со оwith about
4 Изобретение относитс к микробиологии , в частности к способам диффаренциации штаммов холерных вибрионов , и может быть использовано в диагностических и научно-исследовательских цел х. Известен способ внутривидовой дифференциации vibrio cholerae биотипа Эль Тор путем выращивани микроорганизмов на питательной среде в толще агара в присутствии индикатора чувствительных, к вибриоцину микроорганизмов , с последующей дифференциацией по литической активности - величине зоны лизиса индикаторного штамма tl Однако известный способ сложен в осуществлении. Целью изобретени вл етс упрощение способа, Эта цель достигаетс тем, что сог ласно способу внутривидовой дифферен циации vibrio cholei a-e. биотипа Эль Тор путем выращивани микроорганизмов на питательной среде в присутствии индикатора с после 1ующей дифференциацией по литической активности, выращивание осуществл ют на поверхности питательной среды, содержащей в качестве индикатора дезохсихолат натри в концентрации 0,5-3 мг/мл среды. Способ осуществл ют следующим образом . Одну петлю агаровой культуры засевают в 5 мл бульона (рН 7,7-7,8), выращивают 4 ч при 37°С. Затем одну каплю полученной бульонной культуры нанос т на поверхность агара Мартена содержащего дезоксихолат натри . Рецепт приготовлени агаровой среды: :iнавеска 50 мг дезоксихолата натри вноситс в 100 мл растопленного агара Мартена (рН 7,6-7,8). Среду разли вают в 5 чашек Петри, после застывани агар совершенно прозрачный. Чере сутки выращивани при 37°С .культуру убивают парами 40%-ного формалина в течение 48 ч, помещй смоченную формалином вату в крышку, чашки Петри при кЪмнатной температуре. Учитывают результаты после удалени ваты-с фор малином. Среда приобретает молочносерую окраску, непрозрачна . Вокруг колоний культуры образуетс зона пр светленй агара в виде ореола. Каждый штамм холерного вибриона имеет Х рактерный ореол и различаетс по величине, степени прозрачности и по количеству ободков мутных и прозрач ных. По количеству ореолов холерные штаммы дифференцируютс на 2 типа; Iтип - образующие один ореол, и IIтип - 2 ореола; по величине ореолов: 6 размеров - 0,5-1-1 f5-2-34 мм; по степени прозрачности на 3 типа - мутный, полупрозрачный и про рачный. Так, штамм 517/130 образует один узкий (1 мм), мутный ореол, что свидетельствует о его сл,абой литической активности. То есть величина ореола при измерении радиуса от кра макроколонии до кра плотной среды у штаммов, обладающих слабой литической активностью, будет 0,5-1 мм, и возрастает от 2 до 4 мм у активных по лизису культур. По этому признаку штаммы легко дифференцируютс 1между собой. Так же культуры, образующие два ореола, отличаютс .от кульТур с одним ореолом. Но и внутри штаммов, имеющих два ореола, возможна дифференциаци . Так, штамм 2635 образует у кра колонии прозрачный узкий ореол (1 мм), а потом мутный (1,5 мм), в то же врем штамм 8556 полупрозрачный широкий ореол (3 мм) и узкий мутный (1 мм). Пр и м е р 1. Отсевают в две пробирки с 5 мл бульона по одной петле агаровых культур вибрионов Эль Тор 9949 и 517/130. Выращивают в течение 4 ч при 37°С так, чтобы концентраци микробных клеток составл ла И«10°-,П10 кл/мл.Готов т плотную питательную среду,содержащую 0,5 мг/мл дезоксихолата натри , дл чего навеску 50 мг дезоксихолата натри раствор ют в 100 мл агара Мартена и разливают в 5 чашек Петри по 20 мл. На подсушенный агар на рассто нии 4 см друг от друга нанос т по одной капле выросших бульонных культур и став т в термостат при 37°С на сутки. Затем посевы культур убивают парами формалина путем нанесени 4б%-ного раствора формалина на тонкий слой ваты, помещенной в крышку чашки Петри . Чашки оставл ют при комнатной температуре 48 ч. Учитывают результаты по наличию и величине (в мм) зоны просветлени вокруг макроколоний сравниваемых штйммов. Штамм вибрионов Эль Тор образует широкий (2 мм) прозрачный ореол просветлени в агаре. Штамм 517-130 образует узкий (1 мм) мутный ореол вокруг макроколонйи.. П р и м е р 2. Отсевают в две пробирки с 5 мл бульона по одной . петле агаровых культур вибрионов Эль Тор 9949 и 517/130. Выращивают в течеТние 4 ч при . Готов т плотную питательную среду с 1 мг/мл дезоксихолата натри , дл чего навеску 100 мг дезоксихолата натри раствор ют в 100 мл агара Мартена и разливают в 5 чашек Петри по 20 мл. Посев и учет провод т так же, как в. примере 1. Пример 3. Отсевают в 2 пробирки С 5 мл бульона по одной петле аГаровых культур вибрионов Эль Трр 9949 и 517/130, Выращивают в течение 4 ч при 37 С. Готов т плотную питательную среду с 2 мг/мл дизоксихолата натри . Дл этого навеску 20 мг дезоксихолата натри раствор ют в 100 мл агара Мартена и разливаюг в 5 чашек Петри по 20 мл. Посев и учет провод т так же, как в примере 1.4 The invention relates to microbiology, in particular to methods for differentiating the strains of Vibrio cholerae, and can be used for diagnostic and research purposes. The known method of intraspecific differentiation of vibrio cholerae biotype El Tor by growing microorganisms on a nutrient medium in the agar layer in the presence of an indicator sensitive to microorganisms sensitive to vibriocin, followed by differentiation of the political strain tl of the indicator strain is difficult to implement. The aim of the invention is to simplify the method. This goal is achieved in that it is in accordance with the method of intraspecific differentiation of vibrio cholei a-e. Biotype El Tor by growing microorganisms on a nutrient medium in the presence of an indicator with the following differentiation of political activity, the cultivation is carried out on the surface of a nutrient medium containing sodium deoxycholate in a concentration of 0.5-3 mg / ml of medium as an indicator. The method is carried out as follows. One loop of agar culture is seeded in 5 ml of broth (pH 7.7-7.8), grown for 4 hours at 37 ° C. Then, one drop of the resulting broth culture was applied to the surface of Martin agar containing sodium deoxycholate. Recipe for preparation of agar medium: A suspension of 50 mg of sodium deoxycholate is added to 100 ml of melted Martin-agar (pH 7.6-7.8). The medium is poured into 5 petri dishes, after hardening the agar is completely transparent. After one day of cultivation at 37 ° C. The culture is killed in 40% formalin vapors within 48 hours, place the cotton wool moistened with formalin in a lid, Petri dishes at an indoor temperature. Take into account the results after removing the cotton-formalin. Wednesday acquires milk-gray color, opaque. Around the colonies of the culture, an area of light agar in the form of a halo is formed. Each strain of Vibrio cholerae has an X-ray halo and differs in size, degree of transparency, and number of opaque and transparent rim. By the number of halos, cholera strains are differentiated into 2 types; Ityp - forming one halo, and IItip - 2 halo; largest halos: 6 sizes - 0.5-1-1 f5-2-34 mm; according to the degree of transparency of 3 types - turbid, translucent and translucent. Thus, strain 517/130 forms one narrow (1 mm), turbid halo, which indicates its length, aboy of lytic activity. That is, the magnitude of the aureole when measuring the radius from the edge of a macrocolony to the edge of a dense medium in strains with weak lytic activity will be 0.5–1 mm and increases from 2 to 4 mm in cultures active in the lysis. According to this feature, the strains are easily differentiated 1 in between. Similarly, cultures forming two halos are different from single halo cultures. But even within strains that have two halos, differentiation is possible. Thus, strain 2635 forms a transparent narrow halo (1 mm) at the edge of the colony, and then a turbid (1.5 mm), while the strain 8556 is a translucent wide halo (3 mm) and narrow turbid (1 mm). Example 1. They are screened in two tubes with 5 ml of broth, one loop each of the agar cultures of El Tor 9949 and 517/130 vibrios. It is grown for 4 hours at 37 ° C so that the concentration of microbial cells is 10 ° -, P10 cells / ml. A dense nutrient medium containing 0.5 mg / ml sodium deoxycholate is prepared, so that 50 mg of deoxycholate is weighed Sodium is dissolved in 100 ml of Marten's agar and poured into 5 Petri dishes 20 ml each. On a dried agar at a distance of 4 cm from each other, one drop of grown broth cultures was applied and placed in a thermostat at 37 ° C per day. Crops of cultures are then killed with formalin vapors by applying a 4b% formalin solution to a thin layer of cotton placed in the lid of a Petri dish. The plates are left at room temperature for 48 hours. The results for the presence and size (in mm) of the clearing zone around the macrocolonies of the compared strikes are taken into account. Vibrio strain El Tor forms a wide (2 mm) transparent aura of enlightenment in agar. Strain 517-130 forms a narrow (1 mm) turbid halo around the macrocolony. EXAMPLE 2. Filter in two tubes with 5 ml of broth, one at a time. loop agar cultures vibrios El Tor 9949 and 517/130. Grown for 4 hours at. A dense nutrient medium is prepared with 1 mg / ml sodium deoxycholate, for which a portion of 100 mg sodium deoxycholate is dissolved in 100 ml of Martin agar and poured into 5 petri dishes 20 ml. Sowing and recording are carried out in the same way as in. Example 1. Example 3. Eliminated in 2 tubes of 5 ml of broth, one loop of agar cultures of vibrios El Trr 9949 and 517/130, are grown for 4 hours at 37 C. A dense nutrient medium is prepared with 2 mg / ml sodium dysoxycholate. To this end, a portion of 20 mg of sodium deoxycholate is dissolved in 100 ml of Martin agar and bottled in 5 20 ml Petri dishes. Sowing and recording are carried out as in Example 1.
Предлагаемый способ дает возможность легко дифференцировать как типичные штаммы холерных вибрионов, так и мутанты, полученные различны ми методами. При этом облегчает дифференциаци шхаммов одного серо .вара и фаговара, что вл етс крайне удобным при Проведении генетических исследований, когда отсутствие отличительных признаков не позвол ет использовать компетентные доноры и реципиенты . Кроме того, способность к продукции вибриоцина про вл етс у штаммов только после 10-15 пересевов на жидких и плотных питательных средах.The proposed method makes it possible to easily differentiate both typical strains of Vibrio cholerae and mutants obtained by different methods. At the same time, it facilitates the differentiation of shhammas of a single sero-wara and phagowara, which is extremely convenient when conducting genetic studies, when the absence of distinctive signs prevents the use of competent donors and recipients. In addition, the ability to produce vibriocin appears in the strains only after 10–15 transfers on liquid and dense nutrient media.
Эффектив-ность предлагаемого способа составл ет 100%, в то врем как по известному способу ни is йДиом слу0 чае не удаетс вы вить вибриоцины у заведокю известных продуце тоЪ с использованием в качестве И21дикаторных культур типичньсс шта1ммов холерных вибрионов.The efficiency of the proposed method is 100%, while by a known method it is not possible to isolate vibriocins in the headquarters of well-known producers using typical stem cholesterol cholesterol vibrions as I-indicator cultures.