SK42295A3

SK42295A3 - Purificated and isolated dna molecule, analogue of beta-subunit of tryptophansynthetasy, tryptophansynthetasy, prokaryotic or eukaryotic host cell, method of biosynthesis of indole and indigo

Info

Publication number: SK42295A3
Application number: SK422-95A
Authority: SK
Inventors: Douglas C Murdock
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1992-10-02
Filing date: 1993-09-30
Publication date: 1996-05-08
Also published as: DK0665892T3; US5374543A; DE69327170T2; HU219018B; FI119817B; AU5298093A; FI951546A; HUT72194A; DE69327170D1; NZ256991A; CZ77495A3; FI951546A0; HU9500955D0; GR3032667T3; EP0665892A4; CZ285620B6; WO1994008035A1; ATE187203T1; EP0665892B1; ES2139023T3

Description

Purifikovaná a izolovaná molekula DNA,, analóg β-podjednotkytryptofan syntézy/ tryptofan syntéza', prokaryontná alebo eukaryontná hostitelská bunka, spôsob biosyntézy indolu a spôsob biosyntézy indiga

Oblasť techniky

Vynález sa týka purifikovanej a izolovanej molekuly DNA, analogu β-podjednotky tryptofan syntézy, tryptofan syntézy, prokaryontnej alebo eukaryontnej hostiteľskej bunky, spôsobu biosyntézy indolu a spôsobu biosyntézy indiga.

Vynález sa týka najmä biosyntézy farbív pomocou mikroorganizmov, najmä syntézy indiga baktériami. Súčasťou vynálezu je účinný dobre regulovaný biosyntetický systém, v ktorom sa prekurzor pre výrobu indiga mikroorganizmami, ktorým je indol, produkuje na vysokej úrovni intracelulárne z glukózy. Táto biosyntéza indolu je sprostredkovaná exogénnym tryptofanovým operonom, ktorý je modifikovaný tak, aby podporoval produkciu indolu miesto syntézy tryptofanu. Indol, ktorý sa týmto spôsobom vyrobí, sa potom môže previesť na indigo pôsobením iného enzýmatického systému, po ktorom nasleduje expozícia intermediárneho indoxylu vzduchu. Konkrétne je možno uviesť, že keď sa modifikovaný tryptofanový operon, ktorý je predmetom vynálezu, stabilne transformuje do mikroorganizmu, v ktorom je zakotvená vhodná prídavná exogenná enzýmatická dráha, dôjde k biosyntéze indiga z glukózy pri kultivácií hostiteľského kmeňa mikroorganizmu za vhodných podmienok.

Doterajší stav techniky

Modré farbivo, indigo, je jedným z najstarších farbív, ktoré ľudstvo pozná. Ako textilného farbiva sa ho používalo už prinajmenej 2 000 rokov pred Kristom. Takmer až do konca 19. storočia sa indigo alebo indigotin v podstate získaval z rast-lín rodu Indigofera, ktoré sú značne rozšírené v Afrike, Ázií, Malajzií a v Južnej Amerike. Keď sa v 19. storočí prehnala Európou a Severnou Amerikou priemyselná revolúcia, viedol dopyt po tomto jasne modrom farbive k tomu, že sa stalo jedným z hlavných obchodných komodít medzi Európou a Ďalekým Východom. Chemickú štruktúru indiga stanovil roku 1883 Alfréd von Baeyer, Ci₆H₁₀N₂O2 . Roku 1887 bol vyvinutý prvý priemyslovo využiteľný chemický výrobný postup pre výrobu indiga, ktorý sa používa až doposiaľ. Tento spôsob zahrňuje tavenie fenylglyci-nátu sodného v zmesi hydroxidu sodného a natriumamidu, pri ktorom vzniká indoxyl. Pri záverečnom stupni výroby sa indoxyl oxiduje na indigo expozíciou vzduchu.

Tieto chemické výrobné postupy, ktorými sa vyrába indigo, sú okrem vzniku samotného farbiva doprevádzané tvorbou značných množstiev toxických odpadových produktov. Je samozrejmé, že by bolo žiadúce vyvinúť postup, ktorým by bolo možné vyrábať indigo bez súčasnej tvorby toxických vedľajších produktov. Jedným z takých ekologických postupov je biosyntéza indiga mikroorganizmami .

Pri náhodnom objave zistili Ensley et al., [(1983) Science, zv. 222, str. 167 až 169), že fragment DNA z prenos-ného plazmidu izolovaného zo zemnej baktérie Pseudomonas putida umožnil baktérii Escherichia coli stabilne transformovanej plazmidom obsahujúcim tento fragment, syntetizovať indigo za prítomnosti indolu alebo tryptofanu. Ensley et al. postulovali, že indol, pridaný buď ako prísada k médiu, alebo produkovaný v dôsledku enzýmatického katabolizmu tryptofanu, sa prevádza na cis-indol-2,3-dihydrodiol a indoxyl nedávno identifikovaným enzýmom s niekoľkými podjednotkami (multi-subunit enzýme), putida. Takto vyrobený indoxyl bol potom oxidovaný na indigo expozíciou vzdušného kyslíka.

Nedávno sa zistilo, že NDO katalyzuje oxidáciu aromatického uhlovodíka, naftalénu, na (+)-cis-(ÍR,2S)-di-hydroxi-1,2dihydronaftalén (Ensley et al. (1982) J. Bact. zv. 149 str. 948 až 954). V US patente č. 4 520 103 (táto citácia je tu uvedená náhradou za prednesenie celého jej obsahu do popisu tohoto vynálezu) je popísaná mikrobiálna výroba indiga z indolu pomocou aromatického dioxigenázového enzýmu, ako je NDO. Enzým NDO zahrňuje niekoľko podjednotiek: reduktazový polypeptid (Rd; molekulová hmotnosť približne 37 000 dalton (37 kd)); železo-síra ferredoxinový polypeptid (Fd; molekulová hmotnosť približne 13 kd); a terminálny železo-síra oxigenázový protein (ISP). Samotný ISP zahrňuje 4 podjednotky so štruktúrou podjednotiek α₂β₂(približná molekulová hmotnosť týchto podjednotiek je: a, kd; β , 21 kd). Je známe, že ISP viaže naftalén a za prítomnosti NADH, Rd, Fd a kyslíka ho redukuje na cis-naftaléndihydrodiol. Fd je pri tejto katalýze oxidácie naftalénu polypeptidom obmedzujúcim rýchlosť reakcie. Podrobná diskusia vzťahujúca sa k rôznym podjednotkám NDO a spôsobom ich zlepšovania pre účely biosyntézy indiga je uvedená v patentovej prihláške USA SN 07/389,738, podanej 4. aug. 1989. Táto prihláška, ktorá je tu citovaná náhradou za prenesenie jej celého obsahu do popisu tohoto vynálezu, čím bola schválená, ale dosial na ňu nebol udelený patent. Táto prihláška bola tiež prevedená na rovnakú firmu ako prihláška predloženého vynálezu.

Pri biosyntetickej výrobe indiga môžu byť užitočné tiež iné aromatické dioxigenázy ako NDO. Ensley et al. tiež zistili, že dioxigenázový enzým z iného kmeňa Pseudomonas, ktorý je schopný degradovať toluén, je tiež schopný produkovať indigo, keď sa do kultivačného média doplní indol. Pod4 vať indigo, keď sa do kultivačného média doplní indol. Podrobnosti tohoto postupu sú uvedené vo vyššie citovanom US patente č. 4 520 103.

Dlhú dobu je už tiež známe, že mikroorganizmy obsahujú biosyntetické dráhy pre produkciu všetkých 20 esenciálnych aminokyselín, včítane aromatickej aminokyseliny, L-tryptofanu. Nová syntéza aromatických aminokyselín (fenylalanínu, tryptofanu a tyrozínu) majú spoločnú dráhu až do tvorby chlorizmatu. Po syntéze chlorizmatu sa pre dokončenie syntézy každej z rožných aromatických aminokyselín používá špecifických dráh.

Bakteriálna biosyntéza tryptofanu z chlorizmatu je riadená tryptofanovým (trp) operonom. Tento trp operon, ktorý zahrňuje regulačné oblasti a päť štruktúrnych génov, je intenzívne študovaný vďaka svojím zložitým a koordinovaným regulačným systémom. Regulačná a štruktúrna organizácia trp operonu je spolu s katalytickými aktivitami kódovanými štruktúrnymi génami tohoto operonu znázornená na obr. 1. Pre tento vynález má zvláštnu dôležitosť konverzia indol-3’-glycerolfosfátu (InGP), v spojení s L-serínom, na L-tryp-tofan. Táto reakcia je atalyzovaná enzýmom s niekolko podjednotkami, tryptofan syntézou (TS). Pri tejto reakcií vzniká indol ako medziprodukt. Indol sa však veľmi rýchlo zlučuje s L-serínom v stechiometrickom pomere za vzniku L-tryptofanu. V dôsledku toho pri tejto InGP plus Lserínovej konverzií na tryptofan nevzniká žiadný volný indol.

Yanofsky et al. [(1958) Biochim. Biophys. Acta, zv.

28, str. 640 až 641] však identifikovali tryptofan syntézový mutant, ktorý vedie k akumulácií indolu. U tohto konkrétneho mutanta však dochádza ku spontánnej reverzií na fenotyp divokého typu, pretože mutácia je dôsledkom zmeny jediného páru nukleotidových báz v géne kódujúcom jednu z podjednotiek tryptofan syntézy.

Úlohou tohoto vynálezu bolo teda vytvoriť stabilné tryptofan syntézové mutanty, ktoré by boli schopné poskytnúť vysokú hladinu intracelulárneho indolu. Keď také mutanty akumulujúce indol exprimujú tiež aromatický dioxigenazový enzým, ako je NDO, môže sa akumulovaný indol previesť na indoxyl. Takto vyrobený indoxyl sa potom môže oxidovať na indigo expozíciou vzduchu. Pomocou priemyslovej aplikácie rekombinantnej DNA technológie bol podlá vynálezu vyvinutý nový a z ekologického hľadiska nezávadný biosyntetický spôsob výroby indiga, pri čom sa využíva mikroorganizmov stabilne transformovaných exogennými molekulami DNA kódujúcimi modifikovaný trp operon a aromatický dioxigenázový enzým.

Nasledujúca definícia niektorých pojmov, ktorých sa používa v tomto popise a nárokoch. Pokiaľ nie je uvedené inak, majú uvádzané pojmy význam, ktorý je uvedený ďalej. Tieto definície sa opierajú o významy, ktoré sú jednotlivým pojmom prisudzované odborníkmi v tomto odbore.

Pod pojmom trp operon ”, čo je operon, ktorý je užitočný pre zabezpečenie akumulácie indolu v mikroorganizmoch, sa rozumie trp operon izolovaný z mikroorganizmu vo forme purifikovanej molekuly DNA, ktorá kóduje enzymatickú dráhu schopnú riadiť biosyntézu L-tryptofanu z chlorizmatu. Akumulácia indolu je umožnená modifikáciou jedného alebo viacej štruktúrnych elementov a/alebo regulačných oblastí tejto dráhy. Tento modifikovaný trp operon sa potom môže zaviesť do vhodného hostiteľského mikroorganizmu. Treba zdôrazniť, že pod pojmom akumulácia indolu sa nutne nemusí rozumieť skutočná intracelulárna akumulácia indolu. Miesto toho môže tento termín charakterizovať stav, pri ktorom sa indol produkuje a je k dispozícií ako substrát pre iné intracelulárne katalytické reakcie, ako je tvorba L-tryptofanu. V kontexte tohoto vynálezu sa teda môže akumulovaný indol spotrebovávať pri konverzii indolu na indoxyl pomocou aromatickej dioxigenázy, ako je NDO, alebo sa môže skutočne hromadiť v bunke, ako by tomu bolo v prípade, keby konečným produktom bol indol.

Pod označením zvýšená akumulácia indolu sa rozumie intracelulárna produkcia a/alebo akumulácia indolu, ktorá prevyšuje produkciu a/alebo akumuláciu dosiahnutú za použitia mutanta identifikovaného Yanofskym et al. (viď vyššie uvedenú citáciu), totiž mutant, v ktorom je lyzín v aminokyselinovej polohe 382 β-podjednotkového polypeptidu tryptofan syntézy nahradený asparagínom alebo rekombinantného mikroorganizmu kódujúceho rovnakú mutáciu. Určenie, či dochádza ku zvýšenej akumulácii indolu, sa prevádza tak, že sa akumulácia indolu za použitia nových analógov porovnává s akumuláciou indolu, ku ktorej dochádza za rovnakých podmienok za použitia analogu, ktorý obsahuje v aminokyselinovej polohe 382 β-podjednotky tryptofan syntézy asparagín.

Ako vhodné hostiteľské mikroorganizmy možno uviesť autonomné jednobunečné organizmy, ktoré sú užitočné pre mikrobiálnu produkciu indolu a/alebo indiga, ktoré zahrňujú ako eukaryontné, tak prokaryontné mikroorganizmy. Ako užitočné eukaryontné organizmy možno uviesť kvasinky a huby. Ako prokaryontné mikroorganizmy, ktoré sú vhodné pre účely tohoto vynálezu, možno uviesť baktérie, ako je E. coli, P. putida a Salmonella trypimurium.

Pod pojmom biosyntetická konverzia indolu na indigo sa rozumie postup, ktorý tiež zahrňuje oxidáciu indoxylu vzduchom na indigo.

Molekula DNA, ktorá sa pri spôsobe podlá vynálezu používa, môže kódovať regulačnú a/alebo štruktúrnu genetickú informáciu. Molekula DNA podlá vynálezu musí tiež obsahovať: molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej sekvencie, ktoré sú komplementárne k obsiahnutým sekvenciam; molekuly nukleovej kyseliny (DNA alebo RNA), ktoré hybridizujú za stringentných podmienok s obsiahnutými molekulami; alebo také molekuly nukleovej kyseliny, ktoré by hybridizovali s obsiahnutými molekulami alebo ich komplementárnymi reťazcami, pokial by nedošlo k degenerácií genetického kódu. Pod pojmom stringentné podmienky hybridizácie sa rozumejú podmienky, za ktorých je minimalizovaná tvorba dvojreťazcových hybridov nukleovej kyseliny z nekomplementárnych alebo chybne párovaných jednoreťazcových nukleových kyselín.

Stringenciu hybridizácie je okrem toho možno ovlivniť rôznymi zložkami hybridizačného reakčného systému, ako koncentráciou soli, prítomnosťou alebo neprítomnosťou formamidu, zložením nukleotidov molekúl nukleovej kyseliny atd’. Molekuly nukleovej kyseliny, ktoré sú užitočné podlá tohoto vynálezu, môžu byť odvodené buď z prírodných molekúl alebo môžu byť syntetické.

Pod označením exogenná molekula DNA” sa rozumie DNA, ktorá bola zavedená do hostiteľského mikroorganizmu takým postupom, ako je transformácia, transfekcia, konjugácia, elektroporácia atd’. Treba vziať do úvahy, že hostiteľská bunka, do ktorej bola vložená exogenná molekula DNA môže sama o sebe tiež prirodzene obsahovať molekuly kódujúce rovnaké alebo podobné sekvencie. Keď sa napríklad podlá vynálezu používá ako hostiteľského kmeňa E. coli, môže za normálnych podmienok hostiteľ prirodzene obsahovať vo svojom chromozóme trp operon schopný riadiť syntézu L-tryptofanu z chlorizmatu za podmienok umožňujúcich expresiu trp operonu. Taká molekula je označovaná názvom endogenná molekula DNA.

Stabilne tranformovaným mikroorganizmom je mikroorganizmus, do ktorého bola zavedená jedna alebo viacej exogénnych molekúl DNA takým spôsobom, že zavedené molekuly sú riadne zachované, replikované a segregované. Ku stabilnej transformácii môže dôjsť chromozómovou integráciou alebo extrachromozomálnym prvkom, ako je plazmidový vektor. Plazmidový vektor je schopný riadiť expresiu polypeptidov kódovaných určitými molekulami DNA. Expresia je regulována indukovatelným (alebo represibilným) promotorom, ktorý umožňuje dosiahnutie vysokej úrovne transkripcie funkčne asociovaných molekúl DNA kódujúcich špecifické polypeptidy, ako sú štruktúrne gény trp operonu modifikované spôsobom uvedeným v tomto popise.

V popise se používa nasledujúcich trojpísmenových skratiek pre dvadsať zbytkov esenciálnych aminokyselín: Ala (alanín), Arg (arginín), Asn (asparagín), Asp (kyselina asparagová), Cys (cysteín), Glu (kyselina glutamová), Gin (glutamín), Gly (glycín), His (histidín), íle (izoleucín), Leu (leucín), Lys (lyzín), Met (metionín), Phe (fenylalanín), Pro (prolín), Ser (serín), Thr (treonín), Trp (tryptofan), Tyr (tyrozín) a Val (valín).

Podstata vynálezu

Jedným aspektom tohto vynálezu je spôsob získavania molekúl DNA kódujúcich polypeptidové analógy β-podjednotky tryptofan syntézy. Keď sa také analógy zavedú do tryptofan syntézy, dochádza k vyššej intracelulárnej akumulácii indolu, ako je akumulácia pozorovaná v prípade, keď sa lyzín v amínokyselinovej pozícii 382 β-podjednotky nahradí asparagínom.

Obvykle sú analógy β-podjednotky tryptofan syntézy kódované molekulami DNA, v ktorých bol prinajmenšom jeden kodon odpovedajúci špecifickej amínokyselinovej polohe v produkte expresie molekuly DNA nahradený iným kodonom. Obzvlášť užitočné substitúcie kodonov je možno prevádzať v kodonoch odpovedajúcich amínokyselinovým polohám trpB³⁷⁹ a trpB³⁸² . V kodone odpovedajúcom amínokyselinovej polohe trpB³⁷⁹ prichádzajú do úvahy ako nahraditelné kodony tie, ktoré kódujú Val, íle, Leu, Ala a najmä Pro. Naproti tomu v kodone odpovedajúcom amínokyselinovej polohe trpB³⁸² prichádzajú do úvahy ako užitočné kodonové substitúcie substitúcie kodonov, kódujúcich Gly a najmä Met. Také molekuly DNA obsahujúce kodonové substitúcie v oboch kodonoch odpovedajúcich amínokyselinovým polohám trpB³⁷⁹ a trpB³⁸² majú za následok produkciu zvýšených množstiev intracelulárneho indolu, najmä v tom prípade, keď kodon odpovedajúci amínokyselinovej polohe trB³⁷⁹ kóduje Pro a kodon odpovedajúci amínokyselinovej polohe trpB³⁸² kóduje Met.

Ďalším aspektom tohto vynálezu je analóg β-podjednotky tryptofan syntézy, ktorý po zapojení do tryptofan syntézy zabezpečuje zvýšenú akumuláciu indolu v zrovnaní s tryptofan syntézou obsahujúcou Asn 382-analóg β-podjednotky tryptofan syntézy.

V jednom prevedení zahrňuje tento analóg β-podjednotky tryptofan syntézy substitúciu jedného amínokyselinového zbytku iným amínokyselinovým zbytkom v jednej alebo viacej amínokyselinových polohách sekvencie aminokyselín β-podjednotky prírodnej tryptofan syntézy. Osobitne užitočné substitúcie amínokyselinových zbytkov sú substitúcie v amínokyselinových polohách 379 a 382 amínokyselinovej sekvencie β-podjednotky prírodnej tryptofan syntézy. Substitúcia amínokyselinových zbytkov v amínokyselinovej polohe 379 zahrňuje nahradenie Arg amínokyselinovým zbytkom Val, íle,

Leu, Ala a najmä Pro, zatial čo substitúcia aminokyselinových zbytkov v aminokyselinovej polohe 382 zahrňuje nahradenie Lys aminokyselinovým zbytkom Gly a najmä Met. V uprednostňujúcom prevedení zahrňuje analóg β-podjednotky tryptofan syntézy nahradenie zbytku Arg zbytkom Pro v aminokyselinovej polohe 379 a nahradenie zbytku Lys zbytkom Met v amínokyselinovej polohe 382.

Ďalším aspektom vynálezu je stabilná transformácia alebo transfekcia prokaryotnej alebo eukaryotnej hostiteľskej bunky molekulami DNA podlá vynálezu, spôsobom, ktorý umožňuje, aby hostiteľská bunka za vhodných podmienok exprimovala kódovanú β-podjednotku tryptofan syntézy. Jedným takým prednostným hostiteľským mikroorganizmom je prokaryontný hostiteľ Escherichia coli.

Ďalším aspektom tohto vynálezu je biologický funkčný plazmid alebo vírový DNA vektor zahrňujúci molekulu DNA podľa vynálezu. Podľa jedného prevedenia je eukaryotná alebo prokaryotná hostiteľská bunka, ako E. coli, stabilne transformovaná alebo transfektovaná takým biologicky funkčným vektorom.

Do rozsahu vynálezu spadajú tiež spôsoby biosyntézy indolu a indiga za použitia molekúl DNA podľa vynálezu. Produkcia indolu pomocou mikroorganizmov sa môže dosiahnúť tak, že sa hostiteľský mikroorganizmus stabilne transformuje alebo transfekuje molekulou DNA podľa vynálezu a potom, sa vzniklý mikroorganizmus kultivuje za podmienok umožňujúcich biosyntézu indolu. Podobne možno produkovať indigo tak, že sa prevedie ďalšia transformácia alebo transfekcia vyššie uvedeného mikro-organizmu molekulou DNA kódujúcou aromatický dioxigenázový enzým, ako naftalén dioxigenázu. Potom sa taký mikroorganizmus kultivuje za podmienok umožňujúcich expresiu molekúl DNA. kódujú-cich analóg βpodjednotky tryptofan syntézy a aromatické dioxigenázy, pričom dochádza k intracelulárnej akumulácii indolu a ku konverzii indolu na indoxyl, z ktorého sa oxidáciou vzduchom môže získať indigo.

Prehľad obr. na výkresoch

Na obr. 1 je znázornená mapa identifikujúca rôzne regulačné a štruktúrne prvky trp operonu E. coli. Tiež sú tu popísané rôzne proteíny kódované štruktúrnymi génami a chemické reakcie, ktoré sú týmito proteinami katalyzované.

Na obr. 2 je graficky ilustrovaná syntéza indolu a jeho akumulácia v priebehu fermentácie pYTrp#26 v jednolitrovom fermentačnom objeme.

Na obr. 3 sú graficky znázornené fermentácie mutanta 5 a pYTrp#26 v objeme jedného litra. Prázdne štvorčeky označujú body získané s mutantom 5 za neprítomnosti antranilátu; plné štvorčeky znázorňujú body získané s mutantom 5 za prítomnosti 300 mg/1 antranilátu; plné kosoštvorce znázorňujú body získané za použitia pYTrp#26 s antranilátom a prázdne kosoštvorce znázorňujú body získané za použitia pYTrp#26 bez antranilátu.

Rad rôznych aspektov a výhod tohto vynálezu bude odborníkom v tomto odbore zrejmý na základe nasledujúceho podrobného popisu, ktorý osvetľuje praktické prevádzanie vynálezu za použitia prednostných variantov.

Pri súčasných metódach biosyntetickej výroby indiga sa používá iba biosyntetickej konverzie indolu na indigo za použitia aromatickej dioxigenázy, ako je NDO. Pritom treba do kultivačného média pridávať indol, pretože v takých systémoch nedochádza k intracelulárnej akumulácii indolu. Indol pridávaný ku kultivačnému médiu však môže byť pre mikroorganizmy toxický. Rast E. coli môže byť za prítomnosti indolu v médiu inhibovaný. Účinky pridaného exogenného indolu na E. coli rastúci v trepacích nádobách na minimálnom médiu popísali Bang et al. ((1983)

Biotechnology and Bioengineering, zv. 25, str. 999 až 1011]. Títo autori zistili, že koncentrácia indolu až do 0,025 % spomaľuje bakteriálny rast, ale že sa v priebehu času.bunky na prítomnosť indolu aklimatizujú. Prítomnosť indolu v koncentrácii 0,03 % však podstatne obmedzí rast, a nie sú zrejmé prejavy aklimatizácie. Prítomnosť vyššej koncentrácie indolu ako je 0,04 % znemožní rast úplne. Bang et al. (viď vyššie uvedenú citáciu) okrem toho tiež zistili, že syntéza L-tryptofanu je inhibovaná prídávkom indolu vo vyššej koncentrácii ako je 0,02 g/100 ml.

Aby sa zabránilo vlastným obmedzeniam syntézy indiga, ktoré vyplývajú z pridávania indolu do média, je potrebné vyvinúť systém, ktorý by bol schopný endogenne biosyntetizovať indol. Jeden taký systém môže používať prenos exogennej molekuly DNA kódujúcej sekvenciu DNA trp operonu, ktorá je modifikovaná tak, aby povzbudzovala tvorbu a akumuláciu indolu, do rekombinantného hostiteľského mikroorganizmu, ktorý je už schopný exprimovať NDO (prednostne modifikovanú NDO, ako to bolo vysvetlené vyššie). Taký systém by umožňoval vyrábať indigo z glukózy alebo iných zdrojov uhlíka. Za optimálnych podmienok by taký systém účinne prevádzal endogenne vytvorený indol na indoxyl spôsobom, pri ktorom by nedochádzalo k intracelulárnej akumulácii indolu.

Už dlhú dobu je známe, že indol vzniká ako_; medziprodukt pri biosyntéze L-tryptofanu. Takto vzniknutý indol však existuje iba prechodne, t. j. existuje len v priebehu biokonverzie InGP a

L-serínu na L-tryptofan. Pri tejto biokonverzii, ktorá je katalyzovaná enzýmom s niekoľkými podjednotkami, tryptofan syntézou (TS), nedochádza k akumulácii žiadneho rozpustného volného indolu. TS je jedným z niekoľkých enzýmov kódovaných trp operonom a jedná sa o dôkladne preštudovaný enzým [viď napríklad Hyde et al. (1990) Biotechnology, zv. 8, str. 27 až 32; DijavadiOhaniance et al. (1986) Biochemistry zv. 25, str. 2502 až 2508; a Ähmed et al. (1986) Biochemistry zv. 25, str. 3118 až 3124]. Reakcia katalyzovanej piatimi génovými produktami kódovanými trp operonom sú znázornené na obr. 1.

TS má štruktúru podjednotiek α₂β₂. Podjednotka a katalyzuje konverziu InGP na indol a D-glycerylaldehyd-3'-fosfát a má približnú molekulovú hmotnosť 29 kd. Podjednotka β , ktorá má približnú molekulovú hmotnosť 43 kd, katalyzuje reakciu L-serínu a indolu na L-tryptofan, pri ktorom dochádza k uvolneniu jednej molekuly vody. Podjednotka β existuje vo forme diméru, ktorý je označovaný ako podjednotka β₂. Podjednotka β₂ je spojená s dvoma podjednotkami a za vzniku α₂β₂ TS holoenzýmu s predĺženou αββα kvartérnou štruktúrou. Tento holoenzým katalyzuje reakciu Lserínu s InGP za vzniku L-tryptofanu, D-glycerylaldehyd-3'fosfátu a jednej molekuly vody. Nevzniká žiadny volný indol, nakoľko sa jedná o kanálikom prenášaný (channeled) medziprodukt, t.j. indol vzniknutý na účinnom mieste podjednotky a je intramolekulárne prenesený vnútornou difúziou na účinné miesto podjednotky β [Hyde et al. (1990), viď vyššie uvedenú citáciu). Mutanty TS, ktoré nie sú schopné správne prenášať indol z účinného miesta podjednotky a na účinné miesto podjednotky β , alebo ich účinné miesto podjednotkyβ je pozmenené, nemusia byť schopné zabezpečiť zlúčenie L-serínu s indolom a môžu byť preto užitočné pri biosyntéze indiga vďaka tomu, že je k dispozícii volný rozpustný indol, na ktorý môže pôsobiť NDO.

Sekvenciu DNA trp operonu E. coli publikovali roku 1981 Yanofsky et al. (Nucl. Acids Res., zv. 9, č. 24, str. 6647 až 6668). Päť štruktúrnych génov tohoto operonu sa transkribuje ako jeden polycistronický mediátor o dĺžke 6 800 ribonukleotidov. Najkrajnejší 5’-gén, trpE, je kódovaný nukleotidami 279 až 1841 tejto polycistronickej mediátorovej RNA (mRNA). Nukleotidy 1841 až 3436 kódujú trpD génový produkt, zatial čo trpC je kódovaný nukleotidami 3440 až 4798. Vzhľadom k tomu, že TS je enzým, o ktorom je známe, že produkuje a používa indol na výrobu tryptofanu, je možné gény kódujúce podjednotku a a podjednotku β , totiž gén trpA (mRNA nukleotidami 6003 až 6809) a gén trpB (mRNA nukleotidami 4810 až 6003) subklonovať do vhodného vektoru a potom previesť miestne orientovanú mutagenézu za účelom zneschopnenia výsledného TS holoenzýmu pre zlučovaciu reakciu indolu so serínom za vzniku tryptofanu.

Ako už bolo uvedené vyššie, bolo zistené, že bodová mutácia v blízkosti karboxylového konca (C-konca) génu trpB, konkrétne v amínokyselinovej pozícii 382 (Yanofsky et al., vyššie uvedená citácia) vedie k intracelulárnej akumulácii indolu. Neskôr sa zistilo, že táto zmena v jednom nukleotide prebehla na tretej nukleotidovej pozícii v kodone, kde je za normálnych podmienok lyzín. Mutácia má za následok, že v tejto polohe je miesto lyzínu prítomný asparagín. V dôsledku toho, že k mutácii dochádza v tretej polohe, pričom táto mutácia má škodlivý účinok na schopnosť bunky syntetizovať tryptofan, jedná sa o veľmi nestálu mutáciu, pri ktorej ľahko dochádza k reverzii na genotyp divokého typu. Aby sa zabránilo spontánnej reverzii na sekvenciu divokého typu, treba teda zaistiť, aby akákoľvek navrhnutá mutácia prednostne zahrňovala pokiaľ možno väčšiu zmenu ako iba zmenu jedného páru nukleotidových báz.

Dobre známa technika miestne orientovanej alebo ciele15 nej mutagenézy predstavuje dobrý mechanizmus, ktorým je možné stabilizovať výmenu lyzínu za asparagín v kodone odpovedajúcom amínokyselinovej polohe 382 (výmena Lys³⁸² za Asn³⁸²) v géne trpB. Jedna taká stabilizovaná forma zahrňuje vytvorenie dvojnásobného mutanta v tomto konkrétnom kodone odpovedajúcom amínokyselinovej polohe 382 génu trpB (trpB³⁰²) . Tým sa účinne zabráni spontánnej reverzii na genotyp a fenotyp divokého typu. Okrem toho, pretože sa zistilo, že substitúcia v tomto konkrétnom zbytku trpB vedie k intracelulárnej akumulácii indolu, môže sa táto poloha substituovať i inou aminokyselinou v snahe zlepšiť alebo zvýšiť akumuláciu indolu. Tak napríklad je možné previesť substitúcie založené na rozdieloch v náboji alebo veľkosti postranného reťazca. Jedna taká prednostná zmena zahrňuje nahradenie lyzínu v trpB³⁸² za glycín. V inom prednostnom prevedení je v tejto polohe možno lyzín vymeniť za metionín. Pri poslednej uvedenej zmene síce dochádza k vyššej akumulácii indolu ako v prípade substitúcie Asn382 podľa Yanofskyho et al. (vyššie uvedená citácia z r. 1958), vzniká však menšie množstvo indolu ako v prípade mutácie Gly³⁸² .

Také amínokyselinové substitúcie v iných polohách ako TrpB³⁸² môžu byť užitočné pri tvorbe mutantov akumulujúcich indol. Tak napríklad aminokyselinová substitúcia v TrpB³⁷⁹, kde je v podjednotke β divokého typu arginín, môže viesť k ešte významnejšej úrovni akumulácie indolu. Užitočné substitúcie TrpB³⁷⁹ môžu zahrňovať nahradenie arginínového zbytku v tejto polohe sekvencie divokého typu zbytkom Ala, íle, Leu, Pro alebo Val, okrem iných aminokyselinových zbytkov. Keď sa arginín v TrpB³⁷⁹ nahradí prolínom, dôjde k intracelulárnej akumulácii indolu, ktorá je 20x vyššia ako akumulácia pozorovaná pri mutácii podľa Yanofskyho et al. Je pravdepodobné, že i iné amínokyselinové polohy v TrpB je tiež možné mutagenizovať s priaznivým výsledkom, pokiaľ sa týka akumulácie indolu. Iné potenciálne užitočné zmeny môžu zahrňovať rozlomenie indolového kanálika, čím sa zabráni pohybu indolu z miesta podjednotky α na miesto podjednotky βtryptofan syntézového holoenzýmu. Podobne je možná jedna alebo viacej amínokyselinových výmen v zbytkoch v podjednotke β , o ktorých sa predpokladá, že sa podielajú na konverzii indolu a L-serínu na L-tryptofan (viď Hyde et al., vyššie uvedená citácia z roku 1990).

Okrem amínokyselinových substitúcií pri konkrétnychamínokyselinových zbytkoch spadá do rozsahu vynálezu tiež inzercia prídavných amínokyselinových zbytkov v jednej alebo viac konkrétnych polohách, ako i delecia jedného alebo viac špecifických zbytkov. Do rozsahu tohoto vynálezu spadajú tiež kombinácie rôznych užitočných mutácií, ktoré majú za následok zvýšenú akumuláciu indolu, ako sú substitúcie, inzercie a/alebo delecie aminokyselín. Jeden taký dvojnásobný mutant, označený šifrou pYTrp#2 6, zahrňuje amínokyselinové substitúcie vo dvoch rôznych polohách. pYTrp#26 konkrétne zahrňuje nasledujúce zmeny v zrovnaní s podjednotkou β divokého typu: Arg³⁷⁹ je vymenený

ΟΊΛ .y, z _y OOO za Pro a metionm je vymenený za lyzm v TrpB .

Pre vyvolanie akumulácie indolu v mikroorganizmoch môžu byť okrem trpB mutácií užitočné tiež iné mutácie v trp operone. Obzvlášť zaujímavé sú mutácie v géne trpA. Také mutácie môžu mať pri expresii za následok, že podjednotka je schopná sa zabudovať do TS holoenzýmu a katalyzovať konverziu InGP na indol a D-glycerylaldehyd-3'-fosfát, ale nie je schopná sa podielať na požadovanom kanálikovom prenose indolu, ktorého je treba pre syntézu L-tryptofanu. Vďaka tomu, že β-podjednotky TS holoenzýmu zahrňujú približne dve tretiny indolových kanálikov (Hyde et al. vyššie uvedená citácia z roku 1990), predpokladá sa, že by podlá vynálezu mohli byť použitelné i mutácie poškodzujúce schopnosť tejto oblasti zabezpečovať kanálikový prenos. Ďalej sa pre substitúcie amínokyselinových zbytkov môže použiť miestne orientovanú mutagenézu a tiež sa môže použiť delecia a/alebo inzercia v účinnom mieste β-podjednotiek. Tak napríklad substitúciou amínokyselinového zbytku Lys⁸⁷ v β-podjednotke sa môže získať β-podjednotka, ktorá je síce schopná sa zapojiť do TS holoenzýmu, ale ktorá nie je schopná·katalyzovať biokonverziu Lserínu a indolu na L-tryptofan.

Okrem prevádzania špecifických zmien aminokyselín v rôz-nych polypeptidoch kódovaných génmi trp operonu sa tiež môže použiť miestne orientovaná mutagenéza pre pozmeňovanie štruk-túrnych organizačných a/alebo regulačných oblastí trp operonu. Regulačné systémy tohoto operonu sú zložité a koordinované a zahrňujú prinajmenšom tri úrovne regulácie. Na úrovni proteínu dochádza za prítomnosti nadbytku L-tryptofanu, antranilát syntézy a enzýmu s niekolkými podjednotkami,ktorého podjednotky sú kódované génmi trpE a trpD ku inhibícií so spätnou väzbou [Henderson et al., (1970), J.Biol.Chem. zv. 245, str. 1416 až 1423]. Na transkripčnej úrovni obmedzujú aktivované molekuly trp represoru za prítomnosti nadbytku L-tryptofanu transkripčnú iniciáciu na približne 1 % maximálnej rýchlosti. Za týchto podmienok môže taká atenuácia (pre vysvetlenie viď Yanofsky C. (1987), TIG, zv. 3, č. 12, str. 356 až 360; Yanofsky et al. (1981), vyššie uvedená citácia), ktorá zahrňuje ako transkrip-čnú, tak translačnú reguláciu, potláčať transkripciu štruk-túrneho génu o dalších 6 radov, hoci za prítomnosti nadbytku L-tryptofanu stále ešte dochádza k významnej základnej úrovni expresie trp operonu (Roesser et al. (1989), J. Biol. Chem., zv. 264, č.21, str. 2284 až 2288]. Mechanizmus umožňujúci prísnejšiu reguláciu transkripcie a/alebo translácie môže byť teda užitočný pri biosyntéze indolu a indiga.

Zvýšenej regulácie možno tiež dosiahnuť odstránením endogénneho trpu promotoru z plazmidových konštrukcií obsahujúcich trp operon. Pri jednom prevedení sa môže 7,4kb Eco

Rl-Sal I fragment kódujúci trp operon klonovať do expresného vektoru pACl (konštrukcia tohoto vektoru je podrobne popísaná v patentovej prihláške USSN 07/389,738, viď vyššie). Táto konštrukcia sa označuje šifrou pYTrp. Plazmidový vektor pACl využíva teplom indukovatelné fágové lambda P_L promotor pre riadenie expresie sekvenciou DNA, ktoré sú bezprostredne uložené za ním. Treba si všimnúť, že expresné systémy používajúce P_L promotor vyžadujú pre riadnu reguláciu prítomnosť represorového proteínového mutanta cl₈57 . Na nízkej úrovni.konštitutívne exprimovaný gén kódujúci cl₈57 môže byť vložený do chromozómu vhodného hostitelského kmeňa, ako je kmeň E. coli FM5 (prírastkové číslo ATCC 53911) alebo môže byť nesený plazmidom.

Konštrukcia, ako je pYTrp, možno modifikovať tak, aby obsahovali rôzne mutanty zmienené v popise tohoto vynálezu. Pri jednom prevedení sa konštrukcia označená pYTrp#26, čo je fragment DNA kódujúci modifikovaný gén trpB, ktorý kóduje polypeptid schopný produkovať zvýšenú koncentráciu intracelulárneho indolu, subklonuje do pYTrp po excisii sekvencie divokého typu. Pri kultivácii v jednolitrovom fermentori poskytne pYTrp#26 asi 30 % celkového výťažku indolu pred teplotnou indukciou P_L. Keď sa z konštrukcie pYTrp#26 odstráni endogenný trp promotor tým, že sa odstráni 400 bp (bázových párov) nekódujúcich DNA trp operony umiestnených vpredu, získá sa nová konštrukcia pYTrp#26-, ktorá vykazuje značne tesnejšiu reguláciu a zvýšený rast hostiteľských buniek v zrovnaní s bakteriálnym kmeňom obsahujúcim pYTrp#26.

Konštrukcia pYTrp#26- však stále ešte obsahuje trp atenuačnú oblasť, ktorá môže býť zodpovedná za až 90% represiu trp operonu in vivo. V prednostnom prevedení bol skonštruovaný plazmid označený šifrou pYTrp#26att-, v ktorom je ako oblasť trp promotoru, tak oblasť atenuátoru vypustená z exogenného trp operonovej konštrukcie. Štruktúrne gény pre trp operonovú konštrukciu produkujúcu indol môžu byť teda regulované výhradne promotorom skonštruovaným tak, aby povzbudzoval expresiu vložených sekvencií heterolognu DNA, pokial sú také sekvencie klonované do expresného vektoru. Pre ďalšiu optimalizáciu expresie vložených trp štruktúrnych génov sa môže medzi promotor expresného vektoru, ako medzi P_L a 5'-koniec génu trp E vložiť

J silne ribosomálne väzbové miesto s konvenčnou medzerou (consensus spacing).

Pre prevádzanie tohoto vynálezu môžu byť užitočné tiež iné plazmidy ako pACl. Celý trp operon alebo niektorý z jeho prednostných variantov uvedených vyššie sa môže vložiť do plazmidu, ako je pBR322. Pri jednom prevedení bola vytvorená konštrukcia označená šifrou pBRYTrp (obsahujúci celý trp operon z pYTrp#26-). Také konštrukcie môžu vykazovať zvýšenú, alebo v prípade pBRYTrp#26p-, zníženú reguláciu expresie vloženej sekvencie alebo sekvencií DNA. Znížená regulácia expresie (pred tepelnú indukciu) v tých prípadoch, keď sa používa vysoký počet kópií plazmidov, ako je pBR322 v spojení s P_L promotorom, je možná dôsledkom titracie malého počtu cl₈57 represorových molekúl prítomných v hostiteľskej bunke. Keď sa teda podľa vynálezu používa stredný až vysoký počet kópií plazmidov, môžu byť užitočné externe regulované promotory iné ako P_L.

Z iných modifikácií, ktoré je možno prevádzať v trp operone produkujúcim indol, je možno uviesť úplnú alebo čiastočnú deleciu 3'-nepreložené časti operonu. V E. coli, rovnako tak, ako v 7,4kb fragmente použitom ako východzia látka podľa vynálezu, obsahuje táto 3'-oblasť ako rho-zá-islú, tak rho-nezávislú terminačnú sekvenciu transkripcie. Odstránenie jednej alebo obidvoch týchto sekvencií môže odborník v tomto odbore ľahko previesť. V jednom prevedení tohoto vynálezu sa odstraňuje iba rho-závislý terminátor, pričom sa prevádza delecia približne 250 bp v smere 3' od génu trpA. Pokial sa majú odstrániť obidve terminačné sekvencie, prednostne sa iná terminačná sekvencia obsiahnutá vo vektorovej DNA funkčne pripojí k 3’-konci vloženého trp operonu, aby sa zaistila účinná terminácia transkripcie.

Podľa vynálezu je tiež možno prevádzať iné užitočné modifikácie trp operonu. Tak napríklad bolo pozorované, že v prírodnom trp operone z E. coli sa iniciátorové kodony génu trpD a trpA prekrývajú s terminačnými kodonmi génov trpE a trpB. Sekvencia DNA 5’-TGATG-3’, ktorá sa podiela na týchto prekrývaniach, je identická (Yanofsky et al., vyššie uvedená citácia z roku 1981). Toto prekrývanie býva označované názvom translačné spojovanie (translational coupling) a je pravdepodobne evolúciou vzniknutým prostriedkom používaným pri translácií polycistronických mRNA pre zaistenie proporcionálnej produkcie funkčne príbuzných polypeptidov alebo ekvimolárnej produkcie proteínov, ktoré sú zložkami multienzýmového komplexu [Das et al. (1984) Nucl. Acids Res. zv. 12, č. 11, str. 4757 až 4768]. Translačné produkty ako mediátorov trpE/trpD, tak mediátorov trpB/trpA tvoria komplexy αββα. Naproti tomu gén trpC, čo je jediný člen tohoto operonu, ktorý nekóduje polypeptid zabudovaný do enzýmu s niekoľkými podjednotkami, sa neprekrýva ani so sekvenciou terminátora génu trpD, ani s iniciačnou sekvenciou génu trpB. Miesto toho je gén trpC lemovaný šiestimi nepreloženými nukleotidami na 5’-konci a štrnástimi neprelomenými nukleotidami na 3'-konci.

Môže byť žiaduce eliminovať prekrývanie, ktoré sa vyskytuje v sekvenciach trpE/trpD a trpB/trpA. To sa môže previesť zhotovením malého syntetického fragmentu dvojreťazcovej DNA spojujúceho dve reštrikčné miesta alebo miestne orientovanú mutagenézu. Nech sa už použije prvého alebo druhého spôsobu, môže sa vložená sekvencia DNA skonštruovať tak, aby fyzicky oddelovala terminačný a iniciačný kodon rôznych génov. Sekvencia vstupujúca medzi terminačný a iniciačný kodon môže slúžiť iba ako medzerníková sekvencia. Ako však uvádzajú Das et al. vo vyššie uvedenej citácií, iba oddelenie translačne spojených mediátorov môže viesť ku zníženej úrovni translačných produktov. Akákoľvek separácia prevádzaná u týchto prekrývajúcich sa sekvencii by teda nemala mať povahu iba medzerníka.

Miesto toho by mali byť také sekvencie navrhnuté tak, aby po terminácií translácie mediátoru v smere bližšom k 5'-bola možná iniciácia translácie distalnejšieho génu rovnakým ribozomom. Do takejto medzerníkovej oblasti je teda možno vložiť ribozomálne väzbové miesto a/alebo jednu alebo viac sekvencii, ktoré sú rozoznateľné reštrikčnými enzýmami, za účelom zlepšenia klonovateľnosti rôznych génov trp operonu. Okrem toho možno pre využitie vyššie uvedených možností tiež modifikovať nepreložené oblasti lemujúce gén trpC.

Je známe, že trp operon obsahuje prinajmenšom 6 ribozomálnych väzbových miest, ktoré sú tiež známe pod označením Shine-Delgarnovy sekvencie (Yanofsky et al., vyššie uvedená citácia z roku 1981). Také sekvencie predchádzajú každému z piatich štruktúrnych génov trp a vedúcu sekvenciu (obsahujúcu atenuátor). V prípade trpD, trpC, trpB a trpA je však ShineDelgarnova sekvencia umiestnená v kódujúcej oblasti génu, ktorý ju bezprostredne predchádza. V snahe optimalizovať účinnosť translácie, ako to bolo navrhnuté v predchádzajúcom odstavci, sa teda môže prednostne modifikovať operon tak, aby bol každý gén dostatočne oddelený od iných. Tým sa umožní vznik ribozomálnych väzbových miest v nepreložených oblastiach, ktoré bezprostredne susedia s 5'-koncom každého génu. Také modifikácie je možno prevádzať u ktoréhokoľvek, u niektorých, alebo u všetkých piatich štruktúrnych génov trp, hoci v prípadoch génov trpE/trpD a trpB/trpA treba pozornosť zamerať na zachovanie terminačného a iniciačného kodonu.

K derepresii trp operonu v E. coli dochádza iba v tom prípade, že sa organizmus stretne s prostredím, ktoré je ochudobnené o tryptofan alebo ktoré tryptofan neobsahuje, hoci stála nízka úroveň expresie je pozorována vždy, ako odpoveď na stres prostredia. Dôsledkom tejto iba občasnej derepresie je, že využitie kodonov pozorované v kódujúcich oblastiach štruktúrnych génov trp je obdobné ako využitie kodonov v iných stredne exprimovaných génoch E. coli; nie je totiž nepravidelné a je menej obmedzené ako využitie kodonov pozorované vo vysoko exprimovaných génoch E. coli. Vzhľadom k tomu, že úlohou tohoto vynálezu je vyvinúť účinný priemyslovo využiteľný biosyntetický systém pre výrobu indiga, môže byť dávaná prednosť zvýšiť rýchlosť syntézy indolu v zrovnaní s rýchlosťou, ktorú je možno dosiahnúť za použitia modifikovaného, hoci z hlavnej časti prírodného trp operonu. V súlade s tým možno skonštruovať trp operon, ktorý úplne alebo zčasti zahrňuje iba kodony vyskytujúce sa vo vysoko exprimovaných proteinoch E. coli. Tieto kodony, často označované názvom prednostné kodony, sú známe v tomto odbore. Pri tvorbe optimalizovaného operonu alebo jeho časti sa môže používať postupov, ktoré popísal Stabinsky v US patente č. 4 897 471. Pri použití iného hostiteľa ako E. coli, ako naprí-klad kvasinky alebo iného bakteriálneho kmeňa, bolo by žiaduce pri konštrukcii trp operonu podľa tohoto vynálezu používať kodony, ktorým tento organizmus dáva prednosť.

Všetky hlavné skupiny mikróbov majú schopnosť syntetizovať tryptofan za vhodných podmienok. Všetky enterické druhy baktérií obsahujú trp operony, ktoré sú štruktúrne organizované tak, ako v E. coli. Iné typy baktérií obsahujú gény kódujúce rôzne zložky trp operonu na rôznych miestach chromozómu. Prvky takých rozptýlených systémov je tiež možné nezávisle regulovať. Okrem toho rôzne zložky trp operonov v takých mikroorganizmoch potenciálne obsahujú gény kódujúce polypeptidy vykazujúce meniaci sa stupeň homologie aminokyselín v zrovnaní s E. coli.

Tak napríklad gén trpA, ktorý sa nachádza v S. typimurium, čo je baktéria velmi blízka E. coli, je na nukleotidovej úrovni homologicky z 85 % a na úrovni aminokyselín homologický z 95 % vzhľadom k génu trpA a proteínu z E. coli. Je pravdepodobné, že u iných mikroorganizmov, ktoré sú vzdialenejšie príbuzné E. coli, budú existovať väčšie rozdiely. Existuje teda možnosť (a táto možnosť rovnako, spadá do rozsahu tohoto vynálezu) skon-štruovať vysoko účinný hybridný trp operon obsahujúci zložky trp operonov z rôznych mikroorganizmov, pričom keď sa taký hybridný operon modifikuje spôsobom podľa vynálezu, môže byť účinnejší pri zvýšenej produkcii indolu ako akýkoľvek modifikovaný, ale nehybridizovaný trp operon.

Pretože biosyntéza indiga mikroorganizmami v médiu, do ktorého sa nepridáva indol, vyžaduje, aby bol mikroorganizmus schopný vytvoriť exogenné enzýmatické dráhy jednak produkujúce indol a jednak katalyzujúci konverziu indolu na indoxyl, môže sa používať rôznych kombinácií plazmidov kódujúcich tieto odlišné dráhy. Pre zaistenie vhodného zachovania, segregácie a propagácie systému produkujúceho indigo používajúceho viac než jeden plazmid, musia použité plazmidy pochádzať z rôznych komplementačných skupín. Okrem toho, transkripcia génov týchto dvoch dráh môže byť pod kontrolou promotora jediného typu tak, aby boli po indukcii transkribované obidve dráhy. Tak napríklad v dvojplazmidovom systéme môže byť expresia oboch dráh pod kontrolou promotoru P_L alebo jeho vhodnej alternatívy. Alternatívne môže byť každá dráha pod kontrolou promotora indukovaného odlišným mechanizmom. Taký systém by umožňoval indukciu týchto dvoch dráh v rôznej dobe, pokiaľ by to bolo žiaduce. Pritom by mohlo k akumulácii indolu dôjsť pred syntézou NDO. Alternatívne by tiež mohla byť NDO syntetizovaná pred transkripciou a translaciou modifikovaného operonu trp napr., aby to umožnilo konverziu indolu na indigo bez akumulácie intracelulárneho indolu na toxickú úroveň, pred biokonverziou na indoxyl.

Predmetom vynálezu je tiež tvorba jednoduchého plazmidového systému zahrňujúceho obidve enzymatické dráhy. I v takom systéme môže každá dráha používať promotoru rovnakého typu, čo umožňuje simultánnu expresiu obidvoch operonov. Je tiež možné, aby každá dráha používala promotoru indukovatelného nezávislým mechanizmom, čo umožňuje indukciu každej z dráh simultánne alebo v rôznych dobách. Podlá ešte ďalšieho aspektu tohoto vynálezu môžu byť obidve dráhy vzájomne funkčne spojené, takže môžu používať iba jedného promotoru. Tento jediný promotor by potom zaisťoval transkripciu obidvoch operonov. Tieto operony môžu byť usporiadané tak, aby dráha NDO súsedila s regulovateľným promotorom a potom aby nasledoval trp operon. Podobne možno tiež trp operon vložiť pred NDO operon.

Ďalej je tiež možné vyvinúť systémy na báze mikroorganizmov produkujúcich indol a/alebo indigo, v ktorých je aspoň jeden z génov kódujúcich polypeptidy, ktoré sa podieľajú na týchto procesoch, integrovaný do chromozómu hostiteľského mikroorganizmu, na rozdiel od umiestnenia v jednom alebo viac extrachromozomálnych prvkov. Rýchla a nevratná integrácia do chromozómu sa môže riadiť integračným plazmidom, ktorý je skonštruovaný tak, aby dopravoval do chromozómu hostiteľský mikroorganizmus (cestou rekombinácie) klonované molekuly DNA. Také integračné plazmidy obsahujúce molekuly DNA, ktoré majú byť integrované, sa transformujú do požadovaného hostiteľského mikroorganizmu. Také plazmidy sú schopné zaistiť uchovanie, propagáciu, segregáciu a reguláciu počtu kópii. Okrem toho môžu obsahovať selekčné markery, ako je jeden alebo viac génov resistencie k liečivám. Dôležité je zaradenie integračných sekvencii, ktoré sú schopné riadiť translokáciu. Také integračné sekvencie možno získať z rôznych bakteriofágových a plazmidových zdrojov. Molekuly DNA, ktoré majú byť translokované, budú okrem požadovaných štruktúrnych génov obsahovať požadované regulačné gény a/alebo prvky potrebné pre riadnu reguláciu expresie prítomných štruktúrnych génov. Po integrácii je možno gén alebo gény trp operonu a/alebo molekuly kódujúce aromatickú dioxygenazu za vhodných podmienok exprimovať, pričom dôjde k intracelulárnej tvorbe indolu a/alebo biosyntéze indiga.

Obecne rekombinantné techniky DNA, ktorých sa používá pri prevádzaní tohoto vynálezu, ako je izolácia a purifikácia DNA, štiepenie DNA reštrikčnými enzýmami, konštrukcia rekombinantných plazmidov, zavádzanie DNA do mikroorganizmov a miestne orientovaná mutagenéza, sú popísané v mnohých publikáciách, ako napríklad v príručke Manniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) a Current Protocols in Molecular Biology, red. Ausubel et al., Greene Publishing Associates and Wiley Interscience (1987).

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch prevedenia. Tieto príklady, ktoré uvádzajú prednostné prevedenie tohoto vynálezu, majú výhradne ilustrativny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohlade neobmedzujú.

Príklady prevedenia vynálezu

Príklad 1

Klonovanie trp operonu

7,4kb fragment kódujúci celý trp operon sa excisiou oddelí z plazmidu p GX5O (NRRL B-12264) za použitia Eco RI až Sal I. Po purifikácii na agarosovom gele sa tento fragment liguj e do pACl, ktorý bol predtým štepený Eco RI a Xho I a potom fosfatazovaný za účelom zabránenia spätnej tepelnej hybridizácii vektoru s polylinkerom. Výsledná plazmidová konštrukcia sa označí šifrou pYTrp.

Príklad 2

Výroba mutantov trpB akumulujúcich indol

Pro vytvorenie trp operonu schopného riadiť vysokú úroveň akumulácie intracelulárneho indolu sa pYTrp štepí Hpa I a Bam Hl, čo má za následok uvoľnenie l,2kb fragmentu obsahujúceho C-terminálnu oblasť génu trpB v spojení s celým génom trpA. Po purifikácii tohoto fragmentu Hpa I/Bam Hl na agarosovom gele se tento fragment liguje do plazmidu pl036, ktorý bol predtým štepený Hpa I a Bam Hl. Plazmid pl036 bol vytvorený nahradením fragmentu Sst I až Aat II (obsahujúceho gén resistencie voči kanamycínu) v plazmide p CFMB36 (viď US patent č. 4 710 473, celý obsah tohoto patentu je relevantný pro tento vynález) podobným fragmentom z plazmidu p CFM636 (viď US patent č. 4 710 473) a nahradením sekvencie DNA medzi jedinečnými reštrikčnými miestami Aat II a Eco RI (obsahujúci syntetický promotor P_L) nasledujúcim oligonukleotidovým duplexom:

SEQ ID NO:1: 5' CATCGATTCTAG 3’

SEQ ID NO: 2: 3 ’ TGCAGTAGCTAAGATCTTAA 5,'

Klonovaním fragmentu Hpa I/Bam Hl se vytvoríintermediárny plazmid pl036 A/B. Tento plazmid pl036 A/B sa potom štepí Eco RI a Bam Hl a 1 200bp fragment nesúci požadovanú sekvenciu sa purifikuje na gele. Výsledný fragmet purifikovaný na gele sa potom liguje do podobne štepenej M13mpll RF DNA a transformuje štandardnými technikami do kompetentnej E. coli JM109. Plak obsahujúci požadovanú konštrukciu sa izoluje a označí šifrou mp A/B. Z mp A/B sa potom pripraví jednoreťazcová (SS) DNA, ktorá slúži ako substrát pre štandardnými postupmi prevádzanú miestne orientovanú mutagenézu.

Vzhladom k tomu, že bolo známe, že určitá konkrétna bodová mutácia trpB v kodone odpovedajúcom amínokyselinovej polohe 382 (v ktorom je lyzín nahradený asparagínom) sa prejavuje produkciou detegovatelných množstiev intracelulárneho indolu (Yanofsky et al., vyššie uvedená citácia z roku 1958), boli navrhnuté a syntetizované oligonukleotidy umožňujúce substitúciu zbytku divokého typu za iný zbytok v tejto polohe. Pretože bola sekvencia DNA trp operonu a najmä génu trpB popísaná v literatúre, je navrhnutie a zostrojenie užitočných oligonukleotidov v rozsahu skúseností bežného odborníka v tomto odbore. Sekvencia DNA trpB (SEQ ID NO:3) a odpovedajúca aminokyselinová sekvencia, ktorá má zvláštny význam pre tento vynález, je uvedená ďalej:

Val Asn Leu Ser Gly Arg Gly Asp Lys Asp íle Phe 5' - GTT AAC CTT TCC GGT CGC GGC GAT AAA GAC ATC TTC

379 382

Každá prevedená substitúcia je navrhnutá tak, aby došlo ku zmene prinajmenšom dvoch súsedných nukleotidov, čím sa podstatne zníži pravdepodobnosť reverzie na genotyp divokého typu. Za použitia takto vyrobených oligonukleotidov sa potom prevedie miestne orientovaná mutagenéza pomocou SS mp A/B DNA.

Po prevedení mutagenetických reakcií sa produkty sériové zriedia, transformujú do kompetentnej JM109 a nanesú na kultivačné misky. Po inkubácii cez noc sa misky obsahujúce niekoľko sto plakov pre každú z rôznych mutácií prekryjú nitrocelulózou, čo umožní prenos fágových častíc. Po denaturácii a neutralizácii sa filtre, ku ktorým je teraz viazaná SS fágová DNA, zahrievajú dve hodiny pri 80°C za laboratórneho zníženého tlaku. Filtre sa potom hybridizujú k rádioizotopom značeným próbam spôsobom popísaným v Manniatis et al. (viď vyššie uvedená citácia), pričom ako próby sa použije oligonu kleotidu, ktorý bol predtým použitý pre špecifickú mutagenetickú reakciu. Po hybridizácii sa filtre premyjú za stringentných podmienok [2X SSC (IX SSC = 0,15M chlorid sodný, 0,015M citran sodný, pH 7,0), 1% dodecylsulfát sodný (SDS), 4°C pod teoretickou teplotou topenia), aby sa odstránili produkty nešpecifickej hybridizácie a potom sa prevedie autoradiografia. Použité podmienky premýva-nia sú premenlivé v dôsledku použitia rôznych prób s rôznou dĺžkou a rôznou sekvenciou. Pre účely týchto hybridizačných a premývacích postupov sa teplota topenia oligonukleotidu (T_M) vypočíta pridelením 2°C pre každý A nebo T v próbe a 4°C pre každý C nebo G, čím sa pridelené hodnoty u každého oligonukleotidu spočítajú.

Plaky, o ktorých sa na základe výsledkov autoradiografie predpokladá, že sú pozitívne, sa izolujú a podrobia aspoň jednému cyklu purifikácie. Jeden alebo viacej z týchto plakov, u ktorých je konštatovaná silná hybridizácia ku špecifickej próbe, sa odstránia z príslušnej misky, prevedie sa sériové riedenie a použije sa ich pre transfekciu čerstvej kultúry JM109 vo fáze logaritmického rastu. Po krátkej infekčnej perióde sa zmesi prenesú na misky a nechajú vyrásť. Pre každý predpokladaný mutant sa potom znovu prevedie väzba na nitrocelulózu a hybridizačný postup.

Potom, čo sa hybridizáciou potvrdí, že bol získaný požadovaný mutant, sa pre každý mutant vyrobí RF DNA. Táto RF DNA sa potom štepí Hpa I a Bam Hl, čím sa prevedie excisia špecifického mutanta trpB ve forme fragmentu Hpa I až Bam Hl.

V prípade každého mutanta sa potom tento fragment môže ligovať do pYTrp, ktorý bol predtým štepený Hpa I a Bam Hl a urifikovaný na gel. Tieto ligačné reakcie sa potom použijú pre transformáciu kompetentného kmeňa E. coli FM5. Kolónia každého z výsledných transformantov sa potom kultivuje v trepacej banke za podmienok umožňujúcich transkripciu a transláciu génov trp operonu nesených plazmidom. Tento rast sa prevedie tak, že sa kultúra pestuje v minimálnom médiu (ktoré sa skladá z 6 g hydrogenfo-sforečnanu dvojsodného, 3 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g chloridu sodného a 1 g chloridu amonného, vzťahované na jeden liter) pri 30°C až do dosiahnutia optickej denzity 0D₆oo 0,3.

Potom sa teplota na 1,5 hodiny zvýši na 42°C a ďalej zníži na 30°C na 2 hodiny, potom sa pridá antranilát v množstve 300 pg/ml. Kultúry sa nechajú rásť ďalších 7 hodín a potom sa zoberú a kolorimetricky analýzujú na intracelulárny indol.

Kolorimetrické stanovenie indolu sa u každého mutanta prevedie tak, že sa 500 μΐ buniek (pestovaných vyššie uvedeným spôsobom) extrahuje 500 μΐ toluénu. Extrakcia sa prevedie za vírivého pohybu buniek pri teplote miestnosti v priebehu 5 minút. Organická fáza sa oddelí. 100 μΐ extrahovanej organickej fázy sa pridá k 5 ml skúšobnej zmesi (5,56 g p-metylamínoben-zaldehydu v 1 litre zmesi etanolu a kyseliny (80 ml koncentro-vanej kyseliny chlorovodíkovej + 920 ml etanolu), vzniknutá zmes sa za vírivého pohybu premieša a nechá 15 až 20 minút stáť pri teplote miestnosti, a potom sa zmerá optická denzita 0D₅₄₀ . Získané výsledky sa porovnajú so štandardnou krivkou indolu získanou zmeraním· hodnoty A₅₄₀ v prípade, že sa 0, 2, 4, 6, 8 alebo 10 pg indolu (odobraného z čerstvo pripraveného zásobného roztoku indolu v destilovanej vode o koncentrácii 100 pg/ml) podrobí vyššie uvedenému skúšaniu.

Vyššie uvedených postupov sa použije pre analýzu série mutantov skonštruovaných tak, aby došlo k zavedeniu substitúcie jedinej aminokyseliny v trpB³⁸² . Okrem toho sa tiež vytvorí mutácia v polohe odpovedajúceho trpB³⁷⁹ . Zistilo sa, že nahradením Pro za zbytok divokého typu v tejto polohe sa dosiahne viac ako päťnásobného zvýšenia akumulácie indolu v zrovnaní s najlepším mutantom trpB³⁸², totiž Gly³⁸² . Pretože sa zistilo, že tieto dve miesta sú nezávisle schopné prideľovať schopnosť intracelulárnej akumulácii indolu, vytvorí sa tiež séria dvojnásobných mutantov obsahujúcich zmeny ako v trpB³⁷⁹, tak v trpB³⁸² . Rôzne vytvorené mutanty a množstvá indolu, ktoré sú nimi produkované, sú uvedené v tabulke 1.

Tabulka 1

Mutant Poloha Substitúcia Indol (mg/l)

1	382	Asn	7
2	382	Ser	0
3	382	Ala	0
4	382	Thr	0
5	382	Gly	30
6	382	Gin	0
7	382	Arg	0
8	382	Glu	0
9	382	Phe	0
10	382	Met	18
11	379	Pro	160
12	379	Pro
	382	Met	150
13	379	Gly
	382	Gly	7

U žiadneho z týchto dvojnásobných mutantov však nebola zistená zvýšená schopnosť akumulovať indol vzhladom k Pro³⁷⁹, hoci v prípade dvojnásobného mutanta Pro³⁷⁹/Met³⁸², ktorý bol označený šifrou pYTrp#26, bol detegovaný indol v koncentrácii 150 pg/liter. Táto koncentrácia indolu je zhruba rovnaká, ako koncentrácia, ktorá bola detegovaná u najlepšieho jednonásobného mutanta Pro³⁸⁹. Všetky mutanty akumulujúce indol boli podrobené sekvenovaniu DNA, aby sa potvrdila prítomnosť predpokladaných zmien. Vzhladom k tomu, že pYTrp#26 poskytoval temer rovnaké množstvo indolu ako ktorýkoľvek jednonásobný mutant, bol zvolený pre ďalšie štúdie, pretože reverzia na fenotyp a/alebo génotyp divokého typu je u dvojnásobného mutanta omnoho menej pravdepodobná.

Príklad 3

Fermentácia mutantov akumulujúcich indol

Pretože štúdie v trepacích bankách ukázali, že pomocou pYTrp#26 možno získať podstatné množstvo intracelulárneho indolu, prevedú sa diskontinuálne fermentácie v malom meradle s týmto a inými konštrukciami, za účelom vyskúšania produkcie indolu a jeho akumulácie za podmienok, ktoré sa viac blížia priemyslovým podmienkam. Diskontiuálne fermentácie sa prevádzajú v malom jednolitrovom fermentore (chemostate) za podmienok obmedzenia rastu uhlíkom. Počiatočná násada média sa vyrobí v dvojlitrovej sterilnej fľaši zmiešaním skôr vyrobených sterilných roztokov. Médium sa vyrobí tak, že sa zmieša 200 ml roztoku I (6 g kvasinkového extraktu doplneného destilovanou vodou na konečný objem 200 ml), 200 ml roztoku II (3,75 g síranu amonného, 8,4 g hydrogénfosforečnanu dvoj draselného a 4, 6 g dihydrogenfosforečnanu draselného + destilovaná voda do konečného objemu 200 ml), 15 ml 40% roztoku glukózy, 4,8 ml IM roztoku síranu horečnatého, 2,4 ml roztoku stopových kovov (viď tabuľka 2), 2,4 ml roztoku vitamínov a minerálov (viď tabuľka 3, 775 ml destilovanej vody, ampicilínu do koncentrácie 100 pg/ml a 200 μΐ protipenového prostriedku.

Tabuľka 2 Roztok stopových kovov

Zlúčenina g/1

Fe	CI3.6H2O	27,0	±	0, 3
Zn	Cl₂	2,0	+	0, 03
Co	Cl₂.6H₂O	2,0	±	0, 03
Na	Mo0₄.2H₂O	2,0	±	0, 03
Ca	C1₂.2H₂O	1,0	±	0, 02
Cu	SO₄.5H₂O	1,9	±	0, 03
H3BO3	0, 5	±	0, 01
Mn	C1₂.4H₂O	1, 6	±	0, 03
citran sodný.2H₂O	73, 5	+	1,0

Tento roztok sa vyrobí tak, že sa jednotlivé prísady rozpustia približne v 90 % celkového množstva purifikovanej vody, po rozpustení sa vzniknutý roztok doplní zbývajúcim množstvom vody a prevedie sa filtračná sterilizácia za použitia filtra s otvormi o rozmeroch 0,2 pm.

Tabuľka 3

Roztok vitamínov a minerálov

Zlúčenina g/1

biotin	0, 06	±	0, 001
kyselina listová	0, 04	±	0, 001
pyridoxín	1,4	±	0, 03
riboflavín	0, 42	±	0, 008
kyselina pantoténová	5,4	±	0, 11
niacín	6, 1	±	0, 12
Zlúčenina		ml/1

ΙΟΝ hydroxid sodný 5,31 ± 0,11

Tento roztok se vyrobí nasledujúcim spôsobom:

a) Biotin, kyselina listová a riboflavín sa rozpustia približne v 4 % z celkového množstva, purifikovanej vody s obsahom

5,65 + 0,19 % z celkového objemu 10N roztoku hydroxidu sodného.

Po rozpustení látok sa ku zmesi pridá purifikovaná voda tak, aby jej obsah bol 5 % z celkového množstva použitej vody.

b) Pyridoxín a niacín sa rozpustia približne v 2 % z celkového množstva purifikovanej vody s obsahom 94,2 + 0,19 % z celkového objemu 10N hydroxidu sodného. Po rozpustenílátok sa ku zmesi pridá purifikovaná voda tak, aby jej obsah bol 2,5 % z celkového množstva použitej vody.

c) Kyselina pantoténová sa rozpustí približne v 2 % z celkového množstva purifikovanej vody s obsahom 0,188 + 0,019 % z celkového objemu 10N hydroxidu sodného. Po rozpustení látok sa ku zmesi pridá purifikovaná voda tak, aby jej obsah bol 2,5 % z celkového množstva použitej vody.

d) Roztoky vyrobené podľa odstavca a), b) a c) sa zmiešajú a doplnia zbytkom purifikovanej vody.

e) Vzniklý roztok sa sterilizuje filtráciou za použitia filtra s otvormi o priemere 0,2 pm.

Výsledná šarža média sa predloží do predtým sterilizovaného chemostatu a predhreje sa na 30°C·. Miešanie sa nastaví na frekvenciu otáčania 1 000 min-1, prietok vzduchu na litre/min a regulátor pH sa nastaví tak, aby bolo pH roztoku udržované na hodnote 7,0 +- 0,2 pridávaním buď kyseliny ofosforečnej alebo hydroxidu amonného. Fermentor sa potom inokuluje na výslednú optickú denzitu OD₆₀₀ v rozmedzí od 0,02 do 0,03 čerstvou nočnou kultúrou. Táto kultúra se nechá rásť pri 30°C tak dlho, dokiaľ sa nedosiahne optická denzita OD₆₀₀približne 8,7. V tomto okamžiku sa začne pridávať dávkovací roztok. Tento dávkovací roztok se predtým vyrobí takto: do sterilnej 500ml banky sa pridajú nasledujúce predtým sterilizované roztoky: 60 ml roztoku III (15 g kvasinkového extraktu, 15 g bakto-tryptónu a purifikovaná voda do 60 ml); 160 ml 63,5% roztoku glukózy; 8 ml IM roztoku síranu horečnatého; 2 ml roztoku stopových kovov uvedeného vyššie; 2 ml roztoku vitamínov a minerálov uvedeného vyššie a ampicilín do konečnej koncentrá-cie 100 pg/ml. Dávkovací roztok sa pridává podlá nasledujúceho režimu:

OD₆oo

Rýchlosť dávkovania (ml/h)

8,7	1,25
14,9	1,9
19, 8	3,1
24,8	5, 0
37,2	7,5
62,0	11,25
74,0	20, 0
86, 8	25, 0

Keď kultúra dosiahne optickú denzitu 0D_6Oo v rozmedzí od 65 do 75, indukuje sa transkripcia modifikovaného trp operonu zvýšením teploty kultúry na 42°C na dobu 1,5 hodiny. Po indukcii sa teplota kultúry rýchlo zníži na 30°C. Potom sa vo fermentácii pokračuje dalšich 8 hodin.

Syntéza a akumulácia indolu v pYTrp#26 sa študuje za použitia vyššie uvedeného fermentačného postupu. Výsledky sú uvedené na obr. 2. V jednolitrovom fermentore sa okrem toho tiež skúša mutant č. 5 (viď tabuľka 1 vyššie), ktorý má za35 vedenú iba jedinú mutáciu a je stredným výrobcom indolu, ako bolo konštatované skúškami v trepacich fľašiach. Výsledky týchto fermentácii sú uvedené na obr. 3. Ako je zrejmé, pYTrp#26 vyprodukuje za 13 hodín od indukcie expresie trp operonu približne 1 g/liter indolu. Schopnosť buniek rásť za prítomnosti viac než 0,04 až 0,05 % indolu je s ohľadom na doterajší stav techniky rovnako prekvapujúci (viď napríklad Bang et al., vyššie uvedená citácia z roku 1983). Optimalizácia fermentačných podmienok by mala umožniť podstatné zvýšenie úrovne produkcie indolu.

Príklad 4

Delecia promotoru v trp operone

Okrem vytvárania špecifických mutácii v určitých génoch trp operonu navrhnutých tak, aby sa zvýšila úroveň produkcie indolu, je možné indolovú produkčnú dráhu ďalej zlepšiť deleciou endogenného promotoru trp. Odstránenie tohoto promotoru by malo zvýšit účinnosť transkripcie operonu od PL promotoru tým, že je eliminovaný potenciál pre represiu trp represorovým proteinom. Odstránenie trp promotoru se okrem toho prejaví zlepšenou reguláciou transkripcie trp operonu použitého podľa vynálezu tým, že sa zníži deravosť, (leakiness), pretože trp promotor nebude schopný zaistiť iniciáciu transkripcie, i keď bude P_L v represii.

Odstránenie endogenného promotoru trp sa prevedie štepením pYTrp#26 pomocou Xba I a Spe I (miesto Xba I je v polylinkeru plazmidu, zatiaľ čo miesto Spe I sa nachádza v blízkosti 3’-konca promotoru trp). Odstránenie tohoto fragmentu slúži tiež pre odstránenie približne 400 bp vonkajšej DNA v smere 5' od promotoru trp. Pretože Xba I a Spe I zanechávajú po štepení identické 3’-previsy, odstránením intervenujúceho fragmentu je možné spolu spojiť komplementárne lepivé konce. Po purifikácii na agarosovom gele sa teda nechajú lepivé konce linearizovaného plazmidu spojiť, a tým sa sekvencie ligujú. Vo výslednej konštrukcii nie sú už obsiahnuté miesta Xba I a Spe I. Táto nová konštrukcia trp neobsahujúca promotor sa označí šifrou pYTrp#26.

Potom sa prevedú pokusy v trepacich bankách pre zrovnanie produkcie indolu za použitia pYTrp#26- s produkciou indolu za použitia pYTrp#26. Tieto štúdie ukazujú, že pYTrp#26- poskytuje rovnako alebo o trochu viac indolu a je lepšie regulovaný než pYTrp#26.

Pre potvrdenie výsledkov získaných pokusmi v trepacích bankách a pre zrovnanie za podmienok, ktoré sa viac blížia priemyslovým podmienkam, sa prevedú fermentacie v objeme 1 litra, pri ktorých sa obidve konštrukcie skúšajú pri produkcii indolu. Použité fermentačné podmienky sú rovnaké ako podmienky použité v príklade 2. Dosiahnuté výsledky ukazujú, že nová trp operonová konštrukcia bez promotoru nielen poskytuje viac indolu ako pYTrp#26, ale že vykazuje tiež zlepšenú reguláciu expresie trp operonu. Pred tepelnou indukciou promotoru P_L neposkytuje pYTrp#26- žiadný indol alebo ho poskytuje len málo. Naproti tomu konštrukcia pYTrp#26 poskytuje asi 30 % celkového výťažku indolu pred indukciou trp operonu. Táto zlepšená regulácia sa prejavuje tiež zvýšenou rýchlosťou rastu pYTrp#26- v zrovnaní s pYTrp#26.

Príklad 5

Delecia atenuátoru v trp operone

Ako bolo popísané v príklade 4, delecia endogenných regulačných oblastí trp z trp operonu použitého podľa vynálezu sa môže prejaviť zvýšenou syntézou indolu. Okrem odstránenia promotoru trp je tiež možno vytvoriť užitočne modifikovaný trp operon, v ktorom je tiež vypustená oblasť atenuátoru trp. Pretože atenuátor môže byť zodpovedný za až 90% represiu trans-kripcie trp operonu in vivo, očakáva sa, že odstránením tejto oblasti sa zlepší rýchlosť produkcie indolu.

Pre vypustenie trp atenuátoru, ktorý je umiestnený medzi trp promotorom a amíno-koncom génu trpE, sa prevedie miestne orientovaná mutagenéza, pri ktorej sa pridá jedinečne miesto Xho I 9 kodonov za iniciačným kodonom génu trpE. Zavedením tohoto reštrikčného miesta sa umožní zachovanie amínokyselinovej sekvencie divokého typu génu trpE, vďaka degenerovanej povahe genetického kódu. Za použitia tohoto miesta je možné odstrániť natívnu, promotorovú/atenuačnú oblasť štepením pomocou Xho I a Xba I. Pre doplnenie konštrukcie sa potom použije syntetického Xho Ι/Xba I linkera, ktorý je navrhnutý tak, aby rekonštituoval 9 5'kodonov génu trpE. Okrem toho sa tento linker skonštruuje tak, aby obsahoval účinné ribozomálné väzbové miesto s konven-čnou medzerou (concensus spacing) od P_L. Nakoniec sa skonštruuje 3'konec tohoto linkeru tak, aby obsahoval počiatočných 9 kodonov génu trpE, pričom sa používa kodonov, ktoré sú prednostné z hladiska E. coli. Výsledkom tejto konštrukcie je konštrukcia označená šifrou pYTrp#26att-, ktorá už neobsahuje promotorovú ani atenuátorovú oblasť trp, pričom poloha génu trpE v blízkosti P_Lje oddelená silným ribosomálnym väzbovým miestom a gén trpE obsahuje v prvých 9 polohách otvoreného čítacieho rámca génu kodony, ktoré sú z hladiska E. coli prednostné.

Tento plazmid sa potom transformuje do ΕΜ5 a prevedie sa zrovnanie (technikou v trepacich bankách) s FM5 obsahujúci pYTrp#26-. Kmeň obsahujúci pYTrp#2óatt- rastie pomalšie ako kmeň transformovaný pYTrp#26~. Konštrukcia neobsahujúca atenuátor však umožňuje dosiahnúť produkciu podstatne väčšieho množstva indolu.

Príklad 6

Delecia rho-závislého terminátora z trp operonu

Okrem odstránenia trp promotoru, trp atenuátoru (alebo oboch týchto zložiek) a vonkajšiu nekódujúcu 5' DNA z operonu trp je tiež možno previesť deleciu DNA umiestnenú v polohe od konca 3' ku génu trpA. Pritom sa teda z pYTrp#26 odstráni sekvencia DNA o dĺžke približne 250bp obsahujúca rho-závislý terminátor štepením plazmidu pomocou Ssp I a Bam Hl za použitia 5’ exonukleazovej aktivity pre odštepenie 5’ previsu zanechaného pri štepení Bam Hl. Linearizovaný plazmid sa purifikuje z malého vyštepeného fragmentu a vzniknutý na gele purifikovaný linearizovaný plazmid sa liguje sám k sebe. Keď sa táto konštrukcia, ktorá ešte obsahuje rho-nezávislý terminátor 3'až gen trpA, porovná technikou v trepacích fľašiach s pYTrp#26, pokiaľ sa týka produkcie indolu, nezistí sa žiadne zlepšenie. Delecia tejto vonkajšej DNA však zjavne nemá žiadne škodlivé účinky na produkciu indolu alebo stabilitu plazmidu a vyššie uvedená delecia teda môže byť užitočná tým, že sa trp operon produkujúci indol ďalej zjednoduší elimináciou vonkajšej nekódujúcej DNA.

Príklad 7

Translokované hostiteľské kmene

Vzhľadom k tomu, že biosyntetická produkcia indiga z glukózy vyžaduje ako prítomnosť enzýmatickej dráhy so schopnosťou produkovať intracelulárny indol, tak enzýmatické dráhy so schopnosťou prevádzať tento indol na indoxyl, je potrebné, aby kmeň produkujúci indigo zahrňoval obidve tieto dráhy. Jeden zo spôsobov, ktorým toho možno dosiahnúť, spočíva v integrácii jednej z týchto dvoch dráh (trp alebo NDO) do chromozómu vhodnej hostitelskej baktérie, pričom po úspešnej integrácii sa prevedie transformácia hostitela druhou dráhou tak, aby táto druhá dráha bola zachovaná extrachromozomálne.

Pri jednej z takýchto metód sa trp operon poskytujúci indol vyštepí z pYTrp#26 v podobe fragmentu Aat I až Bam Hl, purifikuje sa na agarosovom gele a potom vloží do translokačného vektoru. pCFM2202, ktorý zahrňuje fragment DNA z pBR322 konštrukcie obsahujúcej gén Tn5 transposasy a obsahuje vloženú sekvenciu I550L, ktorá je dôležitá pre chromozomálnu integráciu na obidvoch stranách DNA, ktorá má byť integrovaná [Sasakawa et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, zv.79, str. 7450 až 7454). Translokačný vektor zabezpečuje selekciu za použitia tetracyklínového antibiotika. Okrem toho riadi integráciu požadovanej vloženej sekvencie DNA, tu modifikovaného trp operonu, v spojení s štruktúrnym génom pre regulačný prvok cl₈₅7, ktorý sám je pod kontrolou nízkoúrovňového konštitutívneho promotora. Po zostavení sa trp operonový integračný plazmid označí šifrou pCFM2202Trp. Tento plazmid sa tranformuje do E. coli kmeňa FM5.

Po tejto transformácii je kmeň označený šifrou DM2.

Po transformácií sa niekolko transformantov vyberie a pasážuje v 13 generáciách na neselektívnych médiách, za účelom vyliečenia buniek od plazmidu. Po pasážovaní sa bunky neobsahujúce plazmid a obsahujúce trp operon identifikujú koloniovou hybridizáciou (Manniatis et al., vyššie uvedená citácia) za použitia oligonukleotidovej próby, ktorá je špecifická pre mutáciu génu #26 trpB. Niekolko izolátov sa podrobí skúšaniu na schopnosť produkovať indol. Ako najlepší producent indolu sa zo všetkých translokantov identifikuje translokovaný kmeň označený šifrou DM2#26. Potom se DM2#26 porovná s FM5 transformovaným pYTrp#26. Zistí sa, že po indukcii produkuje tento translokovaný kmeň približne o 20 % viac indolu než analogický kmeň nesúci plazmid, hoci integrant rastie pomalšie ako kmeň obsahujúci extrachromozomálny prvok. V snahe zistiť, či DM2#26 môže produkovať indigo, ak mu je dodaný vhodný mechanizmus konverzie indolu na indoxyl, prevedie sa ďalej jeho transformácia pomocou pFd911ABC. Výsledný transformant obsahujúci integrovaný modifikovaný trp operon a NDO dráhu nesenú plazmidom potvrdzuje pri skúške v trepacich bankách schopnosť produkovať nízku koncentráciu indiga.

Vynález bol síce bližšie popísaný na svojich prednostných prevedeniach, odborníkom v tomto odbore je však zrejmé, že ich možno rôznym spôsobom obmeňovať a modifikovať na základe vyššie uvedeného popisu, bez toho, aby to predstavovalo únik z nárokovanej ochrany. Pre rozsah tejto ochrany sú najdôležitejšie nasledujúce patentové nároky.

ZOZNAM SEKVENCII (1) OBECNÉ INFORMÁCIE:

(i) PRIHLASOVATEĽ: Murdock, Douglas Craig (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Zvýšená biosyntéza indolu (iii) POČET SEKVENCII: 3 (iv) ADRESA PRE KOREŠPONDENCIU:

(A) ADRESÁT: Amgen Inc.
(B)	ULICA:	Amgen Center 1840 Dehavilland Drive
(C)	MESTO:	Thousand Oaks
(D)	ŠTÁT:	Kalifornia
(E)	ZEM:	USA
(F)	PSČ:	91320-1789 (ZIP)

(v) STROJOVO ČITATEĽNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Disketa, 3,5 in. DS, 2,0 MB (B) POČÍTAČ: Apple Macintosh (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: Macintosh OS 7.0 (D) SOFTWARE: Microsoft Word verše 5.1a (vi) DÁTA VZŤAHUJÚCE SA K TEJTO PRIHLÁŠKE:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY:

(B) DÁTUM PODANIA: 2. októbra 1992 (C) ZATRIEDENIE:

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 12 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:1:

CATCGATTCT AG (3) INFORMÁCIA O SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárna (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:2: AATTCTAGAA TCGATGACGT (4) INFORMÁCIA O SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 36 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVOSŤ: 2 reťazce (D) TOPOLÓGIA: neznáma (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:3:

GTT AAC CTT TCC GGT CGC GGC GAT AAA GAC ATC TTC Val Asn Leu Ser Gly Arg Gly Asp Lys Asp íle Phe

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Purifikovaná a izolovaná molekula DNA kódujúca

j.,.'/ polypeptidový analóg β-podj ednotky tryptofan synté'‘syÁp_rej_avujú_ci sa po zavedení do tryptofan syntézy zvýšenou akumuláciou indolu v rekombinantnom hostiteľskom mikroorganizme v zrovnaní s tryptofan syntézou obsahujúcou Asn³⁸² analóg β-podj ednotky tryptofan syntézy.
2. Purifikovaná a izolovaná molekula DNA podľa nároku 1 obsahujúca substitúciu prinajmenšom jedného kodonu odpovedajúceho špecifickej aminokyselinovej polohe v β-podjednotke tryptofan syntézy.
3. Purifikovaná a izolovaná molekula DNA podľa nároku 2 obsahujúca substitúciu kodonu v jednom alebo v obidvoch kodonoch odpovedajúcich aminokyselinovej polohe zvolenej zo suboru zahrnujúceho trpB a trpB
4. Purifikovaná a izolovaná molekula DNA podľa nároku 3 obsahujúca substitúciu kodonu v kodone odpovedajúcom amínokyselinovej polohe trpB³⁷⁹ .
5. Purifikovaná a izolovaná molekula DNA podľa nároku 4, kde substituovaný kodon kóduje amínokyselinový zbytok zvolený zo súboru zahrňujúceho Pro, Val, íle, Leu a Ala.
6. Purifikovaná a izolovaná molekula DNA podľa nároku 5, kde substituovaný kodon kóduje zbytok Pro.
7. Purifikovaná a izolovaná molekula DNA podlá nároku 3 obsahujúca substitúciu kodonu v kodone odpovedajúcom amínokyselinovej polohe trpB³⁸² .
8. Purifikovaná a izolovaná molekula DNA podlá nároku 7, kde substituovaný kodon kóduje aminokyselinový zbytok zvolený zo súboru zahrňujúceho Gly a Met.
9. Purifikovaná a izolovaná molekula DNA podía nároku 8, kde substituovaný kodon kóduje zbytok Met.
10. Purifikovaná a izolovaná molekula DNA podía nároku 2 obsahujúca substitúciu dvoch kodonov, z ktorých prvý odpovedá aminokyselinovej polohe trpB³⁷⁹ a druhý odpovedá amínokyselinovej polohe trpB³⁸² .
11. Purifikovaná a izolovaná molekula DNA podía nároku 10 obsahujúca kodonovú substitúciu kódujúcu aminokyselinový zbytok zvolený zo súboru zahrňujúceho Pro, Val, íle, Leu a Ala v kodone odpovedajúcom aminokyselinovej polohe trpB³⁷⁹ a kodonovú substitúciu kódujúcu aminokyselinový zbytok zvolený zo súboru zahrňujúceho Asn, Gly a Met v kodone odpovedajúcom aminokyselinovej polohe trpB³⁸² .
12. Purifikovaná a izolovaná molekula DNA podía nároku 11, kde kodonová substitúcia odpovedajúca aminokyselinovej polohe trpB³⁷⁹ kóduje zbytok Pro a kodonová substitúcia odpovedajúca aminokyselinovej polohe trpB³⁸² kóduje zbytok Met.
13. Purifikovaná a izolovaná molekula DNA podľa nároku 1 obsahujúca ďalej sekvenciu DNA jedného alebo viac génov zvolených zo súboru zahrňujúceho trpE, trpD, trpC a ťrpA.
14. Purifikovaná a izolovaná molekula DNA kódujúca polypeptidový analóg β-podjednotky tryptofan syntézy prejavujúca sa po zavedení do tryptofan syntézy zníženou tvorbou tryptofanu z indolu a serínu v zrovnaní s tryptofan syntézou obsahujúcou Asn³⁸²analóg β-podjednotky tryptofan syntézy.
15. Analóg β-podjednotky tryptofan syntézy prejavujúcej sa zvýšenou akumuláciou indolu v zrovnaní s tryptofan syntézou obsahujúcou Asn³⁸² analóg β-podjednotky tryptofan syntézy.
16. Analóg β-podjednotky tryptofan syntézy podľa nároku 15 obsahujúcu substitúciu jedného amínokyselinového zbytku za iný aminokyselinový zbytok v jednej alebo viac amínokyselinových polôh amínokyselinovej sekvencie β-podjednotky prírodnej tryptofan syntézy.
17. Analóg β-podjednotky tryptofan syntézy podlá nároku 16 obsahujúcu substitúciu amínokyselinového zbytku v amínokyselinovej polohe zvolenej zo súboru zahrňujúceho amínokyselinovú polohu trpB³⁷⁹ a amínokyselinovú polohu trpB³⁸² .
18. Analóg β-podjednotky tryptofan syntézy podlá nároku 17 obsahujúcu substitúciu amínokyselinového zbytku v amínokyselinovej polohe trpB³⁷⁹ .
19. Analóg β-podjednotky tryptofan syntézy podľa nároku 18 obsahujúcu aminokyselinový zbytok zvolený zo súboru zahrňujúceho Pro, Val, íle, Leu a Ala v amínokyselinovej polohe trpB³⁷⁹ . ^{20 * *}
20. Analóg β-podjednotky tryptofan syntézy podlá nároku 19 obsahujúci aminokyselinový zbytok Pro v amínokyselinovej polohe trpB³⁷⁹ .
21. Analóg β-podjednotky tryptofan syntézy podľa nároku 16 obsahujúcej substitúciu amínokyselinového zbytku v amínokyselinovej polohe trpB³⁸² .
22. Analóg β-podjednotky tryptofan syntézy podľanároku 21 obsahujúci aminokyselinový zbytok zvolený zo súboru zahrňujúceho Gly a Met v amínokyselinovej polohe trpB³⁸² .
23. Analóg β-podjednotky tryptofan syntézy podľa nároku 22 obsahujúci aminokyselinový zbytok Met v amínokyselinovej polohe trpB³⁸² .
24. .Analóg β-podjednotky tryptofan syntézy podľa nároku 16 obsahujúci substitúciu amínokyselinových zbytkov v amínokyselinovej polohe trpB³⁷⁹ a v amínokyselinovej polohe trpB³⁸² .
25. Analóg β-podjednotky tryptofan syntézy podľa nároku 24 obsahujúcu aminokyselinový zbytok zvolený zo súboru zahrňujúceho Pro, Val, íle, Leu a Ala v amínokyselinovej polohe trpB³⁷⁹ a aminokyselinový zbytok zvolený zo súboru zahrňujúceho Asn, Gly a Met v amínokyselinovej polohe trpB³⁸² .
26. Analóg β-podjednotky tryptofan syntézy podľa nároku 25 obsahujúci aminokyselinový zbytok Pro v amínokyselinovej polohe trpB³⁷⁹ a aminokyselinový zbytok Met v amínokyselinovej polohe trpB³⁸² .
27. Tryptofan syntéza zahrňujúca analóg β-podjednotky tryptofan syntézy prejavujúca sa zvýšenou akumuláciou indolu v zrovnaní s tryptofan syntézou obsahujúcou Asn³⁸² analóg βpodjednotky tryptofan syntézy.
28. Prokaryontná alebo eukaryontná hostiteľská bunka stabilne transformovaná alebo transfekovaná molekulou DNA podlá nároku 1 spôsobom umožňujúcim hostiteľskej bunke exprimovať za vhodných podmienok tryptofan syntézu.
29. Prokaryontná hostiteľská bunka podľa nároku 28, ktorá je Escherichia coli.
30. Biologicky funkčný plazmid alebo vírový vektor DNA obsahujúci molekulu DNA podlá nároku 1.
31. Prokaryontná alebo eukaryontná hostitelská bunka stabilne transformovaná alebo transfekovaná vektorom DNA podľa nároku 30 spôsobom umožňujúcim hostiteľskej bunke exprimovať za vhodných podmienok tryptofan syntézu.
32. Prokaryontná hostitelská bunka podlá nároku 31, ktorou je Escherichia coli.
33. Spôsob biosyntézy indolu v zvolenom hostiteľskom mikroorganizme, vyznačujúci sa tým, že sa

a) stabilne transformuje alebo transfekuje mikroorganizmus purifikovanou a izolovanou molekulou DNA kódujúcou polypeptidový analóg β-podjednotky tryptofan syntézy, čo má za následok zvýšenú akumuláciu indolu v rekombinantnom hostiteľskom mikroorganizme v zrovnaní s tryptofan syntézou obsahujúcou Asn' analóg β-podjednotky tryptofan syntézy; a

b) transformovaný alebo transfekovaný mikroorganizmus získaný podľa odstavca a) sa kultivuje za podmienok, pri ktorých produkuje intracelulárny indol.
34. Spôsob podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že molekula DNA podľa odstavca a) obsahuje kodonovú substitúciu kódujúcu amínokyselinový zbytok zvolený zo súboru zahrňujúceho Pro, Val, íle, Leu a Ala v kodone odpovedajúcom amínokyselinovej polohe trpB³⁷⁹ a kodonovú substitúciu kódujúcu amínokyselinový zbytok zvolený zo súboru zahrňujúceho Asn, Gly a Met v kodone odpovedajúcom amínokyselinovej polohe trpB³⁸² .
35. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že kodonová substitúcia odpovedajúca amínokyselinovej polohe trpB³⁷⁹ kóduje zbytok Pro a kodonová substitúcia odpovedajúca amínokyselinovej polohe trpB³⁸² kóduje zbytok Met.
36. Spôsob podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že molekula DNA je integrovaná do chromozómu hostiteľského mikroorganizmu.
37. Spôsob podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že molekula DNA je obsiahnutá v extrachromozomálnom prvku, ktorý je za vhodných podmienok schopný riadiť expresiu génov obsiahnutých v molekule tejto DNA.
38. Spôsob biosyntézy indiga vo zvolenom hostiteľskom mikroorganizme, vyznačujúci sa tým, že sa

a) stabilne transformuje alebo transfekuje mikroorganizmus purifikovanou a izolovanou molekulou DNA kódujúcu polypeptidový analóg β-podjednotky tryptofan syntézy, čo má za následok zvýšenú akumuláciu indolu v rekombinantnom hostiteľskom mikroorganizme v zrovnaní s tryptofan syntézou obsahujúcou Asn³⁸² analóg β-podjednotky tryptofan syntézy;

b) mikroorganizmus sa stabilne transformuje alebo transfekuje molekulu DNA kódujúcu aromatický dioxigenázový enzým schopný previesť indol na indoxyl;

c) mikroorganizmus sa kultivuje za podmienok umožňujúcich expresiu polypeptidov kódovaných molekulami DNA podľa odstavca a) a b) tak, že expresia týchto polypeptidov zaisťuje intracelulárnu akumuláciu indolu a prevedenie indolu na indoxyl;

d) indoxyl sa oxiduje na indigo; a

e) takto vyrobené indigo sa izoluje.
39. Spôsob podľa nároku 38, vyznačujúci sa tým, že molekula DNA podľa odstavca a) obsahuje kodonovú substitúciu kódujúcu amínokyselinový zbytok zvolený zo súboru zahrňujúceho Pro, Val, íle, Leu a Ala v kodone odpovedajúcom aminokyselinovej polohe trpB³⁷⁹ a kodonovou substitúciou kódujúci amínokyselinový zbytok zvolený zo súboru zahrňujúceho Asn, Gly a Met v kodone odpovedajúcom aminokyselinovej polohe trpB³⁶² .
40. Spôsob podľa nároku 39, vyznačujúci sa tým, že kodonová substitúcia odpovedajúca aminokyselinovej polohe trpB³⁷⁹ kóduje zbytok Pro a kodonová substitúcia odpovedajúca aminokyselinovej polohe trpB³⁸² kóduje zbytok Met.
41. Spôsob podľa nároku 38, vyznačujúci sa tým, že molekula DNA z odstavca a) je integrovaná do chromozómu hostiteľského mikroorganizmu.
42. Spôsob podľa nároku 38, vyznačujúci sa tým, že molekula DNA z odstavca a) je obsiahnutá v extrachromozomálnom prvku, ktorý je za vhodných podmienok schopný riadiť expresiu génov obsiahnutých v molekule tejto DNA.