4 «ЭР Изобретение относитс к способу получени осФоамндов моно- или оли гонуклеотидов, которые широко используютс в биоорганической химии и молекул рной биологии в качестве исходных соединений дл получени соответствующих ди- и трифосфатов, реагентов .дл аффинной модификации белков и нуклеиновьГх кислот, а также дл химической сборки полинуклеотидов в матрично-направленных р еакци х. Кроме того, соединени этого класса, содержащие в своем составе остаток аминокислоты или пептида, используютс в молекул рно-биологических исследовани х в качестве моделей природных нуклеопротеидов. Известен способ получени з- или 3 -фосфоамидов моно- или олигонуклео тидов путем взаимодействи смешанных ангидридов с мезитиленкарбоновой кис лотой С 1 }. Сначала получают смешанный ангидрид нуклеотида и мезитиленкарбоново кислоты при действии хлорангидрида кислоты в безводном пиридине, затем избыток реагента удал ют экстракцией эфиром и к остатку добавл ют аг/шн либо в водном, либо в безводном раст воре. Если aMtiH добавл ют безводным, процесс заканчиваетс через несколько часов, а в водной среде - -через 2-3 сут. Дл проведени первой стадии - получени смешанного ангидрида необходимо предварительно переводить моно-г или олигонуклеотид в соответствующую растворимую в пиридине форму , например, три-н- алкиламг-ганиевую. Этот способ практически нельз приме н ть дл пoлyчe и амидов олигонукле отидов рибор да, так как в результате ацилировани межнуклеотидних фосфатных групп в значительной мере про исходит разрыв и изомеризадр межнук леотидних св зей. Кроме того,при работе со слабыми af4HHatvM эффективность способа заметно понижает с . Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту вл етс способ получени 5-или З-фосфоамидов моно- или олигонуклеотидов, заключающийс в конденсации нуклеотидной компоненты (пиридиниевой или три-н-алкиламмонийной соли моно- или олигонуклеотида ) с безводным амином.в безводном органическом растворителе (безводный пиридин или диметилформаглид ) в присутствии производного карбОдиимида (дициклогексилкарбодиимида ). Процесс протекает в течение 2-3 сут при 37-. Выход целевого продукта 50-80% 2 . Недостатком известного способа по лучени вл етс относительно низкий выход целевого продукта. При длитель ном выдерживании олигонуклеотидов в безводных растворител х в присутствии дициклогексилкарбодиим да происходит нежелательна модификаци межнуклеотидных фосфатных групп, причем степень модификации возрастает с увеличением длины олигонуклеогида. Недостатком способа вл етс также необходимость проведени процесса в безводном растворителе, так как дл крупных олигонуклеотидных блоков . практически невозможно количественно перевести олигонуклеотид Врастворимое в органическом растворителе состо ние . Кроме того, указанный способ не дает возможности получать амиды, содержащие в своем составе остатки сильных аминов, значение рК которых более 10, что св зано, с одной стороны , с плохой растворимостью о.чигонуклеотидов при добавлении таких аминов и с другой стороны, с низкой реакционной способностью дициклогексилкарбодиимида в присутствии сильных амиЦелью изобретени вл етс упрощение процесса и увеличение выхода целевого продукта. Цель достигаетс согласно способу получени 5- или 3-фосфоамидов моно- или олигонуклеотидов, заключаю (емус в конденсации в водной среде водорастворимых солей нуклеотидов с водным раствором амина с рН 4,5-10 при условии, что рН раствора амина на ,1 меньше РК амина, в присутствии конденсирующего агента - 1-этил-3- (З-диметиламинопропил )карбодиимида . Выход целевого продукта 85-100%. При рН, меньашх 4,5, начинаетс конкурентна реакци гидролиза образующегос фосфоамида, в результате чего вьлход фосфоамида понижаетс . Существенныг4И отличи ми предлагаемого способа получени вл етс использование в качестве нуклеотидной компоненты водорастворимых солей нуклеотидов , в качестве растворител воды , в качестве производного карбодиимида-1-этил-З- (З-диметиламинопропил )-карбодиимид, в качестве аминной компонентЕз - водного раствора амина с рН 4,5-10, при условии, что рН раствора амина на 1±0,1 меньше рК амина. Пример 1. К1 мкмоль N а-соли (10 , упаренный до масла , водный раствор добавл ют 100 мкл 3 М водного раствора имидазола (рКд 7,0), предварительно титрованного с помоцью б н. водной сол ной кислоты до рН 6,0. Затем добавл ют -10 мг (50 мкмоль ) 1-этил-3-(З-диметиламинопропил )кapбoдии /IИдa и через 2 ч при 20°С полученную смесь фракционируют с помощью электрофореза на бумаге в 0,05 М три этил амг юнийном буфере с рН 7,5-8,0. Выход имидазольного производного дезокситимидиловой кислоты практически количественный. Полученное соединение идентифицируют с образцом , полученным ранее другим способом . П р и м е р 2. Водный раствор c3(TC,G,CCAAGerp)M н - соли, содержа щий 1 OE2fQ, 10 нмоль вещества, упаривают до масла, добавл ют 100 мкл 3 М водного раствора морфолина рК 8,3), предварительно титрованного с помощью 6 н. водной-HCl до рН 7,25. Зате. добавл ют 10 мг {50 мкмоль| 1-этил-З- (З-диметилаг-шнопропил/карбо диимида и после выдерживани получен ной смеси в течение 5 ч при 20°С олигонуклеотидную фракцию выдел ют из смеси путем гель-фильтрации на биогеле Р-2. Анализ олигонуклеотидов выполненный методом микроколоночной хроматографии на анионообменной смоле , свидетельствует о том, что морфолид декануклеотида получают с выходом 90%. Пример 3.-Водный раствор (pA-j ) в виде Na-соли (2 20 нмольj упаривают до масла и до-, бавл ют 100 мкл имидазола (,о) титрованного до рН 6,0 с помощью 6 н. водного раствора сол ной кислоты . Затем добавл ют 10 мг (50 мкмоль) 1-этил-З-(3-диМетиламинопропил)-карбодиимида и после выдерживани полученной смеси в течение 3 ч при 20 °С олигонуклеотиды обессоливают методом гель-фильтрации на биогеле Р-2. Анализ олигонуклеотидной фракции, выполненный методом микроколоночной хроматографии на анионообменнике, свидетельствует о том, что имидазолид гептаадениловой кислоты получают с выходом 85%, Данные дл других примеров получени амидов моно- и олигонуклеотидов представлены в таблице.
Примечание. Во всех случа х, указанных в таблице, концентраци
карбодиимида 0,5 М, концентраци амина - 3 М,-реакционна среда - вода.
Приведенный пример. К раствору . амида добавл ют 17 мкл (0,2 ммольj 4 мг (0,01 ммоль } пиридиниевой соли . морфолина и 20 мг (0,1 ммоль ) дицикdfpT в 0,2 мл безводного диметилформ- 5 логексилкарбодиимида. Реакционную
S1049498®
смесь выдерживают 3 сут при комнат-фильтровывают и из водного сло метоной температуре и добавл ют 0,5 млдом бумажной хроматографии или элекводы . Через 10 ч избыток карбодиими-,трофореза выдел ют морфолид дезоксидй экстрагируют эфиром, мочевину от-тимидиловой кислоты с выходом 50%,