SU1049810A1 - Способ определени активности моноаминоксидазы в тромбоцитах - Google Patents

Abstract

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МОНОАМИНОКСИДАЗЫ В ТРОМБОЦИТАХ путем инкубировани  исследуемого фермента с субстратом в присутствии индикатора , с последующим измерением его флуоресценции, отличающийс  тем, что, с целью пов лие-г ни  чувствительности способа при диф ференциальной диагностике психопатологических состо ний, вьщел ют митохондрис )льные мембраны тромбоцитов, далее добавл ют -210 М пероксидаэы и инкубацию провод т при 36 в течение 15-20 мин, затем в реакционную смесь одновременно внос т субстрат моноаминоксидазы и скополитин . повторно инкубируют, при S 36 - в течение20 - 50. мин и (П измер ют величину флуоресценции скополитина до и после инкубации. 2. Способ по п. 1, отли ч а ющ и и с   тем, что, в качестве субс стратов моносиъшноксидазы используют фенилэтилсшин, бензиламин или триптамин . 4 СО 00

Description

Изобретение относитс  к медицине в частности к ферментному анализу крови человека, и может быть использовано в медицинской практике при изучении биохимических показателей крови в клинике и эксперименте. Известен способ определени  -активности моноаминоксидазы в тромбоцитах человека, основанный на способности алкогольдегидрогеназы из тканей млекопитаквдих катализировать восстановление альдегидов, образующихс  при окислительном дезамиинровании аминов до соответствующих спир тов в присутствии НАДН 1. Недостатком способа  вл етс  его низка  чувствительность. Известен также способ определени  активности моноаминоксидазы путем инкубировани  исследуемого фермента с субстратом, .добавлением индикатора с последующим измерением его флуорес ценции 2. Однако известный способ имеет низкую информативную ценность, так как в качестве субстрата можно использовать только- бензиламин, в то врем  как по современным представлени м необходимо исследовать актив ность моноаминоксидазы с нecкoльки ш субстратамк, особенно в услови х патологии . Кроме того, 1,2-диаминонафтален , используемый в качестве индикатора в известном способе/  вл етс  сильно действующим канцерогенным веществом о Целью изобретени   вл етс  повыше ние чувствительности способа при диф ференциальной диагностике психопатологических состо ний. Поставленна  цель достигаетс  тем что согласно способу определени  активности моноаминоксидазы в тромбоцитах путем инкубировани  исследуемого фермента с субстратом в присутствии индикатора с последующим измерением его флуоресценции, вьшел ют митохондриальные мембраны тромбоцитов , далее добавл ют 110 -210 М пероасидазы и инкубацию провод т при Зб-Зв С в течение 15 - 20 мин, затем в реакционную смесь одновременно вно с т субстрат моноаминоксидазы и скопо итин . повторно инкубируют при 36 - 38°С в течение 20 - 50 мин и из мер ют величину флуоресценции скополитина до и после инкубации. Кроме того, в качестве субстратов моноаминоксидазы используют фенилэтиламиНу бензиламин или триптамин. Способ осуществл ют следующим об разом.. Из крови испытуемого вьщел ют тромбоциты, из которых получают мито хондриаЛьныв мембраны. Реакционную смесь, содержащую исследуемые фраг менты митохондриальных мембран (О.Щ, 0,2 ми белка), пероксидазу из хрена (1- 10 -2-10 М) , калий-натрий фосфат- , ный буфер 0,2 М с рН 8,4 до конечного объема 1 мл, инкубируют в течение 15 - 20 мин при 36 - с качанием в аппарате Варбурга дл  удалени -эндогенных субстратов пероксидазы. После охлаждени  проб дл  определени  активности моноаминоксидазы к реакционной смеси одновремейно добавл ют субстрат фермента; фенилэтиламин, бензиламин или триптамин, в насыщающих концентраци х искополитин с последующим измерением величины флуоресценции екополитина. Далее пробы инкубируют в течение 20 - 5Q мин при 36 - . Реакцию останавливают помещением проб в лед ную баню и определ ют величину тушени  флуоресценции екополитина. Удельную активность моноаминоксидазы выражают в нмоль №20, образовавшейс , в ходе окислительного дезаминировани  аминов на 1 мг белка за 20 - 50 мин повторного инкубировани  в описанных услови х. Пример. Суспензию фрагмен-. |тов митохондриальных мембран тромбоцитов 0,01 мг в объеме 0,5 мл натрийкалий фосфатного буфера рН 8,4 помещают в 0, этого же буфера, содержащего 10м пе.роксидазы из хрена и инкубируют 15 мин при с качани ми в аппарате Варбурга. После охлаждени  в лед ной .бане в реакцион-. ную.смесь одновременно добавл ют .скополитин в концентрации 17 нмоль на 1 мл и бензила н 2,5-10 М, после чего пробы инкубируют 50 мин при в аппарате Варбурга. После охлаждени  проб измер ют величину тушени  флуоресценции екополитина при длине вЪлны 460 нм, при длине волны возбуждени  350 им и наблюдают генерацию 32 нмоль HjOg на 1 мг белка. П р и м ё р 2. Реакционную смесь,, содержащую фрагменты митохондриальных мембран тромбоцитов 0,05 мг в объеме 0,5 мл натрий-калий фосфатного буфера рН 8,4, пероксидазы 2 10 М в 0,35 мл этого же буфера, инкубируют 20 мин при в аппарате Варбурга . После охлаждени  реакционной смеси в нее одновременно добавл ют скополитин в концентрации 17 нмоль на 1 мл пробы и фенилэтиламин , после чего пробы повторно инкубируют в течение 20 мин при 38°С, охлаждают, измер ют величину тушени  флуоресценции екополитина и наблюдают генерацию 13,1 нмоль на 1 мг белка. Примерз. Суспензию фрагментов митохондриальных мембран тромбоцитоЕ 0,02 мг в объеме 0,5 мл натрийкалий фосфатного буфера рН 8,4 помеают в 0,35 мл этого же буфера, , содержащего 210М пероксидазы, иикубируют 15 мин при . Далее в ох/лажденную реакционную смесь добавл ют скополитин 17 нмоль на 1 мл и триптамин 10 М и измер ют величину флуоресценции скополитина. Затем реакционную смесь повторно инкубируют, 40 мин при , охлаждают и измер вют флуоресценцию скополитина и по . изменению флуоресценции определ ют

активность моноаминоксидазы. При этих услови х наблюдают генерацию 27,9 нмоль бeлka.

Предлагаемый способ нетоксичен, обладает высокой чувствительностью, может быть использован в психиатрии при диагностике различных психических заболеваний и оценке эффектив.ности лечени .

I

Claims (2)

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МОНОАМИНОКСИДАЗЫ В ТРОМБОЦИТАХ путем инкубирования исследуемого фермента с субстратом в присутствии индикатора, с последующим измерением его флуоресценции, отличающийся тем, что, с целью повыше-, ния чувствительности способа при дифференциальной диагностике психопатологических состояний, выделяют митохондриальные мембраны тромбоцитов, далее добавляют 1· 10~⁷-2 · 1О’^?М пероксидазы и инкубацию проводят при 36 38°С в течение 15-20 мин, затем в реакционную смесь одновременно вносят субстрат моноаминоксидазы и скополитин, повторно инкубируют· при 36 - 38^аС в течение'20 - 50. мин и измеряют величину флуоресценции скополитина до и после инкубации.

2. Способ поп. 1, отли ч а ющ и й с я тем, что, в качестве субстратов моноаминоксидазы используют фенилэтиламин, бензиламин или трип тамин.

J .,1049810 >