SU1010562A1 - Способ количественного определени фактора @ в плазме крови - Google Patents

Abstract

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПгаДЕЛЕНИЯ ФАКТОРА X В ПЛАЗМЕ КРСЖИ, включающий получение субстратной плазмы, смешивание ее с нормальной разведенной плазмой, внесение е полученную смесь активатора сверьтывани  и опреаелевие протромбинового времени смеси, отлвчаюши и с   тем, что, с целью повышени  сохранности нативных свсЛств плазмы, а также удешевлени  способа, получение субстратной плазмы осуществл ют путем внесени  в питратную смешанную челове- чёскую плазму слабоосновного анионообменного декстранового гел , содержаще- 1Х диэГиламиноэтипьные функциональные группы с преимушестванным ионным обменом дл  белков с мол. мае. ЗОООО20ОООО дальтон при ионной силе О,25М осаждение гел  осуществл ют отстаива кием, далее отбирают надосадочную субстратную плазму, а в качестве актива (Л тора свертывани  используют тромбопластинкалыхиевую смесь.

Description

о

ел

Изобрегение огносигс  к медицине, в часгноеги к способам определени  факгоров свертывани  крови.

.Извесген способ определени  фактсм ров X и УП, предусматривающий получение субстратной плазмы, разведение нормальной плазмы, смешивание их, определение протромбинового времени сме

си ; 13.

К недостаткам способа огноситс  нарушение нагивных свойств плазмы.

Наиболеё близким к предлагаемому по технической сушности и достигаемому эффекту  вл етс  способ количественного определени  фактора X, предусма риваюший получение субстратно%плазмы, смешивание ее с нормальной разведенной плазмой, внесение в полученную смесь активатора свертьтани  и определение протромбинового времени смеси.

Согласно этому способу получают субстратную плазму (удаление из норн , мальной человеческой плазмы факторов X и УП) путем фильтровани  через асбестовый фильтр развод т1юрмальную смешанную (смесь равных объемов .плазмы 5-10 здоровых людей) человеческую плазму буфером Михаэлиса (р д разве|дений от 1:1О до 1:1000); смешивают равные объемы (по 0,1 мл) субстратной и нормальной разведенной плазмы с последующим определением протромбинового времени этой смеси; стро т калибровочную кривую на основе данных, полученных при определении протромбинового времени всех приготовленных разведений нормальной плазмы определ ют протромбиновое врем  при смешивании исследуемой (разведенной 1:10).плазмы с субстратной; содержание факторов УП и X (%) в исследуемой плазме устанавливают с помощью калибровочной кривой.

В качестве активатора свертывани  используют змеиный  д 2 .

К недостаткам известного способа откоситс  то, что фильтрование плазмы через асбест с целью удалени  фактора X попутно приводит и к удалению УП; услови  фильтровани  привод т к нарушенто нативных свойств использование в качестве активатора вертывани  змеиного  да заметно ограничивает доступность способа и обуславивает его дороговизну; отсутствие в субтратной плазме фактора УП и нарушение ативньк свойств плазмы при фильтроании через асбест снижает качество определений.

Цель изобретени  - повышение сохранности нативных свойств плазмы, а также удешевление способа.

Поставленна  цель достигаетс  тем, что, согласно способу количественного определени  фактора X в плазме крови, включакнцему получение субстратной плазмы, смешивание ее с нормальной разведенной плазмой, внесение в полученную смесь активатора свертывани  и определение протромбинового времени смеси, получение субстратной-плазмы осуществл ют путем внесени  в цитратную смешанную человеческую плазму слабоосновного анионообменного декстранового гел , содержащего диэтиламиноэтильные функциональные группы с преимущественным ионным обменом дл  белков с мол. мае. ЗОООО- ООООО цальгон при ионной силе 0,25М, осаждение гел  осуществл ют отстаиванием, далее отбирают надосадочную субстратную плазму, а в качестве активатора свертывани  используют тромбопластин-кальциевую

смесь.

Пример 1 . К 50 мл нормальной смешанной цитратной плазмы чело- века (по 1 мл от донора) добавл ют 5,0 мл 0 0,36 М раствора хлорида натри . В полученную смесь внос т 5,0 мл гел  ДЭАЭ-сефадекса А 5О, предварительно набухшего в 0,25 М растворе хлорида натри . После осторожного помешивани  5 в течение 0,5 ч и осаждени  гранул

гел  пипеткой отбирают плазму. Полученна  плазма при рекальцифицировании не свертывалась в течение 1 ч. Эту плазму используюг в качестве субстратной. 0 ОД мл нормальной смешанной человеческой плазмы, а таЮке разведенную плазму (1:1, 1:2, 1:4 и 1:8), смешивают с 0,1 мл субстратной плазмы. После инкубации на вод ной бане при 5 (15 с) определ ют тромбопластиновое врем  смеси. Дл  разных разведений . плазмы оно йледукнцее, с: Цельна  + 0,1 мл субстратной

плазмы127+4Д

Разведенна  1:1-Ю,1 мл -- 166+5,4 1:2+0,1 мл -- 213+7,6 1:4+О,1 мл -- 285+10,6 1:8+О,1 мл -- 349+12,3 На основании приведенньсх. данных стро т калибровочную кривую (график зависимости содержани  фактора X в смешанной нормальной плазме от времени свертывани  субстратной плазмь). За 1ОО% прин то врем  свертывани , установленное при смешивании цельной нормальной плазмь с равным количеством субстрат Hoft.

Пример 2 . К 25 мл нормальной смешанной цитратной плазмы человека добавл ют 25 мл 0,36 М раствора хлорида натри  (дл  достижени  в плазме итогового значени  ионной силы 0,2.5лл В полученную смесь внос т 25 мл гел  ДЭАЭ - сефадекса А 50, предварительно набухшего в 0,25 М растворе хлорида натри . Смесь осторожно помешивают . в течение 0,5 ч, после чего дают осест гранулам сефадекса Надосадочную плазму отбирают пипеткой и используют в качестве субстратной (лишенной фактора X). Полученна  плазма при рекальцификации не свертывалась в течение 60 мин Внесение извне гомогенного препарата фактора X сокрашает врем  свертывани  при рекальцификации до 33-35 с, что свидетельствует об отсутствии в полученной плазме фактора X. В качестве контрол  дл  построени  калибровочной кривой используют смешанную человеческую плазму, разведенную О,14 М раствором хлорида (разведени : цельна , 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 ). В пробирку, установленную на вод ной бане, при внос т 0,1 мл субстратной плазмы и 0,1- мл нормальной смешанной плазмы. После инкубации (15 с) внос т в йробирку тромбоплас- тин-кальциевую смесь и фиксируют врем  свертывани . В полулогарифмическом масштабе постро т кривую разведени  по зависимости тромбопластинЬвого времени от разведений нормальной стандартной , Врем  свертывани  неразведенной плазмы принимают за 10 Пользу сь этой кривой, определ ют содержание фактора X в исследуемых образцах плазмы.

При использовании предлагаемого способа дл  определени  содержани  фактора X в плазме здоровых людей (5О доноров) обнаружены индивидуальные колебани  .от 87 до 105%.

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позвол ет уменьшить врем  свертывани  плазмы с 168 до 125 с, что свидетельствует о большей чувствительности приготовленной по предлагаемому способу плазм к действию фактора X; при размораживании субстратной плазмы уменьшить врем  свертывани  ее в присутствии фактора X и тромбопластин-кальциевой смеси с 206-235 до 134-143 с, что указывает на высокую сохранность .на- тивных свойств плазмы, и снизить стоимость одного определени  в 3;5 раза.

Claims (1)

1. СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАКТОРА X В ПЛАЗМЕ КРОВИ, включающий получение субстратной плазмы, смешивание ее с нормальной разведенной плазмой, внесе- ние в полученную смесь активатора свертывания и определение протромбинового времени смеси, отличаю шийс я тем, что, с целью повышения сохранности нативных свойств плазмы, а также удешевления способа, получение субстратной плазмы осуществляют путем внесения в цитратную смешанную человеческую плазму слабоосновного анионообменного декстранового геля, содержащего циэТиламиноэтильные функциональные группы с преимущественным ионным обменом для белков с мол. мае. 30000200000 дальтон при ионной силе 0.25М осаждение геля осуществляют отстаивав нием, далее отбирают нацосацочную субстратную плазму, а в качестве активатора свертывания используют тромбопластинкальциевую смесь.