SK280623B6 - Rekombinantný dna plazmidový vektor, cicavčia bunk - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka rekombinantného DNA plazmidového vektora, obsahujúceho cDNA kódujúcu ľudský erytropoetín, cicavčej bunky transformovanej transferom tohto vektora, rekombinantného ľudského erytropoetínu pripraviteľného v týchto bunkách postupom in vitro a spôsobu jeho výroby.

Doterajší stav techniky

Erytropoetín (ďalej označovaný ako EPO) je cirkulujúci glykoproteín, ktorý stimuluje tvorbu erytrocytov vo vyšších organizmoch, pozri Camot a spol., Compt. Rend., 143 : 384 (1906). Sám osebe je EPO niekedy označovaný ako erytropoesis stimulujúci faktor.

Čas životnosti ľudských erytrocytov je asi 120 dní. Asi 1/120 celkových erytrocytov je denne odbúraná v retikulo-endoteliálnom systému. Súčasne je denne produkovaný relatívne konštantný počet erytrocytov, aby bola stále udržaná určitá hladina erytrocytov (Guyton, Textbook of Medical Physiology, str. 56 až 60, W.B. Saunders Co., Philadelphia 1976).

Erytrocyty sú produkované zrcním a diferenciáciou erytroblastov v kosťovej dreni a EPO je faktor, ktorý pôsobí na menej diferencované bunky a indukuje ich diferenciáciu k erytrocytom (Guyton).

EPO je sľubný terapeutický prostriedok pre klinickú liečbu anémie alebo konkrétne renálnej anémie. V praktickej terapii nie je používanie EPO dosiaľ bežné pre jeho malú dostupnosť.

Na použitie EPO ako terapeutického prostriedku je potrebné uvážiť možné problémy antigenicity, a preto je výhodné pripravovať EPO zo suroviny ľudského pôvodu. Je možné napríklad použiť ľudskú krv alebo moč pacientov, postihnutých aplastickou anémiou alebo podobnými chorobami, ktoré spôsobujú vylučovanie veľkého množstva EPO. Tieto suroviny však sú k dispozícii v obmedzenom množstve, pozri napríklad White a spol., Rec.Progr.Horm.Res., 16; 219 (1960), Espada a spol., Biochem.Med., 3; 475 (1970), Fisher, Pharmacol. Rev., 459 (1972) a Gordon, Vítam. Horm. (N.Y.) 31; 105 (1973), ktoré sú tu zahrnuté ako odkazy.

Príprava EPO produktov sa obyčajne robila koncentráciou a čistením moču pacientov, majúcich vysokú úroveň EPO, napríklad pacientov, postihnutých aplastickou anémiou a podobnými chorobami, pozri napríklad patenty USA č. 4397840, 4303650 a 3865801. Obmedzená zásoba takého moču je prekážkou praktického použitia EPO a preto je veľmi žiaduce pripravovať EPO produkty z moču zdravých osôb. Problém použitia moču zdravých ľudí spočíva v jej nízkom obsahu EPO v porovnaní s anemickými pacientmi. Moč zdravých jedincov obsahuje určité inhibičné faktory, ktoré v dostatočne vysokej koncentrácii pôsobia proti erytropoéze, takže dostatočný terapeutický účinok môže byť pri EPO, získaného z takého moču, dosiahnutý iba pri použití nasledujúceho významného postupu čistenia.

EPO je možné rovnako regenerovať z ovčej krvnej plazmy a separácia EPO z tejto krvnej plazmy poskytla dostatočne potentné a stabilné vodorozpustné preparáty, pozri Goldwasser, Control Cellular Dif.Develop., diel A, str. 487 až 494, Alan R.Liss, Inc., N.Y. (1981). Dá sa však očakávať, že ovčí EPO bude pre ľudí antigénny.

Bežné izolačné a čistiace metódy pri použití prírodných zdrojov EPO teda nie sú adekvátne masovej produkcii tohto žiadaného terapeutického prostriedku.

Sugimoto a spol. v patente USA č. 4377513 opisujú jeden zo spôsobov masovej produkcie EPO, zahŕňajúci multiplikácic in vivo ľudských lymfoblastoidných buniek, zahŕňajúcich Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 a JBL.

Správy o produkcii EPO inými metódami genetického inžinierstva sa objavili v štandardnej literatúre. Nebol však zatiaľ publikovaný reprodukovateľný spôsob výroby ani chemická charakteristika produktu. Predmet tohto vynálezu naproti tomu predstavuje reprodukovateľný spôsob masovej produkcie proteínov, majúcich biologické vlastnosti ľudského EPO. Týmto spôsobom je možné rovnako produkovať proteiny, ktoré sa môžu chemicky líšiť od autentického ľudského EPO a súčasne mať podobné (a v niektorých prípadoch zlepšené) vlastnosti. Pre jednoduchosť sú tu všetky proteiny, majúce biologické vlastnosti ľudského EPO, označované ako EPO bez ohľadu na to, či s nim sú alebo nie sú chemicky identické.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je rekombinantný DNA plazmidový vektor, obsahujúci cDNA kódujúci ľudský EPO klonu lambda HEPOFL13 (ATCC 40153) a ďalej cicavčia bunka transformovaná týmto transfer vektorom. Uvedenou cicavčou bunkou je výhodne 3T3, C127 alebo CHO bunka.

Cicavčia bunka podľa vynálezu výhodne obsahuje plazmid, ktorý obsahuje celú DNA hovädzieho papilloma vírusu a cDNA sekvenciu z tabuľky 3 kódujúcu ľudský EPO. Touto bunkou môže byť bunka C127 alebo 3T3. EPO DNA v tejto bunke je výhodne pod transkripčnou kontrolou myšieho metalotionen promótora. Vo výhodnom rozpracovaní taká bunka obsahuje plazmid, obsahujúci DNA z pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224).

Predmetom vynálezu je ďalej tiež rekombinantný ľudský erytropoetín, charakterizovaný prítomnosťou O-napojenej glykozylácie, pripraviteľný stupňami

a) kultivácie CHO buniek obsahujúcich DNA sekvenciu kódujúcu ľudský erytropoetín vo vhodnom médie, kde uvedená DNA sekvencia je operatívne pripojená k expresnej kontrolnej sekvencií a

b) získania a oddelenia EPO z buniek a média.

Rekombinantný ľudský erytropoetín podľa vynálezu výhodne obsahuje glykozylové zvyšky zahŕňajúce zvyšky fúkózy. Prednostný erytropoetín podľa vynálezu je charakterizovaný glykozylačným profilom, zahŕňajúcim vzájomný molárny pomer hexóz k N-acetylglukózamínu (Nacglc)

1,4 : 1, konkrétne galaktózy. Nacglc = 0,9 : 1 a manózy: Nacglc = 0,5 : 1. Taký erytropoetín tiež prednostne obsahuje N-acetylga-laktózamín.

Konečne je predmetom vynálezu tiež spôsob výroby rekombinantného ľudského erytropoetínu (hEPO), ktorý zahŕňa stupne

a) kultivácie CHO buniek, ktoré obsahujú DNA sekvenciu kódujúcu hEPO operatívne pripojenú k expresnej kontrolnej sekvencií, vo vhodnom médie a

b) získania a separácie produkovaného rekombinantného hEPO z buniek a média, ktorého podstata spočíva v tom, že sa používajú CHO bunky majúce schopnosť poskytovať N- a O-pripojenú glykozyláciu so zavedením fúkózy a N-acetylgalaktóamínu, pričom z buniek a média sa získa a oddelí rekombinantný hEPO s N- a O-pripojenou glykozyláciou.

Predložený vynález sa teda týka klonovania génu, ktorý exprimuje prekvapivo vysoké hladiny ľudského EPO, jeho expresie a masovej produkcie aktívneho ľudského EPO in vitro. Sú tiež opísané vhodné expresné vektory pre produk ciu EPO, expresné bunky, schémy čistenia a príbuzné procesy.

Ako je podrobnejšie ďalej opísané, bol EPO získaný v čiastočne čistenej forme a bol ďalej čistený do homogenity a štiepený trypsínom za vzniku špecifických fragmentov. Tieto fragmenty boli čistené a sekvenovanč. EPO oligonukleotidy boli navrhnuté a syntetizované na základe týchto sekvencii, tieto oligonukletidy boli použité na skríning ľudskej genomickej knižnice, z ktorej bol izolovaný EPO gén.

EPO gén bol overený na základe svojej DNA sekvencie, ktorá zodpovedala mnohým zo sekvenovaných tryptických proteínových fragmentov. Časť genomického klonu potom bola použitá na demonštráciu pri hybridizácii, že EPO mRNA by mohla byť detegovaná v ľudskej fetálnej mRNA (starej 20 týždňov). Bola pripravená cDNA knižnica z pečene ľudského plodu a bola skrínovaná. Boli získané tri EPO cDNA klony (po skríningu > 750 000 rekombinantov). Dva z týchto klonov boli stanovené ako majúce plnú dĺžku podľa kompletnej kódujúcej sekvencie a v podstate 5-koníec a 3-koniec netranslatovanej sekvencie. Tieto cDNA boli exprimované v SV-40 vírusom transformovaných opičích bunkách (COS-1 bunková línia: Gluzman, Celí 23: 175182 (1981)) a bunkách vaječníkov čínskych chrčkov (bunková línia CHO; Urlaub G. a Chasin L.A. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77:4216-4280 (1980)). EPO, produkovaný z COS buniek, je biologicky aktívny EPO in vitro a in vivo. EPO, produkovaný z CHO buniek, je tiež biologicky aktívny in vitro a in vivo. EPO cDNA kloň má zaujímavý otvorený čítací rámček 14-15 aminokyselín (aminoacids -aa) s iniciátorom a terminátorom z 20 až 30 nukleotidov (nt) proti smeru kódujúcej oblasti. Reprezentatívna vzorka E. coli, transfektovaná klonovaným EPO génom, bola uložená v Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland a je dostupná pod prírastkovým číslom ATCC 40153.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Tabuľka 1 je sekvencia 87 párov báz exónu ľudského EPO génu;

- obr. 1 ilustruje detekciu EPO mRNA v ľudskej fetálnej pečeňovej mRNA;

- tabuľka 2 ilustruje aminokyselinovú sekvenciu EPO pratému, odvodenú z nukleotidovej sekvencie lambdaHEPOFL13;

- tabuľka 3 ilustruje nukleotidovú sekvenciu EPO cDNA v lambda-HEPOFL13 (uvedená schematicky na obr. 2) a z nej odvodenú aminokyselinovú sekvenciu;

- obr. 3 ilustruje relatívne polohy DNA inzertov štyroch nezávislých ľudských EPO genómických klonov;

- obr. 4 predstavuje mapu zjavnej intrónovej a exónovej štruktúry ľudského EPO génu;

- tabuľka 4 ilustruje DNA sekvenciu EPO génu, ilustrovanú na obr. 4B;

- obr. 5A, 5B a 5C ilustrujú konštrukciu vektora 91023(B);

- obr. 6 ilustruje SDS polyakrylamidovú gélovú analýzu EPO, produkovaného v COS-1 bunkách, v porovnaní s natívnym EPO,

- tabuľka 6 ilustruje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu EPO klonu, lambda-HEPOFL8;

- tabuľka 7 ilustruje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu EPO klonu, lambda-HEPOFL13;

- obr. 7 je schematickou ilustráciou plazmidu pRKl-4 a obr. 8 je schematickou ilustráciou plazmidu pdBPV-MMTneo(342-12).

Predložený vynález sa týka klonovania EPO génov a produkcie EPO in vitro expresiou týchto génov.

V patentovej a vedeckej literatúre je uvádzaných veľa spôsobov, vhodných na produkciu rekombinantných proteínov. Všeobecne tieto techniky zahŕňajú izoláciu alebo syntézu požadovanej génovej sekvencie a expresiu takej sekvencie buď v prokaryotickej alebo eukaryotickej bunke pri použití techník bežne odborníkom známych. Len čo bol gén izolovaný, čistený a izertovaný do transfer vektora (t. j. klonovaný), je zaistená dostupnosť podstatného množstva. Vektor s doňho klonovaným génom je transferovaný do vhodného mikroorganizmu alebo bunkovej línie, napríklad baktérie, kvasinky, cicavčích buniek, ako sú COS-1 bunky (opičie obličky), CHO (vaječníky čínskeho chrčka), hmyzie bunkové línie a podobne, kde sa vektor replikuje pri proliferácii mikroorganizmu alebo bunkovej línie a z ktorých vektor môže byť izolovaný bežnými prostriedkami. Je tak poskytnutý obnoviteľný zdroj génu pre ďalšie manipulácie, modifikácie a transfery do iných vektorov alebo iných miest v rovnakom vektore.

Expresia môže byť často dosiahnutá transferovaním klonovaného génu v správnej orientácii a čítacom rámčeku do vhodného miesta v transfer vektore tak, že translačný čítací postup z prokaryotického alebo eukaryotického génu vedie k syntéze proteínového prekurzora, obsahujúceho aminokyselinovú sekvenciu, kódovanú klonovaným génom, pripojeným k Met alebo aminokoncovej sekvencii z prokaryotického alebo eukaryotického génu. V obidvoch prípadoch môžu byť signály pre iniciáciu transkripcie a translácie dodané vhodným genomickým fragmentom klónovaného génu. Veľa špecifických techník štiepenia proteínov môže byť použitých na štiepenie proteínového prekurzora, keď je produkovaný, v požadovanom bode tak, aby sa uvoľnila požadovaná aminokyselinová sekvencia, ktorá môže byť potom čistená obvyklými prostriedkami. V niektorých prípadoch je proteín, obsahujúci požadovanú aminokyselinovú sekvenciu, produkovaný bez potreby špecifických techník štiepenia a môže byť tiež uvoľnený z buniek do extracelulámeho rastového média.

Izolácia genomického klonu ľudského EPO

Ľudský EPO bol čistený do homogenity z moču pacientov, postihnutých aplastickou anémiou, ako je to opísané. Úplné štiepenie tohto čisteného EPO proteázovým trypsínom poskytlo fragmenty, ktoré boli oddelené vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou s reverznou fázou, získané z gradientových frakcií a podrobené mikrosekvenčnej analýze. Sekvencie tryptických fragmentov sú podtrhnuté v tabuľkách 2 a 3 a sú podrobnejšie diskutované ďalej. Dve aminokyselinové sekvencie, Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys a Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg, boli zvolené pre návrh oligonukleotidových prób (vedúcich k oligonukleotidovému poolu 17 nt dlhému a 32-krát degenerovanému a oligonukleotidovému poolu 18 nt dlhému a 128-krát degenerovanému zo skoršieho tryptického fragmentu, ako tiež k dvom poolom 14 nt dlhým, vždy 48-krát degenerovaným, z neskoršieho tryptického fragmentu). 32-krát degenerovaný 17merový pool bol použitý na skrining ľudskej genomickej DNA knižnice v Ch4A vektora (22) pri použití modifikácie Woo-a a O'Malleye v in situ amplifikačnom postupe (47) na prípravu filtrov pre skrining.

Arabské číslice v zátvorkách (1) až (81) sú použité na označenie publikácií, ktoré sú uvedené podľa čísel na konci tohto opisu.

Fágy, hybridizujúce k 17meru, boli vybrané, spojené do malých skupín a probované s 14merovými a I8merovými poolmi. Fágy, hybridizujúce k 17merovým, 18merovým a

SK 280623 Β6

14merovým poolom, boli čistené a fragmenty boli subklonované do Ml3 vektorov pre sekvenciu dideoxy-retazec ukončujúci metódou podľa

Tabuľka 1

ĽtttcctacimttrIggccarcggccigagccttcugKgaťccttgactccccgifgctgtgIgcatttcaff a

ACG GGC TGT GCT GAA CAČ TGC AGC TTG ΑΛΤ GAG ΛΛΤ ATC

Thľ Gly Cys Ala Clu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn íle

ACT CTC CCA OAC ACC AAA CTT ΛΛΤ TTC TAT GCC TGC AAG

Thr Val Pro Asp Thr Lys Vtil Asn Phe Tyr Ala Trp Lys

AGG AŤG GAGjrtgagttcclttttttttltttttcctttctUtggognatctcatttgcgagcctg

Arg MET Glu 3 atttlggatgaaagggagaalgate

Tabuľka 2 íitŕ GLY VAL HIS GLU CYS PHO ALA TUP LEV Irtf LEU LCU LEU $£P. LEV LEU SER LEU PRU LEU GLY l£B PRO VAL LEU GLY »l. Pro fru Arr L»· II» ^{w Aw> ,!>t}- ^{Art w L}°^{u clu Arg TyT 0111 A}'*

G!w_.AI«_-Ghj *« IJ»_ TK> Thr Cly »U nu III. Cp« «.» Leu A«* Clu itn 11« Thr

1# «

V»l Pre Α·ρ Thr Lj« V»l A«n !*tn Tyr Al« Trt tr> Arg Met Glu Víl Cl» Cín Gin Al·

Tabuľka 3 cteggigce í««g«g<«

CCCttt»C»t CCgCCCECtC CtCCÍggCCC gitgggcCgg _xa'«»ec«g₍ cs»£ccee»t cUgctgagg M««»gte ígccgcgiíg ccgigcctcc cttCatCACSC cccccgtcjt -2 J

HtT CLT TAL »11 CLU CTS MO

ATC CCC CTC CAC CAA TCT CCT ▲

ALA TU LEU TV LEU LEU LEU SE1 LEU LEV Stt LEU MO LEV -CLT LEU MO VAL LCU CLE

CCC TGC CTC TCC CTT CTC CTC TCC CTG CIC TCC CTC CCT CTG OCO CTC CCA CTt CTC CCC tSO WO

Ltu Phe Ar» V>1 Tyr Ser *»» Phe. l.e»_Ar» Cly ty e l.eu Ly« Lem Tyr Thr Cly Cl» AU

CTC TTC CSA CTC TAC TCC AAT TTC CTC CCG OCA AAC CTC AAC CTC Tie ACA CCC CAC CCC

Si US

Cví Ar» Thr Cl» líp Arg

TCC ACC ACA CCG CAC ACA TCA ce»Ct'E tEtecaeetc jteatacce· ea_acccagcg ccascct(ce ccacftacac ccuauBtg gpcacagee tlCPtCcta

CCCICtGCCí teaeamee •CgectSt» geaíEgacic aaett£ig[g e«CC«C'Gt etcaccHcc ccugagcag ereaetq-ge CCDCCegftt» agaggíacrg gsagcactci «ccecgeaaa cceagagagc β»Ε311«|ίΑ MtCE-tgcc tegaoaacCC aaeterEM· ttaaactcig aggacaegec agC'tt'»t

Sangera a Coulsona (23) (1977). Sekvencia regiónu, hybridizujúceho k 32násobne degenerovanému 17meru v jednom z klonov, je uvedená v tabuľke 1. DNA sekvencia obsahuje v otvorenom čítacom rámčeku nukleolidy, ktoré by mohli presne kódovať tryptický fragment, použitý na odvodenie 17merového poolu oligonukleotidov. Ďalej analýza DNA sekvencie indikuje, že 17merový hybridizujúci región bol obsiahnutý v 87bp exóne, naviazanom v miestach potenciálneho zostrihu akceptora a donoru.

Pozitívne potvrdenie, že tieto dva klony (tu označené ako lambda-HEPOl a lambda-HEP02) sú EPO genomické klony, bolo získané sekvenovaním ďalších exónov, obsahujúcich iný tryptický fragment, kódujúci informácie.

Izolácia EPO cDNA klonov

Bola vykonaná Northem analýza (56) ľudskej fetálnej (20 týždňov starej) pečeňovej mRNA pri použití 95nt jednoreťazcovej próby, pripravenej z M13 klonu, obsahujúceho časť 87bp exónu, opísaného v tabuľke 1. Ako je ilustrované na obr. 1, bolo možné detegovať silný signál vo fetálnej jadrovej mRNA. Presná identifikácia tohto pásu ako EPO mRNA bola vykonaná pri použití rovnakej próby k skríningu bakteriofágovej lambda cDNA knižnice fetálnej pečeňovej mRNA (25). Bolo získaných niekoľko hybridizujúcich klonov pri frekvencii približne 1 pozitívny na 250 000 rekombinantov. Kompletný nukleotid a odvodené od týchto klonov (lambdaHEPOFL13 a lambda-HEPOFL8) sú uvedené v tabuľkách 5 a 6. EPO kódujúci informácie je obsiahnutý v 594nt v 5-koniec polovine cDNA, zahŕňajúcej veľmi hydrofóbny 27 aminokyselinový leader a 166 aminokyselinového zrelého proteínu.

Identifikácia N-konca zrelého proteínu bola založená na N-koncovej sekvencii proteínu, sekretovaného do moču osôb s aplastickou anémiou, pozri tabuľku 1, a ako publikovali Goldwasser (26), Sue a Sytkowski (27) a Yangawa (21). Či tento N-koniec (Ala-Pro-Pro-Arg-) predstavuje skutočný N-koniec, naviazaný na EPO v obehu, alebo či prebieha nejaké štiepenie v obličkách alebo moči, nie je v súčasnosti známe.

Aminokyselinové sekvencie, ktoré sú podtrhnuté v tabuľkách 2 a 3, označujú tie tryptické fragmenty alebo časti, z ktorých bola získaná proteínová sekvencia. Dedukovaná sekvencia presne súhlasí s tryptickými fragmentmi, ktoré boli sekvenované, čo potvrdzuje, že izolovaný gén kóduje ľudský EPO.

Štruktúra a sekvencie ľudského EPO génu

Relatívne polohy DNA inzertov štyroch nezávislých ľudských EPO genomických klonov sú uvedené na obr. 3. Hybridizačná analýza týchto klonov s oligonukleotidovými próbami a s rôznymi próbami, pripravenými z dvoch tried EPO cDNA klonov, umiestňuje EPO gén do približne 3,3 kb oblasti, znázornenej na obr. 3 tmavou čiarou. Kompletná sekvenčná analýza tejto oblasti (pozri príklad 4) a porovnanie s cDNA klonmi vedie k mape intrónovej a exónovej štruktúry EPO génu, uvedenej na obr. 4. EPO gén je rozdelený do 5 exónov. Časť exónu I, celé exóny II, III a IV a časť exónu V, obsahujú proteín, kódujúci informáciu. Zvyšné exóny I a V kódujú 5-koniec a 3-koniec netranslatovanej sekvencie.

Prechodná expresia EPO v COS bunkách

Na demonštrovanie, že biologicky aktívny EPO by mohol byť exprimovaný v in vitro bunkovom systému, bola uskutočnená COS bunková expresná štúdia (58). Vektor, použitý na prechodné štúdie, p91023 (B), je opísaný v príklade 5. Tento vektor obsahuje adenovírusový hlavný neskorý promótor, SV40 polyadenylačnú sekvenciu, SV40 pôvod replikácie, SV40 enhancer a adenovírusový VA gén. cDNA inzert v lambda-HEPOFL13 (pozri tabuľka 6) bola inzertovaná do p91023(B) vektora po smere od hlavného neskorého promótora. Tento nový vektor je označený ako PPTFL13.

Dvadsaťštyri hodín po transfekcii tohto konštruktu do M6 kmeňa COS-1 buniek (Horowitz a spol., J. Mol. Appl. Genet. 2: 147-149 (1983)) boli bunky premyté, premiestne4 né do séra bez média a bunky boli zobrané o 48 hodín neskoršie. Hladina uvoľnenia EPO do supematanta kultúry potom bola hodnotená pri použití kvantitatívnej rádioimunoeseje pre EPO (55). Ako je uvedené v tabuľke 8 (príklad 6), bol exprimovaný imunologický reaktívny EPO. Biologická aktivita EPO, produkovaného z COS-1 buniek, bola tiež hodnotená. V oddelenom pokuse bol vektor, obsahujúci EPO cDNA z lambda-HEPOFL13, transfektovaný do COS-1 buniek a médium bolo zobrané ako je to opísané. EPO v médiu bol potom kvantifikovaný buď v dvoch in vitro biologických skúškach, ³H-tymidínom a CFU-E (12, 29) a potom dvoma in vivo skúškami, hypoxickou myšou a vyhladovenou myšou (30, 31) (pozri tabuľku 9, príklad 7). Tieto výsledky demonštrujú, že biologicky aktívny EPO je produkovaný v COS-1 bunkách. Pri Westem-blottingu s použitím polyklonálnej anti-EPO protilátky, EPO produkovaný COS bunkami má mobilitu na SDS-polyakrylamidových géloch, ktorá je identická s mobilitou natívneho EPO, pripraveného z ľudského moču (príklad 8). Rozsah glykozylácie EPO, produkovaného COS-1, môže byť podobný ako pri natívnom EPO.

Rôzne vektory, obsahujúce iné promôtory, môžu byť tiež použité v COS bunkách alebo v iných cicavčích alebo eukaryotických bunkách. Príklady takých iných promótorov, vhodných pri rozpracovaní vynálezu, zahŕňajú SV40 časné a neskoré promôtory, promótor myšieho metalotioneinového génu, promótor, nájdený v dlhých terminálnych opakovaniach vtáčích alebo cicavčích retrovírusov, promótor bakulovírusového polyhedron génu a iné. Príklady typov iných buniek, vhodných v praktickom rozpracovaní tohto vynálezu, zahŕňajú E. coli, kvasinkové, cicavčie bunky, ako sú CHO (vaječník čínskeho chrčka), C127 (opičí epitel), 3T3 (myší fibroblast), CV-1 (obličky africkej opice - Afričan green monkey kidney) a hmyzie bunky, ako sú bunky z Spodoptera fŕugiperda a Drosophila melangaster. Tieto alternatívne promôtory a/alebo bunkové typy môžu umožňovať reguláciu načasovania alebo hladiny EPO expresie, produkcie bunkové špecifických typov EPO alebo rastu veľkých množstiev EPO produkujúcich buniek za menej nákladných, ľahšie kontrolovateľných podmienok.

Expresný systém, ktorý si zachováva výhody cicavčej expresie, ale vyžaduje kratší čas na produkciu vyššej hladiny expresie bunkovej línie, sa skladá z hmyzej bunkovej línie a DNA vírusu, ktorý sa reprodukuje v tejto bunkovej línii. Vírus je vírus jadrovej polyhedrózy. Má dvojvláknový cirkulámy DNA genóm s veľkosťou 128 kb.

Nukleokapsid je tyčkovite tvarovaný a nachádza sa obalený v dvoch formách, neokludovanej forme vírusu, prerastajúceho membránou, a okludovanej forme, obalenej v proteínovom kryštále v jadre infikovanej bunky. Tieto vírusy môžu byť rutinne propagované v in vitro hmyzej bunkovej kultúre a sú prispôsobivé všetkým rutinným vírusovým metódam u živočíchov. Médium bunkovej kultúry je typicky živný soľný roztok a 10% fetálne teľacie sérum.

In vitro je rast vírusu iniciovaný, keď neokludovaný vírus (NOV) vstupuje do bunky a prechádza do jadra, kde sa replikuje. Replikácia je jadrová. Počas počiatočnej fázy (8-18 hodín po infekcii) vírusovej aplikácie sú nukleokapsidy zhromaždené v jadre a následne prerastajú plazmovou membránou ako NOV a rozširujú infekciu v bunkovej kultúre. Navyše niektoré nukleokapsidy následne (18+ hodín po infekcii) zostávajú v jadre a sú okludované v proteínovej matrici a sú známe ako polyhedrálne inkluzné teliesko (PIB). Táto forma nie je v bunkovej kultúre infekčná. Matrica je zložená z proteínu, známeho ako polyhedrín, mol. hmotnosť 33 kd. Každý PIB má približne 1 mm v priemere a v jadre môže byť až 100 PIB. V neskorej fáze infekčného cyklu je produkovaný tak veľký podiel polyhedrínu, ktorý robí až 25 % celkového bunkového proteínu.

Pretože PIB nemá žiadnu úlohu v in vitro replikačnom cykle, môže byť polyhedrínový gén deletovaný z vírusového chromozómu bez ovplyvnenia životaschopnosti in vitro. Pri použití vírusu ako expresného vektora bola nahradená polyhedrínový gén kódujúca oblasť cudzou DNA, ktorá má byť exprimovaná, a bola tak umiestnená pod kontrolu polyhedrín promótora. Výsledkom je vírusový fenotyp, netvoriaci PIB.

Tento systém bol použitý niekoľkými výskumníkmi, z ktorých sú najčastejšie uvádzaní Pennock a spol. a Smith a spol. Pennock a spol. (Gregory D.Pennock, Charles Shoemaker a Lois K. Miller, Molecular and Celí Biology 3 : 84, str. 399 - 406) opisujú vysokú hladinu expresie bakteriálneho proteínu, S-galaktozidázy, keď je umiestnený pod kontrolou polyhedrínového promótora.

Iný expresný vektor, odvodený od jadrového polyhedrózneho vírusu, bol opísaný Smithom a spol. (Gale E. Smith, Max D.Summers a M.J.Fraser, Molecular nad Celí Biology, 16. mája 1983, str. 2156-2165). Títo autori demonštrovali účinnosť svojho vektora v expresii ľudského B-interferónu. Syntetizovaný produkt bol nájdený ako glykozylovaný a sekretovaný z hmyzích buniek, ak sa to očakávalo. V príklade 14 sú opísané modifikácie plazmidu, obsahujúceho Autographa califomica jadrový polyhedrosis vírusový (AcNPV) polyhcdrónový gén, ktoré umožňujú ľahkú inzerciu EPO génu do plazmidu, takže môže byť pod transkripčnou kontrolou polyhedrínového promótora. Výsledná DNA je ko-transfektovaná intaktnou chromozómovou DNA zo štandardného typu AcNPV do hmyzích buniek. Genetická rekombinácia vedie k nahradeniu AcNPVC oblasti polyhedrínového génu DNA z plazmidu. Výsledný rekombinantný vírus môže byť identifikovaný medzi vírusovým potomstvom tým, že má DNA sekvencie EPO génu. Tento rekombinantný vírus má po reinfekcii hmyzích buniek produkovať EPO.

Príklady EPO expresie v CHO, C127 a 3T3 a hmyzích bunkách sú uvedené v príkladoch 10 a 11 (CHO), 13 (C 127 a 3T3) a 14 (hmyzie bunky).

Rekombinantný EPO, produkovaný v CHO bunkách ako v príklade 11, bol čistený bežnými metódami stĺpcovej chromatografie. Relatívne množstvo cukrov, prítomných v glykoproteíne, bolo analyzované dvoma nezávislými metódami [(I) Reinold, Methods in Enzymol. 50:244-249 (Methanolysis) a (II) Takemoto H. a spol., Anál. Biochem. 145:245 (1985) (pyridylaminácie, spolu s nezávislým stanovením kyseliny sialovej)]. Výsledky, získané v každej metóde, boli vo vynikajúcom súlade. Bolo vykonaných niekoľko stanovení, poskytujúcich nasledujúce priemerné hodnoty, kde N-acetylglukosamín je na porovnávacie účely označený hodnotou 1:

Cukor relatívna	moláma hladina
N-acetylglukosamín	1
hexózy:	1,4
galaktóza		0,9
manóza		0,5
kyselina N-acetyluramínová	1
fúkóza	0,2
N-acetylgalaktozamín	0,1

Je potrebné uviesť, že významné hladiny fúkózy a N-acetylgalaktozamínu boli reprodukovateľné pozorované pri použití obidvoch nezávislých metód analýzy cukrov. Prítomnosť N-acetylgalaktozaminu indikuje prítomnosť O-napojenej glykozylácie na proteín. Prítomnosť O-napojenej glykozylácie boli ďalej indikované SDS-PAGE analýzou glykoproteínu s nasledujúcim štiepením glykoproteínu

SK 280623 Β6 s rôznymi kombináciami glykozidických enzýmov. Po enzymatickom odštiepení všetkých N- napojených karbohydrátov na glykoproteinach pri použití enzýmu peptid endo F N-glykozidáza, bola molekulová hmotnosť proteínu ďalej znižovaná nasledujúcim štiepením s neuraminidázami, ako bolo stanovené pomocou SDS-PAGE analýzy. In vitro biologická aktivita čisteného rekombinantného EPO bola skúšaná metódou G.Krystala, Exp. Hematol. 11 : 649 (1983) (bioesej proliferácie slezinových buniek) s proteínovými ukončenými, vypočítanými na základe údajov o aminokyselinovom zložení. Po viacnásobných ukončeniach bola in vitro špecifická aktivita čisteného rekombinantného EPO vyrátaná ako vyššia ako 200 000 jednotiek/mg proteínu. Priemerná hodnota bola v rozmedzí asi 275 000 - 300 000 jcdnotick/mg proteínu. Navyše boli tiež pozorované hodnoty vyššie ako 300 000. Pomery in vivo/polycytemická esej na myšiach, Kazal a Erslev, Am. Clinical Lab. Sci., Vcl. B, str. 91 (1975)/in vitro aktivity, pozorované pre rekombinantný materiál, boli v rozmedzí 0,7 až 1,3.

Je zaujímavé porovnať glykoproteínové charakteristiky, uvedené pre rekombinantný CHO-produkovaný EPO materiál, skôr uvedený v medzinárodnej patentovej prihláške č. WO 85/02610 (publikovanej 20. júna 1985). Zodpovedajúca porovnateľná analýza cukrov, opísaná na str. 65 tejto prihlášky udáva nulovú hodnotu pre fukózu a pre N-acetylgalaktozamín a pomer hexózy : N-acetylgalaktozamín 15,09 : 1. Neprítomnosť N-acetylgalaktozamínu indikuje neprítomnosť O-napojenej glykozylácie v skôr uvádzanom glykoproteíne. Na rozdiel od tohto materiálu, rekombinantný CHO-produkovaný EPO podľa tohto vynálezu, ktorý je charakterizovaný, obsahuje významné a reprodukovateľné pozorovateľné množstvá tak tukózy, ako Nacetylgalaktozamínu, obsahuje menej ako jednu desatinu relatívneho množstva hexóz a je charakterizovaný prítomnosťou O-napojenej glykozylácie. Ďalej môže byť vysoká špecifická aktivita opísaného CHO-ziskaného rekombinantného EPO podľa tohto vynálezu priamo vztiahnutá k svojmu charakteristickému glykozylačnému usporiadaniu.

Biologicky aktívny EPO, produkovaný prokaryotickou alebo eukaryotickou expresiou klonovaných EPO génov podľa predloženého vynálezu, môže byť použitý pre in vivo liečbu cicavčích druhov lekármi a/alebo veterinármi. Množstvo účinnej zložky bude samozrejme závisieť od intenzity liečenej choroby, zvoleného spôsobu podania a špecifickej aktivity aktívneho EPO, a v konečnej podobe bude stanovené príslušným lekárom alebo veterinárom. Také množstvo aktívneho EPO, stanovené príslušným lekárom, je tu tiež označené ako „liečebne účinné EPO“ množstvo. Napríklad v liečbe indukovanej hypoproliferatívnej anémie, spojenej s chronickým zlyhaním obličiek ovce, bolo účinné denné množstvo EPO 10 jednotiek/kg počas 15 až 40 dní. Pozri Eschbach a spol., J.Clin.Invest., 74 : 434 (1984).

Účinný EPO môže byť podávaný akýmkoľvek spôsobom vhodným pre stav, ktorý je liečený. Výhodne je EPO injektovaný do krvného prúdu liečeného cicavca. Odborníkovi v odbore bude zrejmé, že preferovaný spôsob podania sa bude meniť podľa liečeného stavu.

Pri účinnom EPO je možné, aby bol podávaný buď ako čistá zlúčenina alebo v podstate čistá zlúčenina, je výhodné ho podávať vo forme farmaceutickej formulácie alebo preparátu.

Formulácie podľa predloženého vynálezu tak na veterinárne ako humánne použitie obsahujú účinný EPO proteín, ako je opísaný, spolu s jedným alebo viacerými jeho farmaceutický prijateľnými nosičmi a prípadne ďalšie terapeutické zložky. Nosič(e) musia byť prijateľné v tom zmysle, že sú kompatibilné s inými zložkami formulácie a neškodia jej príjemcovi. Je žiaduce, aby formulácia neobsahovala oxidačné činidla a iné substancie, o ktorých je známe, že nie sú s peptidmi kompatibilné. Formulácia môže byť výhodne vo forme jednotkovej dávkovej formy a môže byť pripravená akoukoľvek metódou, známou v odbore farmácie. Všetky metódy zahŕňajú stupeň uvedenia do spojenia účinnej zložky s nosičom, ktorý tvorí jedna alebo viac pomocných zložiek. Všeobecne sú formulácie pripravené homogénnym a dokonalým spojením účinnej zložky s kvapalnými nosičmi alebo jemne delenými pevnými nosičmi, alebo obidvoma typmi nosičov a potom sú, keď je to nevyhnutné, produkty tvarované do požadovaného tvaru.

Formulácie, vhodné na parenterálne podanie, obyčajne zahŕňajú sterilné vodné roztoky účinnej zložky s roztokmi, ktoré sú výhodne izotonické s krvou príjemcu. Také formulácie môžu byť výhodne pripravené rozpustením pevnej účinnej zložky vo vode za vzniku vodného roztoku a sterilizáciou roztoku v jedno alebo viacdävkových nádobkách, napríklad zatavených ampulách alebo fľaštičkách.

Tu používaný EPO/cDNA zahŕňa zrelý EPO/cDNA gén, ktorému predchádza ATG kodón a EPO/cDNA kódujúca alelické variácie EPO proteínu. Jedna alela je ilustrovaná v tabuľkách 2 a 3. EPO proteín zahŕňa 1-metioninový derivát EPO proteínu (Met-EPO) a alelické variácie EPO proteínu. Zrelý EPO proteín, ilustrovaný sekvcnciami v tabuľke 2, začína sekvenciou Ala-Pro-Pro-Arg..., ktorej začiatok je v tabuľke 2 označený číslom „1“. Met-EPO by začínal sekvenciou Met-Ala-Pro-Prc-Arg....

Nasledujúce príklady slúžia na lepšie porozumenie vynálezu, ktorého rozsah je daný pripojenými nárokmi. Je pochopiteľné, že modifikácie môžu byť uskutočnené v uvedených postupoch, bez toho aby bol prekročený rozsah vynálezu. Všetky teploty sú udávané v stupňoch Celsia a nie sú korigované. Symbol mikrón alebo mikro, napr. mikroliter, mikromol atď., je „p“, napr. pl, pm atď.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Izolácia genomického klonu EPO

EPO bol čistený z moču pacientov s aplastickou anémiou v podstate ako to bolo opísané (Miyake a spol., J. Biol. Chem., 252 : 5558 (1977)) s tým rozdielom, že bolo vynechaná spracovanie s fenolom a nahradené tepelným spracovaním pri 80 °C počas 5 minút pre inaktiváciu neuraminidázy.

Konečným stupňom čistenia bola frakcionácia na C-4 Vydac HPLC kolóne (The Separation Group) s použitím 0 až 95 % acetónového gradientu s 0,1 % kyselinou trifluóroctovou (TFA) počas 100 minút. Poloha EPO v gradiente bola stanovená gólovou elektroforézou a N-terminálnou sekvenčnou analýzou (21,26, 27) hlavných píkov. EPO bol eluovaný približne 53 % acetonitrilom a predstavuje približne 40 % proteínu, podrobeného HPLC s reverznou fázou. Frakcie, obsahujúce EPO, boli odparené na 100 pl, upravené na pH 7,0 hydrogenuhličitanom amónnym, dokonale štiepené 2 % TPCK-spracovaným trypsínom (Worthington) 18 hodín pri 37 °C. Produkt tryptického štepenia bol potom podrobený HPLC s reverznou fázou, ako je to opísané. Bola sledovaná optická hustota tak pri 280, ako 214 nm. Dobre oddelené piky boli odparené takmer do sucha a podrobené priamo N-terminálnej aminokyselinovej sekvenčnej analýze (59) pri použití Applied Biosystems Model 480Ab sekvenátora v plynovej fáze. Získané sekvencie sú v tabuľkách 2 a 3 podtrhnuté. Ako je tu uvedené, boli dva z týchto tryptických fragmentov zvolené pre syntézu oligonukleotidových prób.

Zo sekvencie Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys boli pripravené (aminokyseliny 46 až 52 v tabuľkách 2 a 3) 17mer 32-násobné degenerácie TTCCANGCGTAGAAGTT a 18 mer 128-násobné degenerácie CCANGCGTAGAAGTTNAC.

Zo sekvencie Val-Tyr-Ser-ASn-Phe-Leu-Arg (aminokyseliny 144 až 150 v tabuľkách 2 a 3) boli pripravené dva pooly 14merov, každý 32-násobne degenerovaný TACACCTAACTTCCT a TACACCTAACTTCTT, ktoré sa odlišujú v prvej polohe pripraveného leucinového kodónu. Oligonukleotidy sú značené na 5-koniec konci pomocou ³²P použitím polynukleotid-kinázy (New England Biolabs) a gama ³²P-ATP (New England Nuclear). Špecifická aktivita oligonukleotidov sa menila medzi 1000 a 3000 Ci/mmol oligonukleotidu. Ľudská genomická DNA knižnica v bakteriofágu lambda (Laen a spol., 22) bola skrínovaná pri použití modifikácie in situ amplifikačného postupu, pôvodne opísaného Wooom a spol. (47) (1978). Približne 3,5 x 10⁵ fágov bolo umiestnených v hustote 6000 fágov na 150 mm Petriho misku (NZCYM médium) a inkubovaných pri 37 °C do viditeľných povlakov, ktoré sú však malé (približne 0,5 mm). Po 1 hodine chladenia pri 4 °C boli duplikátové kópie vzoriek povlakov prenesené na nylonové membrány (New England Nuclear) a inkubované cez noc pri 37 °C na čerstvých NZCYM platniach. Filtre potom boli denaturované a neutralizované 10-minútovým pobytom počas 10 minút na tenkom filme 0,5N NaOH - IM NaCl a 0,5M Tris (pH 8) - IM NaCl. Po vákuovom sušení pri 80 °C počas 2 hodín boli filtre premyté v 5 x SSC, 0,5 % SDS 1 hodinu a bunkové zlomky na povrchu filtra boli odstránené miernym škrabaním vlhkou tkaninou. Toto škrabanie redukuje podstatnú väzbu próby k filtrom. Filtre potom boli premyté vodou a prehybridizované počas 4 až 8 hodín pri 48 °C v 3M tetrametylamóniumchloridu, 10 mM NaPO4 (pH 6,8), 5 x Denhardtovom roztoku, 0,5 % SDS a 10 mM EDTA. ³²P značený 17mer bol potom pridaný v koncentrácii 0,1 pmol/ml a hybridizácia bola vykonaná pri 48 “C počas 72 hodín. Po hybridizácii boli filtre intenzívne premyté 2 x SSC (0,3M NaCl - 0,03M Na-citrát, pH 7) pri teplote miestnosti a potom 1 hodinu v 3M TMAC1 - 10 mm NaPO4 (pH 6,8) pri teplote miestnosti a od 5 do 15 minút pri hybridizačnej teplote. Približne 120 silných duplikátových signálov bolo detegovaných 2 dni po autorádiografii za intenzifikačného skríningu. Pozitívy boli vybrané, zhromaždené po 8 a opäť trikrát reskrínované pri použití jednej poloviný 14merového poolu na každom z dvoch filtrov a 127meru na treťom filtre. Podmienky a 17mer pre umiestnenie na platňu sú opísané s výnimkou, že hybridizácia pre 14mer bola pri 37 °C. Po autorádiografii boli próby odstránené zo 17merového filtra v 50 % formamide počas 20 minút pri teplote miestnosti a filter bol rehybridizovaný pri 52 °C s 18merovou próbou. Dva nezávislé fágy hybridizujú k všetkým trom próbam. DNA z jedného z týchto fágov (tu označený lambda HEPO1) bola dokonale štiepená pomocou Sau3A a subklonovaná do Ml3 pre DNA sekvenčnú analýzu pri použití dideoxy reťazec terminujúcej metódy podľa Sangera a Coulsona, (23) (1977). Nukleotidová sekvencia a odvodená aminokyselinová sekvencia otvoreného čítacieho rámčeka, kódujúca pre EPO tryptický fragment (podtrhnutá oblasť), sú tu opísané. Intrónové sekvencie sú uvedené malými písmenami, exónové sekvencie (87nt) veľkými písmenami. Sekvencie, ktoré súhlasia s miestami akceptorového (a) a donorového (d) strihu, sú podtrhnuté (pozri tabuľka 4).

Príklad 2

Northern analýza mRNA pečene ľudského plodu pg mRNA pečene ľudského plodu (pripravené z pečene 20-týždenného ľudského fetu) a mRNA pečene dospelého človeka bolo elektroforezovaných v 0,8 % agarózovom formaldehydovom géli a transferovaných na nitrocelulózu pri použití metódy Dermana a spol., Celí, 23 : 731 (1981). Jednoreťazcová próba potom bola pripravená z Ml3 templátu, obsahujúceho inzert, ilustrovaný v tabuľke 1. Prajmer bol 20mer, získaný z rovnakého tryptického fragmentu, ako pôvodná 17merová próba. Próba bola pripravená, ako to opísal Anderson a spol., PNAS, (50) (1984), s tým rozdielom, že nasledujúce štiepenie pomocou Amal (ktoré produkuje požadovanú próbu dĺžky 95nt, obsahujúce 74nt kódujúce sekvencie), malý fragment bol čistený z ml3 templátu chromatografiou na stĺpci sepharózy C14B

Tabuľka 4 aget cceggget tecagaeet<igc(ac tt IgeggaaeteaEeaflcecaggea tetet gact eteegeeeaaeacc gg|*ai£eeeeceagf,A(gcgceegc(tigeec«gccctieecagni ge.igcteegceegtcceaíictetgctc·· ISO ccttctfcuctcccctcccBcgiicccaixi’ccefxgageageccecattacecaeaef'.caeiiuteeí'Bcagecc cr,ic.->Bcecccr.acccteAacccaEgcgtcct£cecetgctctgaccecgEttggeccctacceet((CBaccce 300 tcacBcneacatcetetcceccacecccaccegŕgeacgcaeaeetEcagacancafiecccEaecceeiiccaga neCReaej>Rtceet_e8geenrCCCC«:cCCCTCCCTCCĽCTCCUCCCCACCGC<;CTCTCCTCr.aWACCCCCACCC A 50 t:CCCC*CCCCecCCCCTCTCCTCCC*CACCCCCCCCCCTCCACAKCCCCCCTCTCCTCCACCCCCCTCCCCCTCC CCCTĽĽACCCCCCACCTTCCCCCt'ATrACCGCCCCCCCTCTCCTCACCCCCCCCCCCCCACCTCCCTCACCCACC 660 (jCCCCCAUCCCCCCACATCCCCCTCCACCgtgagtaccegegggctcggcEcteecgeecgecetggtcectgtt Hetf.lyVaillIaG tgagcggggatttagcgccceggctaetgtecaggaggtggetgggttcaDggaccggegaettgteaaggaecc 750 cggaaggfiggaBEggBStlSetCMCCtecacgtgccARCftSAgact' wtgggngtectt jtgggatgeeenaaac ccgacctgtgaagEgcaeacagtttggiggetEAggEgaacaaEEtceggggEgCtctgctttgccagtggagag 900 gaagetgataagctBatiacctgggCBctggagccBecacttatccgccagatggta»£crtccgtcaeaceagg at tgnngtttgBecg|agaagtgcatectt|ťigcctgggr.C<CRggCgťtc*^cactg^eaE<*<l!gmtgaatgaa 10SQ. ggcci'BggAggcagcaecigagcgcctccatgEtcggggacatgaeggaegagettgggcagagaegtggggatg aagcaegctctcettccaea(ceacccttctcccteceeBeetgactcteageetggŕtatetgt tetaEAATCT 1200’ - CCrCCCTCriCTCTCRCTTCTCCTCTCCCTCCTGTCCCTCCCTCTCCCCCTCaACTCCTCtXCCCCCCACCAcÉc FroAlaTrpLcuTrpl.col^oLcuSerl^uLcuSerLeuProLauClytauProValLeuCIyAlaFroProArg CTCATCtCTCACACCCCACTCCTtXACACCTACCTCTrec.AĽCCCAACCACCCCCACAATATCACCgtBatecce I35Ď , Lenil eCyaAapSerArgValleuCl uArgTyrLauLauCluAIaLyaCluAlaGluAtnl leThr c 11 c crcnRcnca 11 ccacngaac t cnŕf.e t caRggc 11 c e ftggaiic t cc t c· r.at c cag(a*ec t (gcact C ggccrgEítgcggaEctEBgaagctagacaecgeeeceeiaeacaagaacaagtetggtagececaaaccataccc 1500 ggaaaccaggcaagBagcaaaecengcagatcctacgectgtggccagggceagBgecttcegggacccttgnet cceeBBgetgegtgeatteeagACCCCCTCTCCTCAACACTCCACCTTCAATCACAATATCACTCTCCCACACAC 1650 ‘nirCJyCysAlaClulUeCyaSaiLauAanCLuAaallaThrValProAapTh

CAAAGnAATTTCTATCCCTCCAACACCATCCACgtgagttcctttttCttCttttttcctttcttttggageat rLyaValA«nPI>«TyrAlaTrpLy<ArgHetClu cCcutttBCgagcctgatcctggatgaaagggaEaaegategAEggaaaggEaaaatggagcagcagagatgagB 1800 etgcetgggegcagagECtcn<:geerntaatcecagBetgagatg|ccgAgatgggagaatt|cttgagccctgg aBtttcagaceaaccraBgcateatagtgaEateceeeateteteeaaacatttaaaaaaattaBCeaggtiaag 1950 tggttcatBttglcigteceatatatttttaaggccgaggcgggagtatcgcttgsgcecagB'at'tgaggc'E ^ca8^tB^aBC(Etg^ateacaccactgcactccaBectcagtgacagagtgaBgetctgtctcaaaaaagaaaaea.ia 2100 aaataaaaatAntgBggBctBtatxgeatarEttcnrtsttcnttcaetfactcaeteeereatteatteatte· cecattcaacaagtcceattgeataeettctgettBcteei’ettggtgeCtggEgctgctBaggtgcaggegi'Ea 2250

BOBtgtgacatcccleagetgacteeeagagtecactceetgtagCTCCCGCAGCACCrCCTACAACTCTCCCAC

ValeJyClnClnAtaValCluValtrpCln fCCCTCGCCCTCCTCTCCCAACCTCTCCTCCCCCCCCACCCCCTCTTCGTCAACTCTTCCCACCCCTCCGACCCC «00 C lyl.au AlnLauLeugcrCluAlaValLauAraClyCLnAlaLauLauValAenSarSarClnFreTrpCluPTO CTCCACCTCCATCrcCATAAACCCCTCACTCGCCTTCCCACCCTCACCACTCTCCTTCCCCCTCTCCCACCCCAC LeuCinLeutlUValAspLy(AlaValSarClyLcuArsScrLeuThrTbrLeuLeuArgAlaL.cuGlyAlaGJn RtgagtaecaEecgacacttetgetetcectttctgCaagaaggcgagaaEggtcttgetaagBagtacaggaac 2350 tgtccgtattcettcectttctgtggeaecgcagcgacctectgttttctecttggcagAAGCAACCCATCTCCC LyaClyAlalleSarP £TCCACATCCGCCCTCACCTCCTCCACTCCCAACAATCACTGCTGACACTTTCCCCAAACTCTTCCCACTCIACT 2700 roFroAapAlaAlaSerAlaAlBProLauArgThrllcThrAlaAapTTirPhaArgLyeLcuPheArgValTyrS f.CAATTrCCTCCCCCGAAACCTCAACCtCTACACACCĽCACCCCTCCACCACACCCCACAr.ATCACCACCTCTC7 erAsnPheLeuArcClyLyaLeul.yaLeuTyrThrClyCluAlaCyiArgTlirClyAapArg ' CCACCTCGCCATATCCACCACCTCCCTCACCAACATrCCTrGTCČCACACCCTCČCCCCCCACTČCT(:AACCCCC 2850 TCeACCCfíCTCTCACCTCACCCCCACCCTCTCCCATCCACACTCCACTCCCACCAATCACATCTCACCCCCCASA CCAACTGTCCAffACACCAACTCTGACATCTAACCATCTCACACCCCCAACTTCACCCCCCACACCACCAAGCATT 3000 CAGACACCACCrTTAAACTCACGGACACACCCATJKTCCCAAGACCCCTCAtň^CACrCCCCACCCTGCÄAAArT TCATCCCACCACACCCTTTGGACCCCATTt ACCTCTTTTCCCACCTACCATCAGCCACACGATGACCTCCACAAC 3150 TTACCTCCCAAGCTGTCACTTCTCCACCTCTCACCCCĽArCCCCACTCCCTTCCTCCCAACACCCCCCTŤGACAC (!CeCCTCCTCCCAACCATCAACACACCATCCCCCCTCCCCTCTCCCTCTCATCGOCTCCAAGTTŕTCrCTATTCT 5300 TCAACCTCATTCACAACMCTCAAACCACCaatatgaeccttggccttCctcttttctttiaaeeteeaaetccc ctggctctgtcceactcctggcagca 3400 v 0, IN NaOH-0,2M NaCl. Filter bol hybridizovaný k približne 5x10⁶ cpm tejto próby počas 12 hodín pri 68 °C, premytý v 2 x SSC pri 68 °C a vystavený 8 dní intenzívnemu skríningu. Jediná markerová mRNA s 1200 nt (označené šípkou) prebiehala v susednej dráhe (obr. 1).

Príklad 3 cDNA z pečene plodu

Bola pripravená próba zhodná s próbou, opísanou v príklade 2, a bola použitá na skríning cDNA knižnice peče7

SK 280623 Β6 ne plodu, pripravenej vo vektore lambda-Ch21A (Toole a spol., Náture, (25) (1984) pri použití štandardného skríningového (Benton Davis, Science, (54) (1978)) postupu. Tri nezávislé pozitívne klony (označené tu lambda-HEPOFLó (1350 bp), lambda-HEPOFL8 (700 bp) a lambda-HEPOFL3 (1400 bp) boli izolované po skríningu 1 x 10⁶ povlakov. Celý inzert lambda-HEPOFL13 a lambda-HEPOFL6 boli sekvenované po subklonovaní do M13 (tabuľky 7 a 5). Iba časti lambda-HEPOFL8 boli sekvenované a zvyšok bol považovaný za zhodný s ostatnými dvoma klonmi (tabuľka 6). 5-koniec a 3-koniec netranslátovanej sekvencie sú uvádzané malými písmenami. Kódujúca oblasť je zapísaná veľkými písmenami.

V tabuľkách 2 a 3 jc dcdukovaná aminokyselinová sekvencia uvedená pod nukleotidovou sekvenciou a je číslovaná tak, že číslo 1 platí pre prvú aminokyselinu maturovaného proteinu. Predpokladaný vedúci peptid (leader peptid) je označený zápisom celých skratiek pre zápis aminokyselín. Cysteínové zvyšky v zrelom proteíne sú ďalej označené SH a potenciálne N-napojené glykozylačné miesta hviezdičkou. Aminokyseliny, ktoré sú podtrhnuté, označujú tie zvyšky, identifikované N-terminálnym proteínovým sekvenovaním alebo sekvenovaním tryptických fragmentov EPO, ak je opísané v

Tabuľka 5

Val Aan Ser Ser Cln 7r« Trp Clu Pro Leu CU Leu Hla Val

ĽTC AAC TCT TCC CAC CCC TCC CAC CCC CTC CAC CTC CAT CTC

Cl, Leu Atg Ser Uu Thr flír Uu Lau

GCC CTT CCC ACC CTC ACC ACT CTC CTT

Pro Pro Aap AU AU Ser ala Ala Pro

CĽT CCA CAT CCC CCC TCA GCT GCT CCA

Tabuľka 7

CTS

TCT

CAT

Lya Ala

AAA CCC

Val CTC

I0O Ser

ACT

AIA

CCC

TUP TCC

SKB TCC

LťU

CTC ixír CTC

SĽH

TCC

Cti CCC

VAL CTC

CU CCC ta

Tyr TAC

CTC

TTC

Clu

CAC

Cl,

CCC

Clu

Leu

TTC

AAT

II e ATC

ACT >0

TCC

CAC

TTC CTC

AAC

Cln

CAC ľro

CCC

Trp

TCC

Clu CAC

CCC

Cla

CAC

Leu CTC nii

CAT

Val CTC *‘P

CAT

U·

AAA

10»

Ser

ACT

Ser Aen Pha

TCC ΛΛΤ TTC

Cly ten

CCC CTT

Ser Leu Thr ACC CTC ACC

Lea CTC

Leu CTT

110

Arg Ala lx« Cly Ali

Ctili CCT CTC CTA CCC CAC AAG

Cla Lyi

Ale

CCC íle ATC

CCT

CCA

Arz

Tlie TTC

Aan fh« Leu

AAT TTC CTC

CTC AAC CTC

T,r Thr 01y «h TAC ACA CCC * '

CAC

110

Arg cco

CCT

Pha

TTC leo Ar» cly CTC CCC CCA

Lya U« lya U« Tyr MC CTC AM CTC TAC

Thr Sir

ACA CCC

S U

Cy. Ar» TCC ACC

166 :ac ACA

TCA ecaggtg tgttcacetg

B* t⁹tur' •gc'eageg

U⁹ <i«agtgtci staaggatg

ICaCAgggCC ugagcag igagcagct tcaaaeteag ggaeigagcc gacgcccgag ^CU‘ aggaeaeget

ΒΒ·Μ'Β<

•M·'»·

Ltltgl

IW 't_U<

a«cct«a<t| ‘B*

Tabuľka 6 cccggtt :get|cge

Igegccgcí cgcgctglcc ctgagcc ttaccggggc eaccgcgcct gctctgctccg acaccgcgce ccetggaeag eegeeetctt gCBCi:C'<M tlgeaccg ggtcacccgg cgcgccccag gtcgctgagg gaccccggcc •O

ATC CCC <

CBUA'caggt

CAC sei

TCC

LEV

CTC

Lev CTC

Afg

CCC

Leu

CTC

GAC to Atg CCA

Val CTC

Lea

CTG

Clu CAC

Tyr

TAC

CTC

Lau

TTC

Clu

CAC

Clu CAC

11« ATC

Tkr

ACC

Thr ACC

Cly

CCC

Ale

CCT

SH Cya

TCC

Ser

ACC

Leu

TTC

CCA

CAC

ACC

Val cn

Tyr TAT

TCC

Lya AAC

ACC

CTC

Cl, CCC

Val

CTA

Cle CAA

Val CTC

Trp TOC

Cln

CAG

Cl, occ

CTC

Ala

CCC

Leu CTC

U. CTC

Ser TCC

Clu

CAA

Ala CCT

Val

CTC

Ľaj

CTC

Ui

CTC

120

ATC TCC

140

Ar» L, a

CCC ΑΑΛ cecAjagce Μ“«ΙΒΒΒ' caccgcgccc ictctfttccg aeaeegegne

IB'caceegt egegceccag gtcgetcngg gaeceeggcc ce«'g«teg

CB'B<UM ecgoget'ee «Μ·(|·ΙΜ ««tlgrgl

-H

KCT CCT “AL HIS ClO CTS no ATC CCC CTC CAC CAA TCT CCT

CCC TCC CTC TCC CTT CTC CTC TCC CTC CTC TCC CTC CCT CTC CCC CTC CCA CTC CTC

I

Ala

Tyr — — ... ŤÁetíč ŤŤč čač

Leu

Ala

T®^- t Sll 30 SB

Clu Al. Blu Ara U. Tfcr _ Thr - CT« _ Cya AU Clu Ma C,e Ser

CM CCC CM AAT Ate AČČ^ACC CCC TCT CCT CAA CAC TCC ACC

Val Pro Aap Thr t,o Val Aan Phe Tyr Ala Trp Irt Arg Het

CTC CCA CAC ACC AAA CTT AAT TTC TAT CCC TGG AM AM ATC

Tel LU Vil Trp Cln Cly Leu Ale Uu Leu Set Clu Ale Val

Lru Arg Cly Cln

CtC CCC CCC CAC

Ala Leu EČČ CTC tw Val A»n $er_Set__Cln Iro Tra CU Pre l.ru Cla Leu Hla Val Aap In Ata Val

TTC CTC AAC TCT TTC C*C CCC TCC CAC CTC CTC CAC CTC CAT CTC CAT MA CTC CTC fily lau Arg Ser Uu Thr Tlie Leu Lea Ara Ala U« Cly Ala ccc cn ccc acc crc acc act c ru crr ctc ccr ctc cca ccc

100

Se

AGT no

Fr, Pre Aap Ala Ala Ser Aln AU Pro Leu Arg Thr IU Thr Ale Aap Tl.r Phe Arg, <XT CCA GAT GCC CCC TCA CCT CCT CCA CTC CČA ACA ATC ACT CCT CAC ACT TTC CCC

140 ty· AAA

Leu Jhí—ÄX. CTC TTC CCA	.'r s“. CTC TAC TCC	Ara Mie Letí AAT UC CTC	Ar|| Cly Lyi CCC CCA AAC	Uu Lya Uu CTC AAC AT	Tyr π-r Cly TAC ACA CCC	ILU Clu Ala ~Ώδ ČEC
$11 ľíť ACC ACA	1U CJy Alp Arg GOl CAC MA	TCA ccaggtg	tgtccacetg	ggcatatccu	ccocclccct	ea'CM'att
gcttgtgcea	eaccclcccc	c|c<actcct	(taceccgcc	(•IU|CC«t	cagcccagcg	ccagcctgtc
	teeagcgcea	gcaetgaeat	ctetgujcc	agaggaaecg	tccagagagc	aactctgaga
	tcícntggcc	aaettguutt	cceaew'ac	gaagcactca	emiaececcc	ccaaacroe
	•rgetggga»	gaegeccgag	cteaecegge	•eeetgcaaa	«tctgacgcc	aggaeucgct
lUS’Bt'B*	rttaeetgtt	ttcgeacct»	ceatcaggga	c.U.'ga	tggagaeetr	aggcggraag
etgtf-Aette	tettggttte	lemeaiu	g<a<t«eetE		geeetettga	eaeetttt'·
CIMH0CC.1	tg.iagAcagg	•‘íía«t«ci	ececccgtec	C'C4Eígggt	ecaagctccg	tgtattcttc
		aauccaeraa

príklade 1. Čiastočné podtrhnutie označuje zvyšky v aminokyselinovej sekvencii určitých tryptických fragmentov, ktoré nemohli byť stanovené jednoznačne. cDNA klony lambda-HEPOFL8 a lambda-HEPOFL13 boli skrínované, uložené a sú dostupné z Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod prírastkovým číslom ATCC 40156, ATCC 40152 a ATCC 40153.

Príklad 4

Genomická štruktúra EPO génu

Relatívne veľkosti a polohy štyroch nezávislých genomických klonov (lambda-HEPOl, 2, 3 a 6) z knižnice HaeIll/Alul sú ilustrované prekrývajúcimi sa čiarami na obr. 3. Silná čiara označuje polohu EPO génu. Je uvedená stupnica (v kb) a polohy známych miest štiepenia reštrikčnou endonukleázou. Oblasť, obsahujúca EPO gén, bola kompletne sekvenovaná z obidvoch reťazcov pri použití riadenej série delécií v tejto oblasti. Schematické znázornenie piatich exónov, kódujúcich EPO mRNA, je uvedené na obr. 4. Presná 5-koncová väzba exónu I je v súčasnosti neznáma. Proteín kódujúci podiely exónov sú tmavšie. Kompletná nukleotidová sekvencia oblasti je uvedená v tabuľke 4. Známe hranice každého exónu sú označené pomocou silných vertikálnych čiar. Genomické klony lambda-HEPOl, lambda-HEPO2, lambda-HEPO3 a lambda-HEPO6 boli uložené a sú dostupné z Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod prírastkovým číslom ATCC 40154, ATCC 40155 a ARCC 40150 a ATCC 40151.

Príklad 5

Konštrukcia vektora p91023 (b)

Transformačným vektorom bol pAdD26SVpA(3), opísaný Kaufmanom a spol., Mol.Cell Biol., 2:1304 (1982). Štruktúra tohto vektora je uvedená na obr. 5A. Stručne, tento plazmid obsahuje gén cDNA myšej dihydrofolát rcduktázy (DFHR), ktorý je pod transkripčnou kontrolou adenovírus 2 (Ad2) hlavného neskorého promótora. 5-koniec strihové miesto je indikované v adenovírusovej DNA a 3-koniec strihové miesto, odvodené od imunoglobulínového génu, je prítomné medzi Ad2 hlavným neskorým promótorom a DFHR kódujúcou sekvenciou. SV40 časné polyadenylačné miesto je prítomné za DHFR kódujúcou sekvenciou. Prokaryoticky odvodená sekcia pAdD26SVpA(3) je z pSVOd (Mellon a spol., Celí, 27:279 (1981)) a neobsahuje pBR322 sekvencie, o ktorých je známe, že inhibujú replikáciu v bunkách cicavcov (Lusky a spol., Náture, 293 : :79(1981)).

pAdD26SVpA(3) bol premenený na plazmid pCVSVL2, ako je to ilustrované na obr. 5A. pAdD26SVpA(3) bol premenený na plazmid pAdD26SVpA(3) (d) deléciou jedného z dvoch Pstl miest v pAdD26SVpA(3). Toto bolo vykonané parciálnym štiepením pomocou Pstl pri použití deficitu enzýmu tak, aby bola získaná subpopulácia linearizovaných plazmidov, v ktorých bolo štiepené len jedno Pstl miesto, s nasledujúcim spracovaním Klenowom, ligáciou pre recirkuláciu a skríningom na deléciu Pstl miesta umiesteného 3-koniec k SV40 polyadenylačnej sekvencii.

Adenovírusový trojdielny líder a s vírusom spojené gény (VA gény) boli inzertované do pAdD26SVpA(3) (d), ako je to ilustrované na obr. 5A. Najskôr bol pAdD26SVpA(3) (d) štiepený pomocou PvuII na získanie lineárnej molekuly otvorenej v 3-koniec časti troch elementov, tvoriacich trojdielny líder. Potom bol pJAW 43 (Zain a spol., Celí, 16:851 (1979)) spracovaný s Klenowom, štiepený pomocou PvuII a 140bp fragment, obsahujúci druhú časť tretieho lídra, bol izolovaný elektroforézou na akrylamidovom géli (6 % v Tris borátovom tlmivom roztoku; Maniatis a spol., supra). 140bp fragment bol potom ligovaný do PvuII štiepeného pAdD26SVpA(3) (d). Ligačný produkt bol použitý na transformáciu E. coli na tetracyklínovú rezistenciu a kolónie boli skrínované pri použití Grunstein-Hognessovho postupu pri použití ³²P značenej próby, hybridizujúcej k 140 bp fragmentu. DNA bola pripravená z pozitívne hybridizujúcich kolónií na test, či PvuII rekonštruované miesto bolo 5-koniec alebo 3-koniec inzertované 140bp DNA, špecifickej k druhému a tretiemu adenovírusovému neskorému lídru. Správna orientácia PvuII miesta je na 5-koncovej strane 140bp inzertu. Tento plazmid je označený tTPL na obr. 5 A.

Ava II D fragment SV40, obsahujúci SV40 enhancerovú sekvenciu, bol získaný štiepením SV40 DNA pomocou Ava II, stupením koncov Klenowým fragmentom pol I, ligáciou Xho 1 linkerov k fragmentom, štiepením s Xho 1 pre otvorenie Xho 1 miesta a izoláciou štvrtého najväčšieho (D) fragmentu gélovou elektroforézou. Tento fragment bol potom ligovaný k Xho 1 štiepenému pTPL za vzniku plazmidu pCVSVL2-TPL. Orientácia SV40 D fragmentu v pCVSVL2-TPL bola taká, že SV40 neskorý promótor bol v rovnakej orientácii ako adenovírusový hlavný neskorý promótor.

Pre zavedenie s adenovírusom spojených (VA) génov do pCVSVL2-TPL bol najskôr konštruovaný plazmid pBR322, ktorý obsahuje adenovírus typ 2 Hind III B fragment. Adenovírus typ 2 DNA bol štiepený s Hind III a B fragment bol izolovaný gélovou elektroforézou. Tento fragment bol inzertovaný do pBR322, ktorý bol vopred štiepený pomocou Hind III. Po transformácii E. coli na ampicilínovú rezistenciu, boli rekombinanty skrínované na inzerciu Hind IIIB fragmentu a orientácia inzertu bola stanovená štiepením reštrikčným enzýmom. pBR322-Ad Hind III B obsahuje adenovírus typ 2 Hind III B fragment v orientácii, znázornenej na obr. 5B.

Ako je ilustrované na obr. 5B, sú VA gény výhodne získané z plazmidu pBR322-Ad Hind IIIB štiepením s Hpa I, prídavkom EcoRI linkerov a štiepením pomocou EcoRI a nasledujúcim odstránením 1,4 kb fragmentu. Fragment, majúci EcoRI lepivé konce, sa potom liguje do EcoRI miesta PTL, vopred štiepeného s EcoRI. Po transformácii E. coli HB101 a selekcii na tetracyklínovú rezistenciu, boli kolónie skrínované filtrovou hybridizáciou k DNA, špecifickej pre VA gény. DNA bola pripravená z pozitívne hybridizujúcich klonov a charakterizovaná štiepením reštrikčnou endonukleázou. Výsledný plazmid je označený p91023.

Ako je to ilustrované na obr. 5C, boli dve EcoRI miesta v p91023 odstránené úplným rozštiepením p91023 pomocou EcoRI za vzniku dvoch DNA fragmentov, jeden asi 7kb a druhý asi 1, 3kb. Posledne uvádzaný fragment obsahuje VA gény. Konce obidvoch fragmentov potom boli vzájomne k sebe ligované. Plazmid p91023(A), obsahujúci VA gény a podobne p91023, ale s deléciou dvoch EcoRI miest, boli identifikované pomocou Grunstein-Hognessovho skríningu s VA génovým fragmentom a bežnou analýzou reštrikčných miest.

Jediné Pstl miesto v p91023(A) bolo odstránené a nahradené EcoRI miestom. p91023(a) bol úplne rozrezaný pomocou Pstl a spracovaný s Klenowým fragmentom Poli na vytvorenie vyrovnaných koncov. EcoRI linkery boli ligované k zatupenému Pstl miestu p91023(A). Lineárny p91023(A) s EcoRI linkermi, pripojenými k zatupenému Pst miestu, boli oddelené od neligovaných linkerov a plne rozštiepené pomocou EcoRI a religované. Bol získaný plazmid p91023(B), ako je znázornený na obr. 5C, a bol identifikovaný ako majúci štruktúru, podobnú p91023(A), ale s EcoRI miestom skoršieho Pstl miesta. Plazmid p91023(B) bol uložený a je dostupný v Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod prírastkovým číslom ATCC 39754.

Príklad 6 cDNA klony (lambda-EPOFL6 a lambda-EPOFL13, príklad 3) boli inzertované do plazmidu p91023(B) za vzniku PPTFL6 a PPTFL13. 8 pg každej z čistených DNA bolo potom použitých na transfektovanie 5 x 10⁶ COS buniek pri použití DEAEdextránovej metódy (infra). Po 12 hodinách boli bunky premyté a spracovávané s chloroquinom (0,1 mm) počas 2 hodín, opäť premyté a vystavené 10 ml média, obsahujúceho 10 % fetálneho teľacieho séra počas 24 hodín. Médium bolo zamenené za 4 ml séra bez média a zobrané o 48 hodín neskoršie.

Produkcia imunologický aktívneho EPO bola kvantifikovaná rádioimuno skúškou, ako to opísali Sherwood a Goldwasser (55). Protilátka bola poskytnutá Dr. ludith Sherwood. Jódovaný značkovač bol pripravený z homogénneho EPO, opísaného v príklade L Citlivosť skúšky je približne 1 ng/ml. Výsledky sú uvedené ďalej v tabuľke 8.

Tabuľka 8

Vektor hladina EPO, uvoľneného do média (ng/ml) pPTFLI3 330 pPIFLó 31

SK 280623 Β6

COS buniek, transfcktovaných EPO aktivita

100 ng/ml

20,5 j./ml

3,1 l,8j./ml

j./ml

j./ml

PTFL13 bol uložený a je dostupný v Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod prírastkovým číslom ATCC3990.

Príklad 7

EPO cDNA (lambda-HEPOFL13) bola inzertovaná do p91023(B) vektora a bola transfektovaná do COS-1 buniek a zobraná, ako je to opísané hore (príklad 6) s tým rozdielom, že bolo vypustené spracovanie chloroguinom.

In vitro bol stanovený biologicky aktívny EPO pomocou skúšky tvorby kolónií s bunkami pečene myšieho plodu ako zdroja CFU-E, alebo skúšky príjmu 3H-tymidínu pri použití buniek sleziny myší, ktorým bola vopred podaná injekcia fenylhydrazínu. Citlivosti týchto skúšok sú približne 25 milijednotiek/ml. In vivo bol biologicky aktívny EPO meraný použitím metód buď s hypoxickou myšou, alebo vyhladovelým potkanom. Citlivosť týchto skúšok je približne 100 milijednotiek/ml. Nebola detegovaná žiadna aktivita pri obidvoch skúškach ani v kontrolnom pokuse. Výsledky EPO, exprimovaného klonom EPOFL13, sú uvedené ďalej v tabuľke 9, kde uvádzané aktivity sú vyjadrené v jednotkách/ml pri použití komerčného kvantifikovaného EPO (Toyobo, Inc.) ako štandardu.

Tabuľka 9 EPO exprimovaný z cDNA typ I Skúška RIA CFU-E ³II-Thy hypoxická myš vyhladovený potkan

Príklad 8 Analýza EPO z COS buniek na polyakrylamidovom géli

180 ng EPO, uvoľneného do média COS buniek, transfektovaných EPO (lambda-HEPOFL13) cDNA vo vektore 91023(B) (pozri hore), bolo elektroforézovaných na 10 % SDS Laemli polyakrylamidovom géli a elektrotransferovaných na nitrocelulózový papier (Towbin a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350 (1979)). Filter bol probovaný s anti-EPO protilátkou, ako je to opísané v tabuľke 8, premytý a opäť prezretý pomocou ^l25I-staph A proteínom. Filter bol spracovávaný autorádiografiou počas dvoch dní. Natívne homogénne EPO, opísané v príklade 1, buď pred (dráha B), alebo po jodácii (dráha C) boli podrobené elektroforéze (pozri obr. 8). Použité markéry zahŕňajú ³⁵S značený metionín, sérový albumín (68 000 d) a ovalbumín (45 000 d).

Príklad 9 Konštrukcia RK1-4

Bam HI-PvuII fragment z plazmidu PSV2DHFR (Subramani a spol., Mol. Celí. Biol. 1:854-864 (1981)), obsahujúci oblasť časného promótora SV40, pripojeného ku génu myšej dihydrofolát reduktázy (DHFR), SV40 enhancer, malý intrón t antigénu a SV40 polyadenylačnú sekvenciu, bol izolovaný (fragment A). Zvyšné fragmenty boli získané z vektora p91023(B) (pozri hore) nasledovne: p91023(A) bol štiepený pomocou Pst I v jedinom Pst I mieste, blízkom adenovírusovému promótoru pre linearizáciu plazmidu a buď ligovaný k syntetickým Pst I až EcoRl konvertorom a recirkulovaný (vytvorenie miest Pst 1 - EcoRl - Pst I na pôvodnom Pst I mieste; 91023(B') alebo spracovaný s veľkým fragmentom DNA polymerázy 1 na rozrušenie Pst I miest a ligovaný k syntetickému EcoRl linkeru a recirkularizovaný (vytvorením EcoRl miesta na pôvodnom mieste Pst I; 91023(B). Každý z dvoch výsledných fragmentov 91023(B) a 91023(B') bol štiepený pomocou Xba a EcoRl za vzniku dvoch fragmentov (F a G). Spojením F fragmentu z p91023(B) a fragmentu G z p91023(B') a fragmentu G z p91023(B) a fragmentu F z p91023(B') boli vytvorené dva nové plazmidy, ktoré obsahujú buď EcoRl - Pst I miesto alebo Pst I - EcoRl miesto na pôvodnom Pst I mieste. Plazmid, obsahujúci Pst I - EcoRl miesto, kde Pst I miesto je najbližšie adenovírusovému hlavnému neskorému promótoru, bol nazvaný p91023(C).

Vektor p91023(C) bol kompletne štiepený pomocou Xhol a výsledná linearizovaná DNA s lepivými koncami bola zatupená reakciou zaplnenia koncov s veľkým fragmentom E. coli z DNA polymerázy I. K tejto DNA bol ligovaný 340 bp Hind III EcoRl fragment, obsahujúci SV40 enhancer, pripravený nasledovne:

Hind III - Pvu II fragment zo SV40, ktorý obsahuje SV40 počiatok replikácie a enhancer, bol inzertovaný do plazmidu c lac (Little a spol., Mol.Biol.Med. 1:473-488 (1983)). c lac vektor bol pripravený štiepením c lac DNA pomocou BamHI, zaplnením na lepivých koncoch veľkým fragmentom DNA polymerázy I a štiepením DNA pomocou Hind III. Výsledný plazmid (c SVHPIaC) regeneroval BamHI miesto pri ligácii k Pvu II tupému koncu. Fragment EcoRI-Hind III bol pripravený z c SVHPlac a ligovaný k EcoRI-Hind III fragmentu pSVOd (Mellon a spol., supra), ktorý obsahuje plazmidový počiatok replikácie a bol selektovaný výsledný plazmid PSVHPOd. Potom bol pripravený 340 bp EcoRI-Hind III fragment z PSVHPOd, obsahujúci SV40 počiatok/cnhancer, zatupený na obidvoch koncoch pomocou veľkého fragmentu DNA polymerázy 1 a ligovaný k Xhol štiepenému, zatupenému p91023(c) vektoru, opísanému hore. Výsledný plazmid (p91023(C)/Xho/ zatupený plus EcoRI/Hind III/zatupený SV40 počiatok plus enhancer), v ktorom bola orientácia Hind III - EcoRl fragmentu taká, že BamHI miesto v tomto fragmente bolo čo najbližšej VA génu, bol označený pES105. Plazmid Pesl05 bol štiepený pomocou Bam Hl a PvuII a tiež PvuII samotným a bol izolovaný BamHl-PvuII fragment, obsahujúci adenovírusový hlavný neskorý promótor (fragment B) a PvuII fragment, obsahujúci plazmid trvania rezistencie génu (tetracyklínová rezistencia) a iné sekvencie (fragment C). Fragmenty A, B a C boli ligované a výsledný plazmid je uvedený na obr. 7 a bol izolovaný a nazvaný RK1-4. Plazmid RK1-4 bol uložený v Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland, kde je dostupný pod prírastkovým číslom ATCC 399940.

Príklad 10

Expresia EPO v CHO bunkách - metóda 1

DNA (20 pg) z plazmidu pPTFLI3, opísaného (príklad 6), bola štiepená reštrikčnou endonukleázou Cla I k linearizácii plazmidu a bola ligovaná k Cla I-štiepenej DNA z plazmidu pAdD26SVP(A) 1 (2 pg), ktorý obsahuje intaktný dihydrofolát reduktázový (DHFR) gén, riadený adenovírusovým hlavným neskorým promótorom (Kaufman a Sharp, Mol. and Cell.Biol. 2:1304-1319 (1982)). Takto ligovaná DNA bola použitá na transfektovanie DHFR-negatívnych CHO buniek (DUKS-B1I, Chasin L.A. a Urlaub

G. (1980) PNAS 77 4216-4220) a ponechaná rásť dva dni, bunky, ktoré inkorporovali aspoň jeden DHFR gén, boli selektované v alfa médiu, postrádajúcom nukleotidy a doplnenom 10 % dialyzovaného fetálneho hovädzieho séra. Po dvoch týždňoch rastu v selektívnom médiu boli kolónie odstránené z originálnych platní, spojené do skupín 10-100 kolónií na skupinu, opäť umiestnené na platňu a ponechané

SK 280623 Β6 rásť do zliatia v médiu, postrádajúcom nukleotidy. Supernatanty média zo skupín, vyrastených pred metotrexátovou selekciou, boli skúšané na EPO pomocou RIA. Skupiny, ktoré majú pozitívnu EPO produkciu, rástli v prítomnosti metotrexátu (0,02 μΜ) a potom boli subklonované a opäť skúšané. EPO Cla 4 4.02-7, jediný subklonovaný z EPO Cla 4 4.02 skupiny, uvoľňuje 460 ng/ml EPO do média, obsahujúceho 0,02 μΜ MTX (tabuľka 10). EPO Cla 4 4.02-7 je bunková línia voľby pre produkciu EPO a bola uložená v Američan Type Culture Collection pod prírastkovým číslom ATCC CRL8695. V súčasnosti je tento kloň podrobený postupnej selekcii v zvyšujúcich sa koncentráciách MTX a bude pravdepodobne poskytovať bunky, ktoré produkujú aj vyššie hladiny EPO. Pre skupiny, ktoré na základe RIA boli negatívne, boli kolónie, rezistentné k metotrexátu, získané z duplikátnych kultúr, ktoré rástli v prítomnosti metotrexátu (0,02 pM), opäť v skupinách skúšané na EPO pomocou RIA. Tieto kultúry, ktoré neboli pozitívne, boli subklonované a podrobené rastu v ďalej sa zvyšujúcich koncentráciách metotrexátu.

Postupná metotrexátová selekcia (MTX) bola dosiahnutá opakovaním cyklov kultivácie buniek v prítomnosti zvyšujúcich sa koncentrácií metotrexátu a selekciou prežívajúcich. V každom cykle bol meraný EPO v kultúrach supernatanta pomocou RIA a in vitro biologickej aktivity. Hladiny metotrexátu, použité v každej postupnej amplifikácii, boli 0,02 pM, 0,1 pM a 0,5 pM. Ako je uvedené v tabuľke 10, po jednom cykle selekcie v 0,02 pM MTX boli do kultivačného média uvoľnené významne vysoké hladiny EPO.

Tabuľka 10

	Hladina EPO, uvolneného do média
Vzorka skupina	Skúška	získané z média 0,02 μΜ metotrexát alfa v médiu alfa
4 4	RIA	17 ng/ml 50 ng/ml
jediná kolónia 4 4 kloň
(.02-7)	RIA	- 460 ng/ml

Príklad 11

Expresia EPO v CHO bunkách - metóda II

DNA z klonu lambda HEPOFL13 bola štiepená pomocou EcoRI a malý fragment, obsahujúci EPO gén, bol subklonovaný do EcoRI miesta plazmidu RK1-4 (pozri príklad 10). Táto DNA (RKFL13) potom bola použitá na transfekciu DHFR-negatívnych CHO buniek priamo (bez štiepenia) a selekcia a amplifikácia bola vykonaná spôsobom opísaným v príklade 10.

RKFL13 DNA bola tiež inzertovaná do CHO buniek protoplastovou fúziou a mikroinjekciou. Plazmid RKFL13 bol uložený a je dostupný v Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod prírastkovým číslom ATCC 39989.

Tabuľka 11

	Hladina EPO,	uvoľneného do aédia
Vzorka	SkúSka	získan6 s média 0,02 pH matoYrexét.
		alfa	v médiu alfa
skupina kolónii A	RIA	3 ng/ml	4 2 ng/ml (skupina) ISO ng/nl (kloň)
	3H-Thy	-	1,5 j./ml
jediná	RIA	-	so ng/ml
kolónia	3H-Thy	-	5,9 j./ml
kloň (.O2C-2)
alkroinjektovaná
skupina	RIA	60 ng/ml	160 ng/ml
(DEFO-1)	3H-Thy	1,8 j . /!	-

Preferovaný kloň jedinej kolónie bol uložený a je dostupný z Američan Type Culture Collection, Rockville,

Maryland pod prírastkovým číslom ATCC CRL8695.

Príklad 12

Expresia EPO genomického klonu v COS-1 bunkách

Na expresiu EPO genomického klonu bol použitý vektor pSVOd (Mellon a spol., supra). DNA z pSVOd bola úplne štiepená pomocou Hind III a zatupená s veľkým fragmentom DNA polymerázy I. EPO genomický kloň lambda-HEP3 bol úplne štiepený s EcoRI a Hind III a 4,0 kb fragment, obsahujúci EPO gén, bol izolovaný a zatupený ako je to opísané. Nukleotidová sekvencia tohto fragmentu z Hind III miesta do oblasti tesne za polyadenylačným signálom je uvedená na obr. 4 a v tabuľke 4. EPO génový fragment bol inzertovaný do pSVOd plazmidového fragmentu a správne konštruované rekombinanty v obidvoch orientáciách boli izolované a overené. Plazmid CZ2-1 má EPO gén v orientácii „a“ (t. j. 5' koniec EPO najbližšie k SV40 počiatku) a plazmid CZ1-3 je v opačnej orientácii (orientácia „b“).

Plazmidy CZ1-3 a CZ2-1 boli transfektované do COS-1 buniek, ak je to opísané v príklade 7, a médiá boli zobrané a skúšané na imunologický reaktívny EPO. Približne 31 ng/ml EPO bolo defektných v supematante kultúry z CZ2-1 a 16-31 ng/ml CZ1-3.

Genomické klony HEPO1, HEPO2 a HEPO5 môžu byť inzertované do COS buniek pre expresii podobným spôsobom.

Príklad 13

Expresia v C127 a v 3T3 bunkách. Konštrukcia pBPVEPO.

Plazmid, obsahujúci EPO cDNA sekvenciu pod transkripčnou kontrolou myšieho metalotioneinového promótora a napojený ku kompletnej DNA hovädzieho papilloma vírusu, bol pripravený nasledovne:

pEPO49F

Plazmid SP6/5 bol získaný od Promcga Biotec. Tento plazmid bol štiepený kompletne pomocou EcoRI a 1340 bp EcoRI fragment z lambda-HEPOFL13 bol inzertovaný DNA ligázou. Výsledný plazmid, v ktorom 5' koniec EPO génu bol najbližšie k SP6 promótoru (stanovené pomocou štiepenia BglI a Hind III), bol nazvaný pEPO49F. V tejto orientácii je BamHI miesto v PSP6/5 polylinkere priamo pripojené k 5' koncu EPO génu.

pMMTneo BPV

Plazmid pdBPV-MMTneo (342-12) (Law a spol., Mol. and Celí Biol., 3:2110-2115 (1983)), ilustrovaný na obr. 8, bol štiepený kompletne pomocou BamHI za vzniku dvoch fragmentov - veľkého fragmentu asi 8 kb v dĺžke, obsahujúceho BPV genóm, a menšieho fragmentu asi 6,5 kb dĺžky, obsahujúceho pML2 počiatok replikácie a gén ampicilínovej rezistencie, metalotioneinový promótor, gén rezistencie neomycínu a SV40 polyadenylačný signál. Štiepená DNA bola recirkularizovaná DNA ligázou a plazmidy, ktoré obsahujú len 6,8 kb fragment, boli identifikované pomocou EcoRI a BamHI reštrikčným endonukleázovým štiepením. Jeden z týchto plazmidov bol nazvaný pMMTneo BPV.

pEPO15a pMMT neo BPV bol kompletne štiepený pomocou BglII. pEPO49f bol štiepený kompletne pomocou BamHI a BglII a približne 700 bp fragment bol pripravený izoláciou na géli. BglII štiepený pMMTneo BPV a 700 bp Bam11

SK 280623 Β6

HI/BgIII Epo fragment boli ligované a výsledné plazmidy, obsahujúce EPO cDNA, boli identifikované kolóniovou hybridizáciou s oligonukleotidovou d(GGTCATCTGTCCCCTGTCC) próbou, ktorá je špecifická pre EPO gén. Z plazmidov, ktoré boli pozitívne pri hybridizačnej analýze, bol jeden (pEPO15a), ktorý mal EPO cDNA v orientácii takej, že 5' koniec DNA bol najbližšie metalotioneinovému promótora, identifikovaný štiepením pomocou EcoRI a Kpnf.

pBPV-EPO

Plazmid pEPO15A bol štiepený kompletne BamHI pre linearizáciu plazmidu. Plazmid pdBPV-MMTneo(342-12) bol tiež štiepený kompletne pomocou BamHI za vzniku dvoch fragmentov 6, 5 a 8 kb. 8kb fragment, ktorý obsahuje celý genóm hovädzieho Papilloma vírusu, bol izolovaný na géli. pEPO15a/ BamHI a 8kb BamHI fragment boli spolu ligované a plazmid (pBPV-EPO), ktorý obsahuje BPV fragment, bol identifikovaný kolóniovou hybridizáciou pri použití oligonukleotidovej próby d(PCCACACCCGGTACACA-OH), ktorá je špecifická pre BPV genóm. Štiepenie pBPV-EPO DNA pomocou Hind III indikuje, že smer transkripcie BPV genómu bol rovnaký ako smer transkripcie metalotioneinového promótora (ako v pdBPV-MMMTnec(342-12) pozri obr. 8). Plazmid pdBPV-MMTneo(342-12) je dostupný z Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod prírastkovým číslom č. ATCC 37224.

Expresia

Nasledujúce metódy boli použité na expresiu EPO.

Metóda I

DNA pBPV-EPO bola pripravená a približne 25 pg bolo použitých na transfektovanie asi 1 x 10⁶ C127 (Lowy a spol., J. of Virol. 26:291-98 (1978)) CHO buniek pri použití štandardných techník zrážania fosforečnanom vápenatým (Grahm a spol., Virology, 52:456-67 (1973)). Päť hodín po transfekcii boli transfekčné médiá odstránené, bunky boli podrobené glycerínovému šoku, premyté a bolo pridané čerstvé α-médium obsahujúce 10 % fetálneho hovädzieho séra. Po 48 hodinách boli bunky trypsínizované a štiepené v pomere 1 : 10 v DME médiu, obsahujúcom 500 pg/ml 0418 (Southem a spol., Mol. Appl.Genet. 1 : 327-41 (1982)), a bunky boli inkubované dva až tri týždne. G418 rezistentné kolónie potom boli individuálne izolované do mikrotitračných jamiek a ponechané rásť do štádia v prítomnosti G418. Bunky potom boli premyté, bolo pridané čerstvé médium, obsahujúce 10 % fetálneho hovädzieho séra a médiá boli zobrané o 48 hodín neskoršie. Kondicionované médium bolo testované a zistené ako pozitívne pri rádioimunoeseji a in vitro biologickej eseji.

Metóda II

C127 alebo 3T3 bunky boli transfektované s 25 pg pBPV-EPO a 2 pg pSV2neo (Southem a spol., supra), ako je to opísané v metóde I. Je tu približne 10-násobný molárny prebytok pBPV-EPO. Po transfekcii, postup je rovnaký ako v metóde 1.

Metóda III

C127 bunky boli transfektované 30 pg pBPV-EPO, ako je to opísané v metóde I. Po transfekcii a štiepení (1 : 10) bolo každé tri dni vymieňané čerstvé médium. Po asi 2 týždňoch boli zrejmé ložiská transformovaných buniek. Jednotlivé ložiská boli odoberané jednotlivo do 1 cm jamiek mikrotitračnej platne, ponechané rásť do subsúvislej mono vrstvy a skúšané na EPO aktivitu alebo antigenicitu v kondicionovanom médiu.

Príklad 14

Expresia v hmyzích bunkách. Konštrukcia pIVEV EPOFL13.

Plazmidový vektor pIVEV bol uložený a je dostupný v Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod prírastkovým číslom č. ATCC 39991. Vektor bol modifikovaný nasledovne:

pIVEVNI pIVEV bol štiepený pomocou EcoRI k linearizácii plazmidu, zatupený použitím veľkého fragmentu DNA polymerázy I a jediný Nôti linker GGCGGCCGCC

CCGCCGGCGG bol inzertovaný ligáciou k otupeným koncom. Výsledný plazmid je nazvaný pIVEVNI.

pIVEVSI pIVEV bol štiepený pomocou Smal k linearizácii jediného Sfil linkera

GGGCCCCAGGGGCCC

CCCGGGGTCCCCGGG, bol inzertovaný ligáciou k otupeným koncom. Výsledný plazmid bol nazvaný pIVEVSI.

pIVEVSIBgKp

Plazmid pIVEVSI bol štiepený pomocou KpnI k linearizácii plazmidu a približne 0 až 100 bp bolo získaných z každého konca štiepením dvojreťazcovou exonukleázou Bal 31. Akékoľvek konce, ktoré neboli perfektne tupé, boli stupené pomocou veľkého fragmentu DNA polymerázy I a polylinker _Xho_ I _XbaI pEgjjl^ {Eccte! íciai Kpni AGATCTCG^GAATTCTAG^lA^lrCGA'?GGTAcJ TCTAGAGCTCTTAAGATCTAGCTACCATGG bol inzertovaný ligáciou k tupým koncom. Polylinker bol inzertovaný v obidvoch orientáciách. Plazmid, v ktorom je polylinker orientovaný tak, že BglII miesto v polylinkeri je najbližšie k promótora polyhedron génu, je nazvaný plVEVSIBgKp. Plazmid, v ktorom KpnI miesto v polylinkeri je najbližšie k promótora polyhedron génu, je nazvaný plVEVSIKpBg. Počet párov báz, ktoré boli deletované medzi pôvodným KpnI miestom v pIVEVSI a polyhedron promótorom, nebol stanovený. pIEIVSIBgKp bol uložený a je dostupný v Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod prírastkovým číslom č. ATCC 399988.

IEVSIBgKpNl pIVEVNI bol štiepený kompletne pomocou KpnI a PstI za vzniku dvoch fragmentov. Väčší fragment, ktorý obsahuje plazmidový počiatok replikácie a 3' koniec polyhedron génu, bol pripravený izoláciou na géli (fragment A). pIEVSIBgKp bol štiepený kompletne pomocou pstl a Kpn za vzniku dvoch fragmentov a menší fragment, ktorý obsahuje polyhedron génový promótor a polylinker, bol pripravený izoláciami na géli (fragment B). Fragment A a B potom boli spojené DNA ligázou za vzniku nového plazmidu plVESIBgKpNI, ktorý obsahuje čiastočne deletovaný polyhedron gén, do ktorého bol inzertovaný polylinker a obsahuje tiež Nôti miesto (nahradenie zničeného EcoRI miesta) a Sfil miesto, ktoré prilieha k polyhedron génovej oblasti.

SK 280623 Β6 pIVEPO pIVEVSI BGKpNI bol štiepený kompletne pomocou EcoRI na linearizáciu plazmidu a 1340 bp EcoRI fragment z lambdaHEPOFLI3 bol inzertovaný. Plazmidy, obsahujúce EPO gén v orientácii takej, že 5' koniec EPO génu je najbližší polyhedron promótora a 3' koniec polyhedron génu, boli identifikované štiepením s BglII. Jeden z týchto plazmidov v opísanej orientácii bol označený pIVEPO.

Expresia EPO v hmyzích bunkách

Veľké množstvá pIVEPO plazmidu boli vyrobené transformáciou E. coli kmeňa JMlOl-tgl. Plazmidová DNA bola izolovaná technikou čistenia lyzátu (Maniatis a Fritsch, Cold Spring Harbor Manual) a ďalej čistená pomocou CsCl odstredenia. L-l DNA polyhedrosis vírusu štandardného typu Autographa califomica (AcNPV) bola pripravená fenolovou extrakciou častíc vírusu a následným CsCl čistením vírusovej DNA.

Tieto dve DNA potom boli kotransfektované do Spodoptera frugiperda buniek IPLB-SF-21 (Vaughn a spol., In Vitro, diel B, str. 213-17 (1977) pri použití transfekčného postupu s fosforečnanom vápenatým (Potter a Millere, 1977). Pre každú platňu kontransfektovaných buniek bol použitý 1 pg DNA štandardného typu AcNPV a 10 pg pIVEPO. Platne boli inkubované pri 27 °C 5 dní. Supematant potom bol oddelený a EPO expresia v supematante bola potvrdená rádioimunoesejou a in vitro biologickou esejou.

Príklad 15 Čistenie EPO

COS-bunkové kondicionované médiá (121) s EPO koncentráciami až 200 pm/liter bola koncentrovaná na 600 ml pri použití ultrafiltračných membrán so schopnosťou delenia 10 000 mol. hmotnosti, ako je Millipore Pellicans 0,46 m² na membránu. Eseje boli vykonané pomocou RIA, ako je to opísané v príklade 6. Retentát z ultrafiltrácie bol diafiltrovaný proti 4 ml 10 mM 10 mM fosforečnanu sodného, upraveného na pH 7,0. Koncentrované a diafiltrované kondičné médiá obsahujú 2,5 mg EPO v 380 mg celkového proteínu. EPO roztok bol ďalej koncentrovaný na 186 ml a vyzrážané proteíny boli odstránené odstredením pri 110 000 x g počas 30 minút.

Supematant, ktorý obsahuje EPO (2,0 mg), bol upravený na pH 5,5 50 % kyselinou octovou, miešaný pri 4 °C 30 minút a zrazenina bola odstránená odstreďovaním pri 13 000 x g počas 30 minút.

Chromatografia na karbonylmetylsepharóze

Supematant z odstreďovania (20 ml), obsahujúci 200 pg EPO (24 mg celkového proteínu), bol nanesený na kolónu, naplnenú CM-Sepharózou (20 ml), ekvilibrovanou v 10 mM octanu sodnom pH 5,5, premytou 40 ml rovnakého tlmivého roztoku. EPO, ktorý sa naviazal k CM-Sepharóze, bol eluovaný 100 ml gradientu NaU (0-1) v 10 mM fosforečnanu sodnom pH 5,5. Frakcie, obsahujúce EPO (celkom 50 pg v 2 mg celkových proteínov), boli spojené a koncentrované na 2 ml pri použití Amicon YM10 ultrafiltračnej membrány.

HPLC s reverznou fázou

Koncentrované frakcie z CM-Sepharózy, obsahujúce EPO, boli ďalej čistené pomocou HPLC s reverznou fázou pri použití Vydac-4 kolóny. EPO bol nanesený na kolónu, ekvilibrovanú v 10 % rozpúšťadle B (rozpúšťadlo A bolo 0,1 % CF₃CO₂H vo vode; rozpúšťadlo B bolo 0,1 % CF₃CO₂H v CF₃CO₂H v CF₃CN), pri prietokovej rýchlosti ml/min. Kolóna bola premývaná 10 % B 10 minút a EPO bol eluovaný s lineárnym gradientom B(10 - 70 % 60 minút). Frakcie, obsahujúce EPO, boli spojené (asi 40 pg EPO v 120 pg celkových proteínov) a lyofilizované. Lyofilizovaný EPO bol rekonštruovaný v 0,1 M Tris HC1 pri pH 7,5, obsahujúcom 0,15M NaCl a rcchromatografovaný pomocou HPLC s reverznou fázou. Frakcie, obsahujúce EPO, boli spojené a analyzované SDS-polyakrylamidovou (10 %) gélovou elektroforézou (Lameli U.K., Náture). Spojené frakcie EPO obsahujú 15,5 pg EPO v 25 pg celkového proteínu.

Vynález bol podrobne opísaný svojimi výhodnými rozpracovaniami. Odborník v odbore môže ľahko uskutočniť modifikácie a vylepšenia na základe opisu a predložených obrázkov bez toho, aby bola porušená myšlienka a rozsah vynálezu, ktorý je daný pripojenými nárokmi.

1. Jacobson L. O., Goldwasser E. Fried W., a Pizak L. F., Trans. Assoc. Am. Phvsicians TO:305-317(1957).

2. Krantz S. B. a Jacobson L. O. Chicago: Universitv of Chicago Press 1970, pp. 29-31.

3. Hammond D. a Winnick S. Ann. N. Y. Acad. Sci. 230:219-227(1974).

4. Sherwood J. B. a. Goldwasser E., Endocrinology 103:866-870 (1978).

5. Fried, W. Blood 40:671-677 ( 1972).

6. Fisher J. J. Lab. and Clin. Med. 93:695-699 (1979).

7. Naughton B. A., Kaplan. S. M., Roy M., Burdowski A. J., Gordon A. S., a Piliera S. J. Scier 196:301-302.

8. Lucarelli G. P., Howard D., a Stohlman F., Jr. J. Clin. Invest 43:2195-2203 (1964).

9. Zanjani E. D., Poster J., Burlington H., Mann L. I., a Wasserman L. R. J. Lab. Clin. Med. 89:640-644 (1977).

10. Krantz S. B., Gallicn-Lartiguc O., a Goldwasser E. J. Biol Chem, 238:4085-4090 (1963).

11. Dunn C. D., Jarvis J. H. a Gresnman J. M. Exp. Hematol. 3:65-78 (1975).

12. Kryštál G. Exp. Hematol. 11:649-660 (1983).

13. Iscove N. N. a Guilbert L. J., M. J. Murphy, Jr. (Ed.) New York:Springer-Verlag, pp. 3-7 (1978).

14. Goldwasser E., ICN UCLA Symposium. Control of Cellular Division and Development. A. R. Liss, Inc., pp. 487-494 (1981)

15. Cline M. J. a Golde D. W. Náture 277:177-181 (1979)

16. Metcalf D., Johnson G. R., a Burgess A. W. Blood 55:138- ( 1980).

17. Krane N. Henry Ford Hosp. Med. J. 31:177-181 (1983).

18. Eschbach J., Madenovic J., Garcia J., Wahl P., a Adamson J. J. Clin. Invest. 74:434-441 (1984).

19. Anagnostou A., Barone J., Vedo A., a Fried. W. Br. J. Hematol 37:85-91 (1977).

20. Miyake T., Kung C., a Goldwasser E. J. Biol. Chem. 252:5558-5564(1977).

21. Yanagawa S., Hirade K., Ohnota H., Sasaki R., Chiba

H., Veda M., a Goto, M. J. Biol, Chem:259:2707-2710 (1984).

22. Lawn R. M., Fritsch E. F., Parker R. C., Blake G., a Maniatis. T. Celí 15:1157-( 1978).

23. Sanger F., Nicklen S., aCoulson A. R. Proc. Nat'I Acad. Sci., U.S.A, 74:5463-(1977).

24. Zanjanc E. D., Ascensao J. L., McGlave P. B., Banisadre M., ar Ash. R. C. J, Clin. Invest. 67:1183- (1981).

25. Toole J. J., Knopf J. L., Wozney J. M., Sultzman L. A. Buecker L L., Pittman D. D., Kaufman R. J Brown E., Shoemaker C., Orr E. C., Amphlett G. W., Foster W. B., Coe M, L. Knutson G. J., Fass D N., a: Hewick R. M. Náture in Press.

26. Goldwasser E. Blood Suppl. L 58. xlii (abstr) (1981).

SK 280623 Β6

27. Sue J. M. a Sytkowdki A. J. Proc. Nat'I Acad. Sci U.S.A. 80:3651-3655(1983).

29. Bersch N. a Golda D. W., In Vitro Aspects of Ervthropoiesis. M. J. Murphy (Ed.) New York:Spinger-Verlag (1978).

30. CotesP. M. a BanghamD. R. Náture 191:1065-(1961).

31. Gotdwasser E. a Gross M. Methods in Enzvmol 37:109-121 (1975).

32. Nabeshima Y. -i. Fujii-Kuriyama Y., Muramatsu M., a Ogata K. Náture 308:333-338 (1984).

33. Young R. A., Hagencuhle O. a Schibler U. Celí 23:451-558(1981).

34. Medford R. M., Nguyen H. T., Destree A. T., Summers E. a Nadal-Ginard B. Celí 38:409-42 (1984).

35. Ziff E. B. Náture 287:491-499 (1980).

36. Earlv P. Celí 20:313-319 í 1980).

37. Sytkowski A. Bio. Biop. Res. Comm. 96:143-149 (1980).

38. Murphy M. a Miyake T. Acta. Haematol. Jpn. 46:1380-1396(1983).

39. Wagh P. V: a Bahl, O. P. CRC Critical Rieviews in Biochemistry 307-377 (1981).

40. Wang F. F., Kung C. K. H. a Goldwasser E. Fed. Proc. Fed. Am, Soc. Exp-, Biol. 42:1872 (abstr) (1983).

41. Lowy P., Keighley G. a Borsook H. Náture 185:102-103 (1960).

42. VanLenten L. a Ashwell G. J. Biol. Chem. 247:4633-4640(1972).

43. I-ee-Huang S. Proc. Naťl Acad. Sci. U.S.A. 81:2708-2712(1984).

44. Fyhrquist F., Rosenlof K., Gronhagen-Riska C., Hortling L. ar Tikkanen I. Náture 308:649-562 (1984).

45. Ohkubo H., Kageyama R., Vjihara M., Hirose T., Inayama S., ar Nakanishi S. Proc. Naťl Acad. Sci. U.S.A. 80:2196-2200(1983).

46. Suggs S.V., Wallace R. B., Ilirose T., Kawashima E. H. ar. Itakura K. Proc. Naťl. Acad. Sci. U.S.A.-78:6613-6617 (1981).

47. Woo S. L. C., Dugaiczyk A., Tsai M. J., Lai E. C., Catterall J. F. aO'Malley B. W. Proc. Naťl. Acad. Sci.U.S.A. 75:3688-(1978).

48. Melchior W. B. a VonHippel P. H. Proc. Naťl Acad, Soc. U.S.A. 70:298-302 (1973).

49. Orosz J. M. a Wetmis J. G. Biopolvmers 16:1183-1199 (1977).

50. Anderson S aKingston I. B. Proc. Naťl Acad. Sci. U.S.A. 80:6836-6842 61983).

51. Ullrich A., Coussens L., Hayflick J. S. Duli T. J., Gray A., Tam A. W., Lee J., Yarden Y., Libermann T. A., Schlessinger J., Downward J., Mayes E. L. V., Whittle H., Waterfield M.D, a Seeburg P. H. Náture 309:418-425 (1984).

52. Fisher J. Proc. Soc. Exptl. Biol. a J Med. 173:289-305 (1983).

53. Kozák M. Nuc. Acid Res. 12:857-872 (1984).

54. Benton W. D. a Davis R. W. Science 196:180-182 (1977).

55. Sherwood J. B. a Goldwasser E. Blood 54:885-893 (1979).

56. Derman E., Krauter K., Walling L., Weinberger C., Ray M., a Damell, J. T., Celí 23:731-(1981).

57. Gluzman Y.. Celí 23:175-182(1981).

58. Hewick R. M., Hunkapiller M. E., Hood L. E., a Dreyer W. J. J. Biol, Chem, 256:7990-7997 (1981).

59. Towbin H., Stachelin T., a Gordon J., Proc. Naťl Acad. Sci. 76:4380-(1979).

60. Camott P., DeFlandre, C. C. R. Acad. Sci. Paris 143:432-(1960).

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rekombinantný DNA plazmidový vektor, obsahujúci cDNA kódujúcu ľudský erytropoetín (EPO) klonu lambda HEPOFL13 (ATCC 40153).
2. 2. Cicavčia bunka transformovaná transfer vektorom podľa nároku 1.
3. 3. Bunka podľa nároku 2, kde uvedenou cicavčou bunkou je 3T3, C127 alebo CHO bunka.
4. 4. Cicavčia bunka, obsahujúca plazmid, ktorý obsahuje celú DNA hovädzieho papilloma vírusu a cDNA sekvenciu z tabuľky 3 kódujúcu ľudský EPO.
5. 5. Bunka podľa nároku 4, ktorou je bunka C127 alebo 3T3.
6. 6. Bunka podľa nároku 5, kde uvedená EPO DNA je pod transkripčnou kontrolou myšieho metalotionen promótora.
7. 7. Bunka podľa nároku 5, ktorá obsahuje plazmid, obsahujúci DNA z pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224).
8. 8. Rekombinantný ľudský erytropoetín, charakterizovaný prítomnosťou O-napojenej glykozylácie, pripraviteľný stupňami

   a) kultivácie CHO buniek podľa nároku 3 obsahujúcich DNA sekvenciu kódujúcu ľudský erytropoetín vo vhodnom médie, kde uvedená DNA sekvencia je operatívne pripojená k expresnej kontrolnej sekvencií a

   b) získania a oddelenia EPO z buniek a média.
9. 9. Rekombinantný ľudský erytropoetín podľa nároku 8, jeho glykozylové zvyšky zahŕňajú zvyšky fukózy.
10. 10. Rekombinantný ľudský erytropoetín podľa nároku 9, charakterizovaný glykozylačným profilom, zahŕňajúcim vzájomný molárny pomer hexóz k N-acetylglukózamínu (Nacglc) 1,4 : 1, konkrétne galaktózy : Nacglc = 0,9 : 1 a manózy : Nacglc = 0,5 : 1.
11. 11. Rekombinantný ľudský erytropoetín podľa nároku 9 alebo 10, charakterizovaný prítomnosťou N-acetyl-galaktózamínu.
12. 12. Spôsob výroby rekombinantného ľudského erytropoetínu (hEPO)zahŕňajúci stupne

    a) kultivácie CHO buniek, ktoré obsahujú DNA sekvenciu kódujúcu hEPO operatívne pripojenú k expresnej kontrolnej sekvencií, vo vhodnom médie a

    b) získania a separácie produkovaného rekombinantného hEPO z buniek a média, vyznačujúci sa tým, že sa použijú CHO bunky majúce schopnosť poskytovať N- a O-pripojenú glykozyláciu so zavedením fukózy a N-acetylgalaktózamí-nu, pričom z buniek a média sa získa a oddelí rekombinantný hEPO s N- a O-pripojenou glykozyláciou.
13. 13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa t ý m , že rekombinantný hEPO má nasledujúci glykozylačný profil: molárny pomer hexóz k N-acetylglukózamínu (Nacglc) 1,4 : 1, konkrétne molárny pomer galaktózy k Nacglc 0,9 : 1 a manózy k Nacglc 0,5 :1.