтрифосфата(2 J Известные способы получени  мече ной 32 Р аденозин-5-мрнофосфорной кислоты () подраздел ютс  на Ферментативные и химические З. и 41 Однако получение АМФ химически1 и способами продолжительно во времени, требует сложного аппаратур ного оформпени  и не позвол ет полу чать высоких.мол рных активностей. Энзиматические методы получени  5- Р АМФ дают хррошие результаты, н дл  проведени  этого синтеза необходимо первоначально синтезировать АТФ и перед использова-нием под вергнуть его очистке. Кроме того, сам процесс получени  целевого продукта св зан со сложными манипул ци ми с радиоактивными веществами, продолжителен во времени и требует наличи  аденозинкиназы. Недостатком его  вл етс  также необходимость ис пользовани  больщого числа (более 10) труднодоступных ферментов и необходимость контролировать полноту превращени  радиоактивного субстрата после каждой-из стадий введени  соответствующего фермента, что требует сложной и дррогосто щей аппара туры. Дл  энзиматических, как и дл  химических способов синтеза . АМФ также требуетс  предварительно получать меченные Р соединени . Наиболее близким к изобретению.по технической сущности  вл етс  способ , заключающийс  в облучении быстрыми нейтронами на Ро-Ве источнике системы четыреххлористьй углерод 2,3-0-анизилиденаденозин-пиридин, при этом атомы фосфора-32, образовавшиес  по  дерной реакции СР ( и,о ) Р стабилизируютс  в форме аденозин-З -монофоефата. Ядерна  рб акци  С ( n,ot ) 32р протекает при облучении быстрыми нейтронами любых хлорсодержащих соединений и имеет следующие преимущества: протекает с изменением пор дкового номера элемента, вследствие чего радиоактивный Р образуетс  в состо нии без носител , т.е. без разбавлени  нерадиоактивными изотопом Р, что позвол ет получать меченные препараты с удельной активностью, близкой к предельно возможной; наличие атомов хЛора в системе способствует протеканию химических реакций, необходимых дл  Получени  целевого продукта. Атомы 2р в момент образовани  имеют кинетическую энергию пор дка 30 кэВ за счет отдачи при испускании об - частицы, вследствие чего они обладают повышенной реакционной способностью и в процессе столкновений с молекулами ССС4 в основном отрывают атомы хлора, образу  хлориды . р ссе. CCf4 32 32 „ -I с Г1ри наличии в системе растворенного кислорода возможно образование хлорокиси фосфора PCPjtl/zOj - 32 РОС8з Образзпощиес  хлориды фосфора фосфорилируют 2 ,3 -0- анизилиденаденозин . После облучени  системы (мишени ) нейтронами защитнью группы удал ют гидролизом и вьщел ют целевой продукт с помощью бумажной хроматографии . Преимуществами известного способа  вл ютс  совмещение в одну стадию  дерной реакции получени  радиоактивного изотопа и необходимых превращений, ведущих к образованию целевого продукта, получение р в состо нии без носител , что позвол ет достичь предельно возможной активности меченных препаратов, существенное упрощение аппаратурного оформлени  и сокращение син теза целевого продукта |,5 J. Однако радиохимический выход 5- Р-АМФ по известному способу недостаточно высок (22-23%) и трудно воспроизводим уз-за сильной завиС1ШОСТИ результатов от степени осушки всех используемых в системе компонентов .. Целью изобретени   вл етс  повышение выхода аденозин-5 -монофосфата меченного фосфором-32. Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получени  аденозин-5 -монофосфата меченного фосфором-32 путем облучени  нейтронами на прлоний-бериллиевом источнике нейтронов смеси, содержащей 2,3-0-анизилиденаденозин, четырех хлористый углерод в качестве хлорсодёржащего соединени  - источника фосфора-32 и органический растворитель с последующим удалением защитных групп гидролизом, в качестве ор ганического растворител  используют N,N-диметилформамид или диметилсульфоксйд в концентрации 0,20 ,5 мол.% и процесс провод т в присутствии конденсирующего агента трихлбрацетонитрила в концентрации 0,5-1,0 мод.%. Облучение провод т в течение 24 .150 ч. Защитные группы удал ют гидролизом . Выход целевого продукта увеличиваетс  до по сравнению с 22-237, в известном способе. Дл  вы снени -,вли ни  добавок на распределение Р в неорганической и органическбй формах облучают системы состава С €84 органический раство- ритель и СС ССРз CN - органический растворитель. Полученные результаты приведены в табл.2 (мишень t). Дл  анализа облученных мишеней и вьзделени  5- Р-АМФ используют бумажную хроматографию. Разделение rtpo вод т восход щим способом при комнат ной температуре на бумаге FN-12, ирпользу  следующие системы растворителей: ацетонитрил - мзфавьина  кислота-вода-аммиак(конц)в соотношении 18:3:6:0,2 (1); 1М CH COOHNH (рН 7,5) т этанол в Соотношении 3:7 (2); изопропиловьй спирт-водааммиак (конц) в соотношении 7:2:1(3) изомасл на  кислота-вода-аммиак (конц) в соотношении 66:33:1 (4). 884 Величины Рр свидетелей в указанных системах растворителей приведены в табл.1. . . Таблица 1 П тна свидетелей обнаруживают обработкой молибдатным раективом б J, а .нуклеотиды кроме того по поглощению в УФ-свете. Радиоактивные сое1динени  фосфора обнар5гживают с пр мощью радиоавтографии на рентгеновской пленке РМ-1 и на установке автоматического радиометрировани  радиоактивных хроматограмм с использованием счетчика -излучени  СБТ-13 с коллиматором шириной 3 мм. Сигнал со счетчика подают на интенсиметрПИ-4 и записывают на потенциометре ЭШ1-09. Скорость прот гивани  хроматограмм составл ет 180 мм/ч. Использовавшийс  дл  облучени  марки ОСЧ дополнительно пропускают через Ькись высшей степени активности и перегон ют, предохран   от влаги воздуха. Органические растворители (N,N-диметилформамид и диметилсульфоксвд), а также трихлорацетонитрил перегон ют над гидратом кальци  и хран т над молекул рнъм ситом 4 А . Облучение провод т при комнатной температуре (15-25 с) в стекл нных колбах на 250 мл, в центре которых с помощью пробирки на пшифе помещают Ро-Ве источник нейтронов интенсивностью около 10Т нейтр/с или на генераторе нейтронов НГИ-5 мощностью около 10 нейтр/с. Врем  облучени  1-6 сут. После облучени  к мишени добавл ют 10 мл дистнлли ,рованнрй воды, тщательно перемешивают и отгон ют основную массу мишени в вакууме водоструйного насоса.

Защитные группы аденозина уда|ДЯют нагреванием с 80%-ной уксусной ислотой при 100°С, кислоту удал ют упариванием в вакууме и остаток хроматографируют в одной из систем растворителей . Зону, соответствующую. 5- Р-АМФ, элюирзпот водой и чистоту целевог о. продукта провер ют хроматографированием в другой системе растворителей. Данные анализа облученных мишеней приведены в табл табл.2.

Таблица 2

Облучение проводили на нейтронном генераторе. Фрсфорилирование в мишен х с добавкой пиридина дает неустойч1:вые и низкие результаты. С целью повышени  вькода 32р 5-ДМФ в систему ввод т различные добавки: триэтиламин, ДМФА, ДМЗС, трихлорацетонитрил в количествах не более 1 мол.%, чтобы свести до минимума их вли ние на распределение фосфора-32 между органической и неорганической формами. ДМФА и триэтиламна желаемо . п эффекта не дают, кроме того, при добавлении Приэтиламина в систему

происходит значительное осмоление, что затрудн ет выделение конечных продуктов. Значительное повышение выхода целевого продукта дает добавка 1 мол.% трихлорацетонитрила.

2,3-0-защищенные производные аденозина очень плохо растворимы в четыреххлористом углероде. В объеме МИШЕНИ (250 мл ) не раствор етс  полностью даже 4 мг 2,3-0-анизилиденаденозина . Поэтому навеску производного аденозина предварительнораствор ют в ДМФА или ДМ50 (около 1 мл) и в виде раствора внос т в мишень . Анализ мишени состава ССР4 12 ,3-0-анизилиденаденозин СС CNДМФА показал, что 40-44% образующего с  по  дерной реакции (п,о6 ) Р фосфрра-32 выдел етс  в виде 5-ТАМФ . Дл  вы снени  вли ни  добавок на распределение фосфора-32 между органической и неорганической формами стабилизации по сравнению с чистым ССР4 проведено облучение и анализ систем состава: CCf4-ССЕ, C/V; ССб ДМФА; €«4-ДМ50- ССЕ4-CCe, CN-ДМФА, ССе4-ССеэ СН-ДМ50, при различных концентраци х добавок. Установлено, что введение указанных веществ в количествах до 1 мол.% практически не вли ет на распределение фосфора32 в системе. Препарат 5- Р-АМФ испытан на устойчивость к ферменту,, избирательно гидролизующему моноэфиры фосфорной кислоты (ФЮ, КФ 3. .1.3.1). Анализ полученных продуктов провод т ме тодом тонкослойной хроматографии на ПЭИ-целлюлозе с последующей радио автографией полученных продуктов. Результаты испытаний -подтвердили структуру препаратов как 5 - Р-АМФ Пример . Смесь 400 г (2,6,моль) ССРд, , 0,004 г () 2,3-О-анизилиденаденозина, 2,88 г (0-,02 моль) трихлорацетонитрила и 0,95 г (0,013 моль) К,К-диметилформамида облучают на Ро-Ве источнике нейтронов мощностью 5-10 нейтр/сек в течение 6 сут. После облучени  основную массу мишени отгон ют под вакуумом водоструйного насоса при температуре не вьше 40°С. Затем в колбу добавл ют 2 мл 80%-ной СНзСООН и нагревают с обратным холодильником на кип щей вод ной бане в течение 15 мин. После этого удал ют кислоту под вакуумом водоструйного насоса при температуре не вьше . Дл  выделени  из остатка 5-Т-А№ его нанос т на бумажную хроматограмму (бумага FN-13) размером мм. На такую же хроматограмму нанос т смесь соединений - свидетелей и обе хроматограммы одновременно злюируют в водной камере в системе растворителей ацетонитрил-муравьина  кислотавода-аммиак (конц.) в соотношении 18:3:6:0,2. После разделени  положение свидетел  5-АМФ определ ют по поглощению в УФ-свете, а остальных соединений - с помощью молибдатного реактива. Путем сравнени  определ ют положени  5 - Р-АМФ на радиоактивной хроматограмме, соответствующую зону злюируют дистиллированной водой . Получают меченный фосфором-32 аденозин-5-монофосфат в состо нии без носител  с общей активностью около 10 МБк. Таким образом, по предлагаемому способу можно получать целевой продукт активностью вплоть до tO МБк путем облучени  мишеней указанного состава на мощном источнике нейтронов или нейтронном генераторе. Эффективность предлагаемого способа по сравнению с известным заключаетс  в увеличении радиохимического выхода целевого продукта до 36-44% вместо 22-23% по известному способу и существенном улучшении воспроизводимости получаемых результатов .

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗЩ,-5' -МОНОФОСФАТА, МЕЧЕННОГО ФОСФОРОМ-32; путем облучения нейтронами на полоний—бериллиевом источнике нейтронов смеси, содержащей 2* ,3*-0-анизилиденаденозин, четыреххлористый углерод в качестве хлорсодержащего соединения - источника фосфора-32 и органический растворитель, с последующим удалением защитных групп гидролизом, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, в качестве’ органического растворителя используют Ν,Ν-диметилформамид или диметилсульфоксид в концентрации 0,20,5 мол.% и процесс проводят в присутствии конденсирующего агента трихлорацетонитрила в концентрации 0,5-4 ,0 мол.%.

   е >

   ί 1 1127888