ел ate
елate
оо Изобретение относиге к медицинской микробиологии и касаетс диагкосгики особо опасных инфекций. Известен способ дифференциации L форм холерных вибрионов и исходных бактериальных форм путем приготовлени взвеси исследуемого материала, выращивани на питательной среде с последук шим исследованием выросших колоний путем приготовлени микроскопических препаратов и исследовани их с помощью фазовоконтрастного микроскопа ij . Однако известный способ не --обеспечивает высокой точности, так как L -фор мы холерного вибриона по морфологии колоний сходны с R -вариантами и под фазовым микроскопом могут обнаруживатьс полиморфные и L -подобные клетки . Кроме того, известный способ позвол ет проводить только качественную диф фepe щиaцию без количественного показател состава попул ции. Целью изобретени вл етс повыше ние точности способа. Эта цель достигаетс тем, что согласно способу дифференциации t, -форм холерных вибрионов и исходных бактериальных форм путем приготовлени взвеси исследуемого материала, выращивани на питательной среде с последующим исследованием выросших колоний, из выросших колоний готов т суспензии, инкубируют их при посто нном встр хивании в течение 50-60 мин, определ ют наличие . малонового диальдегида и по его концентрации дифференцируют L -ч})Ормы и их ревертанть первых пассажей и исходные бактериальные формы холерных вибрионов. Пример, Из колоний, подо- зрительных на 1, -форму, берут материал и готов т взвесь на трис - НСЙ -буфере. Суспензию инкубируют в термостате около часа при посто нном встр хивании. Реакцию останавливают О,1 мл 10О 6-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ), затем к пробам добавл ют 2 мл 30%-ной ТХУ) О,2 МП 5 М сол ной кислоты (НСС)и 2 м T),75%HioA тиобарбитуровой кислоты, сшв г н, ор чую вод ную баню на 15 мин. При наличии в пробей.- форм хоиерного вибриона развиваетс окраска от рко желтой до оранжевой. Интенсивность образующейс окраски .измер ют на спектрофотометре при длине волны 535 нм или на фотоэлектроколориметре с эетеным светофильтром . Количество образовавшегос малонового диальдегида вычисл ют по формуле: ( г-м Е« Ю СЖ Юз. 1,56.10.5 где С - концентраци малонового диальдегида , нмоль/млрд микробных клеток (м. кл.); Е - показани спектрофотометра (экстинци ), 1, - мол рный коэффициент экстинции дл малонового диальдегида . В работу бьти вз ты 7 штаммов L форм холерных вибрионов и их исходные варианты -3933, 3935, 3943 - серотипа Инаба, 4608,4616, 4617, 4661серотипа Огава. В таблице представлена дифференциаци L - форм, ревертантов и исходных бактериальных форм в зависимости от конценчтраций малонового диальдегида. Концентраци малоноврго диальдегида (МДА) .выше 0,1 нмоль/млрд.м.кл. достоверно свидетельствует о наличии в пробе ревертантов холерных вибрионов, а выше ,6 нмоп;ь/млрд.м.кл - их L -форм Kov ичество МДА у бактериальных форм коебалось от О до О,06 нмольАшрд.м,кл, Минимальное количество L, -форм холерных вибрионов, которые можно определить соответствует 1 млрд,м.кл,мл, Использование изобретени позволит повысить точность определени , установить онцентрацию возбудител в различной орме в одной попул ции, кроме того, пределить в какой форме изменчивости иркулирует возбудитель.OO The invention relates to medical microbiology and concerns the diagnosis of especially dangerous infections. There is a method of differentiating the L forms of Vibrio cholerae and the original bacterial forms by preparing a suspension of the material under study, growing it on a nutrient medium with a subsequent study of the grown colonies by preparing microscopic preparations and studying them using a phase-contrast microscope ij. However, the known method does not provide high accuracy, since the L-forms of Vibrio cholerae are similar to the R-variants in the morphology of the colonies, and polymorphic and L -like cells can be detected under a phase microscope. In addition, the known method allows only qualitative differentiation to be performed without a quantitative measure of the composition of the population. The aim of the invention is to improve the accuracy of the method. This goal is achieved by the fact that, according to the method of differentiating t, the forms of Vibrio cholerae and the original bacterial forms by preparing a suspension of the material under investigation, growing on a nutrient medium followed by a study of the grown colonies, suspensions are prepared from the grown colonies, incubated with constant shaking within 50-60 minutes, the presence is determined. malonic dialdehyde and its concentration differentiate L -h}) Orms and their revertant of the first passages and the original bacterial forms of Vibrio cholerae. Example: From the colonies suspected of 1, -form, material is taken and a suspension is prepared in a tris-NSY buffer. The suspension is incubated in a thermostat for about an hour with constant shaking. The reaction is stopped with O, 1 ml of 10O 6-th trichloroacetic acid (THU), then 2 ml of 30% TCA) O, 2 MP 5 M hydrochloric acid (HCC) and 2 m T), 75% HioA are added to the samples. thiobarbituric acid, a water bath for 15 min. In the presence of samples. The forms of the hoirie vibrio develop from bright yellow to orange. The intensity of the color formed is measured on a spectrophotometer at a wavelength of 535 nm or on a photoelectrocolorimeter with an e ен light filter. The amount of malonic dialdehyde formed is calculated by the formula: (gm E "U SZH Yuz. 1.56.10.5 where C is the concentration of malonic dialdehyde, nmol / billion microbial cells (mcl.); E - spectrophotometer readings (extinction) , 1, is the molar extinction coefficient for malonic dialdehyde. 7 strains of L forms of Vibrio cholerae and their initial variants -3933, 3935, 3943 - Inaba serotype, 4608.4616, 4617, 4661 Serotype Ogawa were taken into operation. The table shows the differentiation L - forms, revertants and initial bacterial forms, depending on concentration, are few Newly dialdehyde. The concentration of malonely dialdehyde (MDA). Higher than 0.1 nmol / billion mcl reliably indicates the presence of cholera vibrios in the sample of revertants, and above, six nmop; l / billion mcl - their L-forms Kov quality of MDA in bacterial forms from 0 to 0, 06 nmAhrd.m, cl, Minimum L, -vibrio forms of cholerae, which can be determined corresponds to 1 billion, mcl, ml. Using the invention will improve the accuracy of determination, establish oncentration exciter in a different form in one population, in addition, to limit in what shape variability irkuliruet pathogen.
. Концентраци малонового Штаммы диальдегида, нмоль/млрд.м.кл. Concentration of malondial dialdehyde strain, nmol / bcm
i Продолжение таблицыi Continuation of the table