4four
00 00 Изобретение относитс к способам получени -биомасс, обогащенных биоло гически активными веществами. Известен способ получени биомасс микроорганизмов с РНК-лигаэной актив ностью, где в качестве продуцента ис пользуют E.Coli В, а в качестве индуктора РНК-лигазы фаг. Т Выход биомассы не указан. Активность РНКлигазы 3,7 ед. на мг белка 1. Наиболее близким к предлагаемому вл етс способ заключающийс в том, что биомассу с полинуклеотидкиназнрй активностью получают культивированием бактерии E.Coli В на питательной среде, содержащей г/л; аммоний хлори тый 1; магний сернокислый 0,13; калий фосфорнокислый однозамещенный 3, натрий фосфорнокислый двузамещенный 6,0; глюкоза 4,0; казаминовые кисло .ты 2,0. Температура выращивани 37 С. Услови индукции ферментов фагом: плот ность культуры E.Coli 2 l0 клeтoк7мл множественность инфекции 4 фаговых частицы на клетку. В качестве биости мул тора добавл ют триптофан 0,01 г/ Накопление фермента провод т в течение 12 мин после инфекции фагом. Выход биомассы 2,5 г/л. Активность полинуклеотидкиназы 40 ед/мг белка 2. Однако при этом сравнительно низкий выход биомассы, так как на стади х инфицировани культуры и постинфекционной инкубации не обеспечены УСЛОВИЯ дл интенсивного протекани процесса. Цель изобретени - повышение выхо да биомассы. Поставленна цель достигаетс тем что в способе получени биомассы E.Coli В на питательной среде, содер жащей источники углерода и азота, ми неральные соли и ростовые факторы, в питательную среду дополнительно ввод т глутатион в концентрации 0,01 0,015 г/л, инфицирование биомассы фа гом ат№ 82 осуществл ют при плотности культуры 3,0-3,3-10 клеток/мл культуральной жидкости, а постинфекционную инкубацию провод т в течение . 28-30 мин при рН 7,5-7,6. 1 Пример. Культуру E.Coli В выращивают на питательной среде следующего состава, г/л: NH/C11,0+1,2 MgS04-7H20 0,13+0,15 .3,0+3,5 КН2Р04 9,0+10,0 Na2HPO4 Глюкоза10,0+15,0 Гидролизат казеина8,0-1,0,0 Дрожжевой экстракт 1,0-1,2 рН7,2-7,4 Глюкозу ввод т в питательную среду в виде стерильного раствора. Провод т культивирование в услови х принудительной аэрации до тех пор, пока плотность культуры достигнет 3,0-3,3-10 клеток/мл-культуральной жидкости, и осуществл ют инфицирование фагом из расчета 2 фаговые частицы на 1 клетку бактерии, одновременно добавл ют глутатион в концентрации 0,010-0,015 г/л и продолжают культивирование 28-30 мин, поддержива рН 7,5-7 ,6. Процесс прекращают охлаждением культуральной жидкости др 5с. Выход биомассы 7,0-8,5 г/л г Активность псэлинуклеотидкиназы 45-47 ед/мг бел Активность РНКлипазы5 ,5,2 ед/мк белка . П р и м е р 2. Питательна среда содержит, г/л: NH4C1. 1,2 MgSO.-7H90 0,13 КН„Р343,.0 ЫаьНР049 ,0 Глюкоза . 15,0 Гидролизат казеина10 ,0 Дрожжевой экстракт 1,2 рН .7,2-7,4 Глюкозу ввод т в питательную среду в виде стерильного раствора. Выращив ание Е.Со11 В. 1) Инокул ци посевного материала. Культура E.Coli В поддерживаетс на столбиках МПА вазелиновым маслом, пересеваетс один раз в 4 мес ца. Дл подмолаживани культуру засевают в 100 мл основной среды с содержанием глюкозы 0,5 г/л, инкубируют 10-12,4 при 37±1°С стационарно. Инокул т,готов т , пересева 10-12 часовую культуру на 1 л свежей среды с содержанием глюкозы 1,0 г/л из расчета 1: 8 и выращивают в течение 4-5 ч в услови х аэрации. 2) Ферментаци культуры E.Coli В производитс после добавлени ViHOKyл та 1:20 по отношению к объему среды . Ферментаци производитс при 37±1°С в услови х принудительной аэрации (2 л воздуха на 1 л питатеЛьной среды) . ; 3) Инфицирование E.Coli В фагом T.cim82. Когда плотность культуры достигает З ЗхЮ клеток/мл (по калибровочной кривой), прекращают аэрирование , добавл ют суспензию бактериофага из расчета 2 фаговые частицы на 1 клетку бактерии, т.э. 6, на 1 мл культуральной жидкости. Одновременно добавл ют глутатион 0,015 г/л. 4) Постинфекционнре инкубирование провод т при рН 7,5-7,6, регулируемое раствором и аэрации 2л воздуха на 1, л питательной среды в течение 28 мин, после чего быстро охлаждают культуральную жидкость до 5°С. 8,5 г/л, Выход биомассы Активность по47 ед/мг белка линуклеотидкинаэы . Активность РНК5 ,0 ед/мг белк липазы , П р и м е р 3. Питательна среда содержит, г/л: NH4Ci1,S MgSQa-7H2O0,15 КН„Р043,5 NajHPO 10,0 Глюкоза10,0 Гидролизат казеина8,0 Дрохркевой экстракт1,0 рН7,2-7,4 Введение глюкозы, инокул ци посе ного материала, ферментаци культуры подобны примеру 1... Инфицирование E.Coli В фагом провод т,когда плотность культуры до тигает З-Ю клеток в мл,добавл ют су пензию бактериофагаиз расчета 2 фаговые частицы на 1 клетку бактерии, т.е. на 1 мл культуральной жидкости, глутат.ион добавл ют в коли честве 0,01 г/л. Постинфекционную ин кубацию провод т 30 мин. Выход биомассы 0,7 г/л. Активность полинуклео гидкинаэы 45 ед/мг белка. Активность РНК липазы 5,2 ед/мг белка. П р и м е р 4. Питательна среда, введение глюкозы, инокул ци посевного материала, ферментаци культуры IE.Coli Вподобны примеру 1. Инфицирование E.Coli В фагом Т.ат 82 провод т , когда плотность культу/ры достигает 3,2-10 клеток в 1 мл кулЬтуральной жидкости, добавл ют суспензию бактериофага из расчета 2 фаговые частицы на 1 клетку бакте ии т.е. 6,4-l(FEOE на 1 мл культуральной жидкости, глутатион добавл ют в количестве 0,013 г/л. Прстинфекционную инкубацию провод тГ в течение 29 MHk. Выход биомассы 8,0 г/л. Активност полинуклеотидкиназы 46 ед/мг белка. Активность РНК-лигазы 5,1 ед/мл.белка . Применение предлагаемого способа обеспечивает хороший выход биомассы (7,0-8,0 г/л) с активностью полинуклеотидкиназы 45-47 ед/мг белка и РНКлипазы 5-5,2 ед/мг белка. Выращивание культуры до плотности клеток 3-3,3x10 в 1 мл культуральной жидкости,множественность инфицировани 2 фаговых частиц на бактериальную клетку достаточна дл того, чтобы катзда микробна клетка была атакована фаговой частицей, при этом не чызЕДва лизировани клеток извне, что может иметь место при более высокой множественности инфицировани . Добавление глутатиона в питательную среду способствует прикреплению фаговых час- тиц к поверхности клеток E.Coli и активизирует мембранные процессы. Таким образом достигаетс 98-100% инфицирование клеток фагом, что интенсифицирует накопление ферментов, так как фаг йл етс индуктором и полинуклеотидкиназы и РНК-липазы. Осуществление постинфекционной инкубации в течение 28-30 мин .способствует накоплению РНК-.. . липазы в то же врем без снижени активности полинуклеотидкиназы, максимум активности которой наблюдаетс к 23-25-ой минуте постинфекционной инкубации. Образованию и стабилизации целевых ферментов и биомассы способствует ведение постинфекционной инкуба-ции при рН 7,5-7,б. .Технико-экономический эффект предлагаемого способа заключаетс в обеспечении получени ферментов РНК-липазы и полинуклеотидкиназы комплексным путем. Способ обеспечивает повышение выхода биомассы и целенаправленное на-г копление в ней ферментного комплекса полинуклеотидкиназы и РНК-линзы в 3-3,5 раза.00 00 The invention relates to methods for producing -Biomass enriched with biologically active substances. A known method of producing biomass of microorganisms with RNA ligaene activity, where E. Coli B is used as a producer, and phage is used as an inducer of RNA ligase. T Biomass yield not specified. RNA ligase activity of 3.7 units. per mg of protein 1. Closest to the proposed method is that the biomass with polynucleotide kinase activity is obtained by cultivating the bacterium E.Coli B in a nutrient medium containing g / l; ammonium chloride 1; magnesium sulfate 0,13; potassium phosphate monosubstituted 3, disodium phosphate disubstituted 6.0; glucose 4.0; casamine sour .ty 2.0. Growth temperature 37 C. Phase induction enzyme conditions: E.Coli 2 l0 culture density of cells 7 ml multiplicity of infection 4 phage particles per cell. Tryptophan, 0.01 g, is added as biotranslation agent. Enzyme accumulation is carried out for 12 minutes after phage infection. Biomass yield 2.5 g / l. The activity of polynucleotide kinase is 40 units / mg of protein 2. However, a comparatively low biomass yield, as at the stages of culture infection and post-infection incubation, there are no CONDITIONS for the intensive process. The purpose of the invention is to increase the yield and biomass. The goal is achieved by the fact that in the method of obtaining E.Coli B biomass on nutrient medium containing sources of carbon and nitrogen, mineral salts and growth factors, glutathione in a concentration of 0.01 0.015 g / l is additionally introduced into the nutrient medium Atom 82 is carried out at a culture density of 3.0-3.3-10 cells / ml of culture fluid, and post-infection incubation is carried out for. 28-30 min at pH 7.5-7.6. 1 Example. The E.Coli B culture is grown in a nutrient medium of the following composition, g / l: NH / C11.0 + 1.2 MgS04-7H20 0.13 + 0.15 .3.0 + 3.5 KH2P04 9.0 + 10, 0 Na2HPO4 Glucose10.0 + 15.0 Casein Hydrolyzate8.0-1.0.0 Yeast Extract 1.0-1.2 pH 7.2-2-7.4 Glucose is introduced into the nutrient medium as a sterile solution. Cultivation is carried out under conditions of forced aeration until the culture density reaches 3.0-3.3-10 cells / ml of culture fluid, and phage is infused at the rate of 2 phage particles per 1 bacterium cell, while glutathione at a concentration of 0,010-0,015 g / l and continue cultivation for 28-30 minutes, maintaining the pH 7.5-7, 6. The process is stopped by cooling the culture fluid dr 5c. Biomass yield 7.0-8.5 g / l g Pselinucleotide kinase activity 45-47 u / mg protein RNIPLase 5 activity, 5.2 u / µ protein. PRI mme R 2. The nutrient medium contains, g / l: NH4C1. 1.2 MgSO.-7H90 0.13 KN „Р343, .0 LienP049, 0 Glucose. 15.0 Casein hydrolyzate 10, 0 Yeast extract 1.2 pH. 7.2-7.4 Glucose is introduced into the nutrient medium in the form of a sterile solution. Growing E.Co11 V. 1) Inoculation of inoculum. The E.Coli B culture is supported on MPA columns with vaseline oil and transplanted once every 4 months. For rejuvenation, the culture is seeded in 100 ml of basic medium with a glucose content of 0.5 g / l, incubated 10-12.4 at 37 ± 1 ° C stationary. Inoculum is prepared by reseeding a 10-12 hour culture per 1 liter of fresh medium with a glucose content of 1.0 g / l at a rate of 1: 8 and grown for 4-5 hours under aeration conditions. 2) The fermentation of the E.Coli B culture is performed after adding ViHOKyl and 1:20 with respect to the volume of the medium. Fermentation is carried out at 37 ± 1 ° C under conditions of forced aeration (2 liters of air per 1 liter of nutrient medium). ; 3) Infection of E.Coli B with phage T.cim82. When the culture density reaches 3 × 10 cells / ml (according to the calibration curve), aeration is stopped, bacteriophage suspension is added at the rate of 2 phage particles per 1 bacterium cell, i.e. 6 per ml of culture liquid. Glutathione 0.015 g / l is added at the same time. 4) Post-infection incubation is carried out at pH 7.5-7.6, controlled by the solution and aeration of 2 liters of air per 1 l of nutrient medium for 28 minutes, after which the culture liquid is rapidly cooled to 5 ° C. 8.5 g / l, Biomass yield Activity of 47 units / mg of linucleotide protein. RNA5 activity, 0 u / mg protein lipase, Example 3: The nutrient medium contains, g / l: NH4Ci1, S MgSQa-7H2O0.15 KN P043.5 NajHPO 10.0 Glucose10.0 Casein Hydrolyzate8.0 Throat extracts of 1.0 pH7.2-7.4 Injection of glucose, inoculation of seed material, culture fermentation are similar to Example 1 ... Infection with E.Coli In phage is carried out when the culture density reaches 3 or 10 cells per ml, adding The bacteriophage suspension is calculated by calculating 2 phage particles per 1 bacterium, i.e. per 1 ml of culture liquid, glutathium ion is added in the amount of 0.01 g / l. Post-infectious infection was carried out for 30 minutes. Biomass yield 0.7 g / l. The activity of polynucleotides 45 u / mg protein. The activity of RNA lipase 5.2 u / mg protein. EXAMPLE 4 Nutrient medium, administration of glucose, inoculation of inoculum, fermentation of an IE.Coli culture. Like Example 1. Infection with E.Coli In T. at 82 phage is carried out when the density of the culture reaches 3.2. -10 cells in 1 ml of cultural liquid; bacteriophage suspension is added at the rate of 2 phage particles per 1 bacteria cell. 6,4-l (FEOE per 1 ml of culture fluid, glutathione is added in an amount of 0.013 g / l. The incubation of the cells is incubated for 29 MHk. Biomass yield 8.0 g / l. Polynucleotide kinase activity 46 u / mg protein. RNA ligase 5.1 u / ml protein. The application of the proposed method provides a good biomass yield (7.0-8.0 g / l) with a polynucleotide kinase activity of 45-47 u / mg protein and RNIPlipase 5-5.2 u / mg of protein. Growing a culture to a cell density of 3-3.3 x 10 in 1 ml of culture fluid, a multiplicity of infection of 2 phage particles per bacterial cell residual in order for the microbial cathouse to be attacked by a phage particle, without having to lyse cells from the outside, which can occur at a higher multiplicity of infection. Adding glutathione to the nutrient medium promotes the attachment of phage particles to E.Coli cells and activates membrane processes. Thus, 98-100% infection of cells with phage is achieved, which intensifies the accumulation of enzymes, as the phage induces both polynucleotide kinase and RNA lipase. The implementation of post-infection incubation for 28-30 minutes contributes to the accumulation of RNA- ... lipases at the same time without reducing the activity of polynucleotide kinase, the maximum activity of which is observed by the 23-25th minute of post-infectious incubation. The formation and stabilization of target enzymes and biomass contributes to the maintenance of post-infectious incubation at pH 7.5-7, b. The technical and economic effect of the proposed method is to ensure the production of the enzymes RNA lipase and polynucleotide kinase in a complex way. The method provides an increase in biomass yield and targeted accumulation of the enzyme complex of polynucleotide kinase and RNA lens in it by 3-3.5 times.