SK115094A3

SK115094A3 - Pretreatment of microprojectiles prior to using a particle gun

Info

Publication number: SK115094A3
Application number: SK1150-94A
Authority: SK
Inventors: Dwight Tomes; Margit Ross; Leigh Bangs
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int
Priority date: 1993-01-29
Filing date: 1993-01-29
Publication date: 1995-07-11
Also published as: JPH07504575A; EP0644945A1; EP0644945A4; WO1994017195A1

Abstract

An improvement in the process of transporting biological materials into living cells by bombarding the cells with microprojectile particles coated with biological material. In the improved process prior to coating of the particles such as tungsten beads for example, with biological material such as DNA, the particles are first pretreated with a strong inorganic acid such as nitric acid.

Description

Predbežné spracovanie mikroprojektilov pred použitím v časticovom delePretreatment of microprojectiles prior to use in a particle gun

Oblasť technikyTechnical field

Vynález sa týka zlepšeného spôsobu prenosu biologických materiálov, ako sú nukleové kyseliny, do cytoplazmy živých buniek.The invention relates to an improved method for transferring biological materials, such as nucleic acids, into the cytoplasm of living cells.

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

S rýchlym rozvojom rekombinačnej technológie DNA sú biológovia stavaný pred rozsiahlu úlohu prenášať biologické látky z jednej bunky do druhej a prenášať syntetický biologický materiál do živých buniek, aby tu mohol účinne pôsobiť. Takýto materiál môže zahŕňať biologické farbivá, proteíny (protilátky alebo enzýmy) a najčastejšie genetický materiál na báze nukleových kyselín (buď RNA alebo DNA). Väčšina používaných techník je velmi pomalá a používa metódy, ktorými sa materiál dopraví súčasne najviac do niekolkých buniek. V poslednej dobe bol vyvinutý postup bombardovania časticami s použitím časticového dela, ktorý je opísaný v Sanford a d., 1987, Delivery of Substances Into Cells and Tissues Using A Particle Bombardment Process, Journal o f Particle Science and Technology 5, 27-37, na ktorú prácu sa tu týmto odkazuje.With the rapid development of recombinant DNA technology, biologists are faced with the widespread task of transferring biological agents from one cell to another and transferring synthetic biological material to living cells so that they can function effectively there. Such material may include biological dyes, proteins (antibodies or enzymes) and most commonly nucleic acid-based genetic material (either RNA or DNA). Most of the techniques used are very slow and use methods by which the material is transported at the same time to several cells at the same time. Recently, a particle bombardment process using a particle gun has been developed as described in Sanford et al., 1987, Delivery of Substances Into Cells and Tissues Using A Particle Bombardment Process, Journal of Particle Science and Technology 5, 27-37, on which work is referred to here.

Skorší vynález jedného zo spolupôvodcov, Dwighta Tomesa, sa týka zlepšeného časticového dela, ktoré používa delo s ryhovanou hlavňou. Na opis bombardovania časticovým delom a spôsobu transportu biologických materiálov, ako je DNA, do živých buniek, uvedený v patentovej prihláške Tomesa z 12.5.1989 pod číslom 07/351,075 s názvom Zlepšené časticové delo, sa tu týmto odkazuje.The earlier invention of one of the co-authors, Dwight Tomes, relates to an improved particle gun that uses a grooved cannon gun. For a description of particle cannon bombardment and a method of transporting biological materials, such as DNA, into living cells, disclosed in Tomes Patent Application, May 12, 1989 under number 07 / 351,075 entitled Improved Particle Cannon, is hereby incorporated herein by reference.

Účinnosť transportov častíc sa samozrejme meria schopnosťou živých buniek, do ktorých boli transportované častice vložené, zachytávať a exprimovať biologický materiál. Tá však samozrejme závisí na veľmi rôznych podmienkach. Čím je expresia nižšia, tým menej úspešný je transport. Podobne čím úspešnejšia je expresia živých buniek, t.j.. rozsah, v ktorom zachytávajú a exprimujú transportovaný biologický materiál, tým lepšie sú experimenty s inzerciou nukleových kyselín.The efficacy of particle transport is, of course, measured by the ability of living cells into which the transported particles have been introduced to capture and express biological material. This, of course, depends on very different conditions. The lower the expression, the less successful the transport. Similarly, the more successful the expression of viable cells, i.e. the extent to which they capture and express the transported biological material, the better the nucleic acid insertion experiments are.

V technike časticového dela sa biologický materiál (napríklad DNA) mieša s nosičom. Nosič je obvykle tvorený v podstate inertným materiálom vo forme malých perličiek, ktoré fungujú ako mikroprojektily. Mikroprojektily majú obvykle priemer v rozmedzí asi 1 až asi 4 μιη. Tieto perličky môžu byť vyrobené z volfrámu, paládia, platiny alebo zlata alebo z ich zliatiny. Z ekonomických dôvodov sa dáva prednosť volfrámu. Volfrám však obvykle neposkytuje tak dobrý alebo úspešný transport ako zlato, pokiaľ sa neaplikuje predbežná úprava. Perličky môžu mať obvykle priemer asi 1 až asi 1,5 μιη.In a particle gun technique, biological material (e.g., DNA) is mixed with a carrier. The carrier is usually formed by a substantially inert material in the form of small beads which act as microprojectiles. The microprojectiles usually have a diameter in the range of about 1 to about 4 μιη. These beads may be made of tungsten, palladium, platinum or gold or an alloy thereof. Tungsten is preferred for economic reasons. However, tungsten usually does not provide as good or successful transport as gold unless pretreatment is applied. The beads may typically have a diameter of about 1 to about 1.5 µιη.

V najvýhodnejšom procese sa perličky miešajú s malým množstvom biologického materiálu, ako je DNA alebo RNA. Produkt sa mieša s chloridom vápenatým a pridá sa určité množstvo polyamínu.In the most preferred process, the beads are mixed with a small amount of biological material such as DNA or RNA. The product is mixed with calcium chloride and some polyamine is added.

Tieto prísady sa obvykle používajú v takýchto množstvách:The following additives are usually used in the following amounts:

μΐ volfrámových častíc s koncentráciou 15 až 400 mg v 2 ml sterilnej vody sa umiestni do sterilnej 10 ml odstredivkovej skúmavky a perličky sa suspendujú miešaním. Výhodné množstvo perličiek je 375 mg/2 ml. 25 μΐ suspendovaných volfrámových perličiek sa umiestni do Eppendorfovej skúmavky a pridá sa DNA o koncentrácii 1 μ9/μ1 v množstve pohybujúcom sa medzi 1 a 20 μΐ, výhodne 10 μΐ. So zmesou DNA/perličky sa premieša roztok chloridu vápenatého v množstve 25/μ1 o koncentrácii 1,0 až 4,0 M, výhodne 2,5 M.μΐ of tungsten particles at a concentration of 15 to 400 mg in 2 ml of sterile water are placed in a sterile 10 ml centrifuge tube and the beads are suspended by stirring. The preferred amount of beads is 375 mg / 2 ml. Place 25 μΐ of the suspended tungsten beads in an Eppendorf tube and add 1 μ9 / μ1 DNA in an amount ranging between 1 and 20 μΐ, preferably 10 μΐ. Mix the 25 ml / ml solution of calcium chloride at a concentration of 1.0 to 4.0 M, preferably 2.5 M, with the DNA / bead mixture.

Prídavok spermidinu ku kombinácii biologický materiál/ mikroprojektil bol už použitý skôr, avšak teraz bolo všeobecnejšie zistené, že prídavok rôznych polyamínov k zmesiam volfrámových perličiek a DNA alebo RNA pri príprave mikroprojektilov významne zlepšuje rýchlosť transformácie. Bez obmedzenia teóriou sa má za to, že polyamín pri tomto procese zlepšuje dopravu biologického materiálu k bunkám zvyšovaním adhézie materiálov k mikroprojektilovým perličkám. Bolo zistené, že vhodné polyamíny zahŕňajú napríklad spermin, spermidin, kaldin, termín a pod. Výhodný polyamín spermin sa prejavil ako lepší oproti skôr opísanému spermidinu. V tomto okamihu sa teda pridáva polyamín, výhodne spermin, v množstve 10 μΐ a o koncentrácii 0,05 až 0,5 M, výhodne 0,1 M, a zmes sa premieša tyčinkou. Táto zmes sa nechá 10 min stáť a potom sa odstred’uje 1 až 2 min pri 9 000 ot/min. Odstreďovanie je možné použiť, avšak nie je nutné. Zmes mikroprojektilov vytvorí na dne Eppendorfovy skúmavky peletu. Pred použitím sa zo skúmavky odleje supernatant a konečný objem je 30 μΐ.The addition of spermidine to the biological material / microprojectile combination has been used previously, but it has now been found more generally that the addition of various polyamines to mixtures of tungsten beads and DNA or RNA in the preparation of microprojectiles significantly improves the transformation rate. Without being limited by theory, it is believed that polyamine in this process improves the transport of biological material to cells by increasing material adhesion to microprojectile beads. Suitable polyamines have been found to include, for example, spermine, spermidine, caldine, the term, and the like. The preferred polyamine spermine has been shown to be superior to the spermidine previously described. Thus, at this point, a polyamine, preferably spermine, is added in an amount of 10 μΐ at a concentration of 0.05 to 0.5 M, preferably 0.1 M, and the mixture is mixed with a rod. The mixture is allowed to stand for 10 minutes and then centrifuged for 1 to 2 minutes at 9,000 rpm. Centrifugation can be used but is not necessary. The microprojectile mixture forms a pellet at the bottom of the Eppendorf tubes. Before use, the supernatant is discarded from the tube and the final volume is 30 μΐ.

Zmes DNA/perličky sa pred použitím krátko sonifikuje za účelom suspendovania mikroprojektilov. Suspendované mikroprojektily, nesúce biologický materiál, sa prenesú na predný koniec mikroprojektilu mikropipetou v alikvótach po 1 až 5 μΐ, výhodne 1,5 μΐ.The DNA / bead mixture is briefly sonicated prior to use to suspend the microprojectiles. Suspended microprojectiles carrying the biological material are transferred to the front end of the microprojectile by a micropipette in aliquots of 1 to 5 μΐ, preferably 1.5 μΐ.

Medzi obtiaže, ktoré nastávali v minulosti pri použití mikroprojektilov, patrí skutočnosť, že na častice sa nabalia veľké hmoty DNA, čo sťažuje ich separáciu a zvyšuje pravdepodobnosť, že počas bombardovania častice usmrtia bunky.Among the difficulties encountered in the past with the use of microprojectiles is the fact that large particles of DNA accumulate on the particles, making it difficult to separate and increasing the likelihood that the particles will kill cells during the bombardment.

Ako je zrejmé, existuje trvalá potreba vyvinúť proces bombardovania mikroprojektilmi pre zlepšenú transformáciu biologických materiálov do živých buniek, pri ktorom by bunky neboli pri bombardovaní usmrcované, pri ktorom by bolo možné používať lacnejšie volfrámové perličky a ktorý by i pri použití týchto lacnejších perličiek umožňoval vysoko úspešnú transformáciu a expresiu. Primárnym účelom vynálezu je uspokojiť túto potrebu.As is evident, there is a continuing need to develop a microprojectile bombardment process to improve the transformation of biological materials into living cells, where cells are not killed during the bombardment, which can use cheaper tungsten beads and which, even using these cheaper beads, would allow highly successful transformation and expression. The primary purpose of the invention is to satisfy this need.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Vynález sa týka zlepšenia spôsobu úspešného transportu biologických materiálov do buniek pomocou častíc povlečených týmto biologickým materiálom. Výhodné častice sú volfrámové a spôsob podľa vynálezu umožňuje použitie ekonomickejších volfrámových perličiek miesto zlatých. Účel vynálezu sa dosahuje zaradením predbežného spracovania výhodných volfrámových perličiek silnou anorganickou kyselinou, výhodne kyselinou dusičnou.The invention relates to the improvement of a method of successfully transporting biological materials into cells by means of particles coated with the biological material. Preferred particles are tungsten and the method of the invention allows the use of more economical tungsten beads instead of gold. The purpose of the invention is achieved by the inclusion of pretreatment of the preferred tungsten beads with a strong inorganic acid, preferably nitric acid.

Podľa vynálezu sa pred povliekaním mikroprojektilových perličiek najskôr uskutoční ich spracovanie silnou anorganickou kyselinou. Silná anorganická kyselina sa volí zo skupiny zahŕňajúcej kyselinu dusičnú, kyselinu sírovú, kyselinu chlorovodíkovú a kyselinu fosforečnú alebo ich zmesi. Výhodnou kyselinou je kyselina dusičná.According to the invention, before the microprojectile beads are coated, they are first treated with a strong inorganic acid. The strong inorganic acid is selected from the group consisting of nitric acid, sulfuric acid, hydrochloric acid and phosphoric acid or mixtures thereof. The preferred acid is nitric acid.

Koncentrácia silnej anorganickej kyseliny nie je kritická. Na spodnej hranici bola úspešne použitá až 0,01 molárna koncentrácia a horná hranica sa zdá závisieť len na ekonomickej úvahe. Zvlášť prebytočné množstvá nie sú škodlivé voči metalurgii alebo povrchu perličiek, ale nie je dôvodu používať koncentrácie nad hodnotu koncentrácie dostatočnej k účinnému vyčisteniu a predbežnému spracovaniu perličiek. Všeobecne je možné za hornú hranicu považovať praktickú hranicu 1,0 molárnej koncentrácie; výhodná bude koncentrácia kyseliny v rozmedzí 0,1 až asi 0,5 molárnej koncentrácie.The concentration of a strong inorganic acid is not critical. Up to 0.01 molar concentration was successfully used at the lower limit and the upper limit seems to depend only on economic considerations. In particular, excess amounts are not detrimental to the metallurgy or bead surface, but there is no reason to use concentrations above the concentration sufficient to effectively clean and pre-treat the beads. In general, the practical limit of 1.0 molar concentration can be considered as the upper limit; an acid concentration in the range of 0.1 to about 0.5 molar concentration will be preferred.

Dĺžka spracovania nie je kritická, ale obvykle sa môže pohybovať od asi 5 do asi 60 min, výhodne od asi 10 do asi 20 min. Význam doby spracovania spočíva v tom, aby bola dos tatočná k úspešnému kontaktu perličiek s kyselinou dusičnou. V tomto ohlade sa dostatočný kontakt dosiahne najlepšie, ak sa perličky počas predbežného spracovania miešajú. Miešanie je výhodne kontinuálne a najvýhodnejšie sa uskutočňuje sonifikáciou. Po sonifikácii by častice, pokial boli spracované kyselinou dusičnou, nemali vypadávať z kvapalnej suspenzie, ak sú čisté. Po 20 min sonifikácie zostali vyprané častice v suspenzii, a tak bolo stanovené, že pranie po dobu 20 min je dostatočné pre úspešné vyčistenie volfrámových častíc. Pred praním kyselinou dusičnou volfrám okamžite vypadával zo suspenzie.The processing time is not critical, but it can usually be from about 5 to about 60 minutes, preferably from about 10 to about 20 minutes. The significance of the processing time is that it is sufficient to successfully contact the beads with nitric acid. In this regard, sufficient contact is best achieved by mixing the beads during pretreatment. The mixing is preferably continuous and most preferably carried out by sonication. After sonication, the particles, when treated with nitric acid, should not fall out of the liquid suspension when they are clean. After 20 min of sonication, the washed particles remained in suspension, and it was determined that washing for 20 min was sufficient to successfully clean the tungsten particles. Before washing with nitric acid, tungsten immediately fell out of the suspension.

Presne použité perličky nie sú kritické a proces vykazuje zretelné výhody, ak sa jedná o akúkolvek perličku zvolenú zo skupiny zahŕňajúcej volfrám, paládium, platinu a zlato alebo ich zliatinu. Výhodne majú perličky priemer asi 1 až asi 1,5 μπι. Najvýhodnejšie perličky sú volfrámové, pretože s aplikáciou predbežného spracovania podlá vynálezu môže byť volfrám používaný rovnako účinne, ako drahšie kovy, ako je platina, paládium a zlato.Precisely used beads are not critical and the process exhibits appreciable advantages when it is any bead selected from the group consisting of tungsten, palladium, platinum and gold or an alloy thereof. Preferably, the beads have a diameter of about 1 to about 1.5 µπι. Most preferably the beads are tungsten, since with the pretreatment of the invention tungsten can be used as efficiently as more expensive metals such as platinum, palladium and gold.

Po predbežnom spracovaní podlá vynálezu je možné aplikovať rôzne bežné stupne. Z perličiek sa vymýva kyselina a vymývanie sa môže uskutočňovať vodou, napríklad s nasledujúcim vymývaním alkoholom, napríklad etanolom. Perličky sa potom sušia obvyklým spôsobom na vzduchu, napríklad rýchlym vákuovým sušením. Potom je k mikroprojektilom pridávaný biologický materiál, ako je DNA, a uskutočňuje sa príslušné miešanie. S biologickým materiálom je známe miešať bežné prísady, ako je chlorid vápenatý a určité množstvo amínu, ako je polyamín. Potom sa bombarduje rastlinné tkanivo pre uskutočnenie transportu biologického materiálu do živých buniek alebo ich stimulácie .After the pretreatment according to the invention, various conventional steps can be applied. The beads are eluted with acid and the elution may be carried out with water, for example followed by elution with an alcohol, for example ethanol. The beads are then air dried in the usual manner, for example by rapid vacuum drying. Biological material, such as DNA, is then added to the microprojectiles and mixing is performed. It is known to mix conventional additives such as calcium chloride and a certain amount of an amine such as polyamine with the biological material. Plant tissue is then bombarded to carry biological material into living cells or stimulate them.

Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Pre osvetlenie, ale nie pre omedzenie vynálezu, sú uvedené príklady. Demonštrujú, že predbežné spracovanie volfrámu podľa vynálezu je účinnejšie ako u zlatých perličiek.Examples are provided to illustrate but not limit the invention. They demonstrate that the pretreatment of tungsten according to the invention is more efficient than that of gold beads.

Príklad 1Example 1

V tomto príklade sa v časticovom dele skúša volfrám a zlato po použití kyseliny dusičnej k vyčišteniu povrchu častíc ako prostriedku pre zníženie flokulácie a zvýšenie väzby DNA.In this example, tungsten and gold are tested in the particle gun after using nitric acid to clean the surface of the particles as a means to reduce flocculation and increase DNA binding.

Účelom je zhodnotiť účinok čistenia kyselinou dusičnou na volfrámové a zlaté častice pred ich sušením rýchlym vákuom. Porovnávajú sa zo štandardnou kontrolou.The purpose is to evaluate the effect of nitric acid purification on tungsten and gold particles before drying under high vacuum. They are compared with a standard check.

Ako genotypový materiál sa použije suspenzia zárodočnej kukuričnej DNA. Kukuričné suspenzné médium obsahuje soli podlá Murashigeho a Skooga, viď. A Revised Method for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures, Physiol. Plánt. 15, 473-497 (1962), s prídavkom 2,0 mg/1 2,4-D, čo je kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová, a 3 % sacharózy. Naviac médium obsahuje kukuričné kalusové médium, opísané takto: AT soli s 700 mg/1 prolinu, 0,75 mg/1 2,4-D, 3 % sacharózy, viď. Tomes, D., Celí Culture, Somatic Embryogenesis and Plánt Regeneration in Maize, Rice, Sorghum, and Millets, Cereal Tissue and Celí Culture, Nijnoff and Junk, Amsterdam, 1985.A germline maize DNA suspension is used as genotype material. The corn suspension medium contains salts according to Murashige and Skooga, cf. Revised Method for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures, Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962), with the addition of 2.0 mg / l 2,4-D, which is 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, and 3% sucrose. In addition, the medium contains corn callus medium, described as follows: AT salts with 700 mg / l proline, 0.75 mg / l 2,4-D, 3% sucrose, cf. Tomes, D., Cell Culture, Somatic Embryogenesis and Plant Regeneration in Maize, Rice, Sorghum, and Millets, Cereal Tissue and Cell Culture, Nijnoff and Junk, Amsterdam, 1985.

Časticové delo sa používa rovnaké, aké je opísané v citovanej Tomesovej prihláške. Perličky sa použijú volfrámové 1,8 μιη od GTE, volfrámové 1,2 μπι od GE, zlaté (bez vločiek) od Engelhard Industries a používa sa 25 mg tkaniva na poťah. Uskutočňuje sa predbežné spracovanie mannitolom cez noc a jedno bombardovanie na vzorku s použitím pDP460 DNA, ktorá obsahuje gén GUS. pDP460 je opísaný ďalej v príklade 2.The particle gun is used as described in the cited Tomes application. The beads are used tungsten 1.8 μιη from GTE, tungsten 1.2 μπι from GE, gold (flake free) from Engelhard Industries and 25 mg tissue per coating is used. Mannitol pretreatment overnight and one bombardment per sample using pDP460 DNA containing the GUS gene are performed. pDP460 is described below in Example 2.

Bombardovanie prebieha takto: Suspenzné bunky sa používajú jeden deň po subkultivácii, presípajú sa cez sito 710 μπι a resuspendujú v kukuričnom suspenznom médiu + 0,25 M mannitolu v koncentrácii 50 mg/ml (1 g tkaniva v 20 ml média). Potom sa zmes trepe cez noc na trepačke. K príprave pre časticové delo sa 0,5ml alikvoty napipetujú na stred dvojitej vrstvy filtračného papieru Whatman typ 617, na ktorom bolo pridané 1 ml kukuričného suspenzného média + 0,25 M mannitolu. Bunky sa zhromaždia v strede každej doštičky pre maximalizáciu účinku bombardovania.The bombardment proceeds as follows: Suspension cells are used one day after subculturing, passed through a 710 μπι screen and resuspended in corn suspension medium + 0.25 M mannitol at a concentration of 50 mg / ml (1 g tissue in 20 ml medium). The mixture was then shaken overnight on a shaker. To prepare for the particle gun, 0.5 ml aliquots are pipetted to the center of a double layer Whatman type 617 filter paper on which 1 ml corn suspension medium + 0.25 M mannitol was added. Cells are collected at the center of each plate to maximize the effect of the bombardment.

Pre všetky spracovania častíc sa použije šesťnásobné opakovanie spolu so šesťnásobným opakovaním štandardnej pozitívnej kontroly. Celkom sa použije 26 vzoriek. Doplnia sa dve nezávislé opakovania experimentu.Six-fold repetition is used for all particle processing along with six-fold standard positive control. A total of 26 samples are used. Two independent repeats of the experiment were added.

Pre vyčištenie volfrámových a zlatých částic sa naváži 375 mg častíc v 2 ml 0,1 M kyseliny dusičnej. Potom sa uskutočňuje 20 min sonifikácia na íade s použitím sonifikátora nastaveného na minimum, udržujúceho částice v suspenzii. Potom se častice premyjú dvakrát sterilnou deionizovanou vodou; pri konečnom premývaní sa nahradí 1 ml 95% EtOH. Nato sa uskutoční rýchle sušenie vo vákuu.To clean the tungsten and gold particles, weigh 375 mg of the particles in 2 ml of 0.1 M nitric acid. Thereafter, sonication is carried out on ice for 20 min using the sonication set to the minimum, keeping the particles in suspension. The particles are then washed twice with sterile deionized water; for the final wash, replace with 1 mL of 95% EtOH. A rapid vacuum drying is then carried out.

Všetky vzorky sa podrobia jednému bombardovaniu časticovým delom.All samples are subjected to a single particle gun bombardment.

Po spracovaní časticovým delom sa vrchný filtračný papier z každej vzorky prenesie do kukuričného kalusového média. Bunky sa inkubujú 48 h v tme pri 28 “C a potom sa zisťuje prechodná aktivita GUS.After treatment with the particle gun, the top filter paper from each sample is transferred to corn callus medium. The cells are incubated for 48 h in the dark at 28 ° C and then the transient GUS activity is determined.

Po 48 h po spracovaní sa vzorky použijú k cytochemickému testu GUS. Na základe prechodnej aktivity GUS sa porovnávajú typy častíc, čistenie častíc a zdroje častíc.48 hours after processing, the samples are used for the GUS cytochemical assay. Based on transient GUS activity, particle types, particle cleaning, and particle sources are compared.

Analýzou odchýlok boli zistené významné rozdiely medzi typmi mikroprojektilu (zlato, volfrám) a medzi prevedeným čistením mikroprojektilov v tomto pokuse, avšak nebola nájdená štatisticky významná interakcia medzi týmito premennými. S použitím t-testu k oddelenej analýze jednotlivých typov a spracovaní mikroprojektilov bola nájdená jediná signifikancia u volfrámu GTE. Tento výsledok bol očakávaný, pretože existoval velký rozdiel vo výsledkoch u volfrámu GTE oproti GE. Po spracovaní kyselinou dusičnou sú výsledky u oboch typov volfrámu takmer rovnaké. Výsledky sú uvedené v tabuľke 1.An analysis of variation revealed significant differences between the microprojectile types (gold, tungsten) and the microprojectile purification performed in this experiment, but no statistically significant interaction between these variables was found. Using the t-test to separately analyze individual types and process microprojectiles, a single significance was found in tungsten GTE. This result was expected because there was a large difference in the results of GTE tungsten compared to GE. After treatment with nitric acid, the results are almost identical for both types of tungsten. The results are shown in Table 1.

TABUĽKA 1.TABLE 1.

Cytochemická analýza β-glukuronidasy na prechodnú expresiu génu dokončenú po 36 h po spracovaníCytochemical analysis of β-glucuronidase for transient gene expression completed 36 h after processing

Genotyp: 54-68-5, kukuričná embryogenná suspenziaGenotype: 54-68-5, maize embryogenic suspension

DNA: pPHI460DNA: pPHI460

Jedno bombardovanie na vzorkuOne bombardment per sample

Typ Spracovanie Skupiny buniek GUS častíc____________častíc_______________DNA N min stred maxType Processing Cell group GUS particles ____________ particles _______________ DNA N min center max

Volfrám GE EtOH Tungsten GE EtOH 460 460 12 12 29 29 137 137 342 342 Volfrám GE kys. Tungsten GE acid. dusičná nitric 460 460 12 12 62 62 217 217 460 460 Významnosť = 0,111 Significance = 0.111 Volfrám GTE EtOH Tungsten GTE EtOH 460 460 11 11 3 3 81 81 169 169 Volfrám GTE kys. Tungsten GTE acid. dusičná nitric 460 460 12 12 39 39 187 187 440 440 Významnosť = 0,023 Significance = 0.023 Nevločkové zlato EtOH Nonflake gold EtOH 460 460 12 12 4 4 53 53 122 122 Nevločkové zlato kys. Nonflake gold sour. dusičná nitric 460 460 12 12 8 8 100 100 259 259

Významnosť = 0,119 * Významnosť spracovania častice v rámci jedného typu častice sa zisťuje na malom vzorku pomocou t-štatistiky.Significance = 0.119 * Significance of particle processing within one particle type is determined on a small sample using t-statistics.

Z údajov v tabuľke 1 vyplýva, že prvé čistenie povrchu volfrámových častíc je účinným prostriedkom zníženia flokulácie a zvýšenia väzby DNA v porovnaní s použitím častíc neošetrených kyselinou dusičnou oproti zlatým spracovaným alebo nespracovaným časticiam.The data in Table 1 shows that the first surface cleaning of the tungsten particles is an effective means of reducing flocculation and increasing DNA binding compared to the use of untreated nitric acid particles over gold treated or unprocessed particles.

Príklad 2Example 2

V tomto príklade sa spôsob podľa vynálezu s použitím volfrámu, vopred spracovaného kyselinou dusičnou, porovnáva s volfrámovými perličkami nespracovanými kyselinou dusičnou. Porovnáva sa tiež s bombardovaním buniek s použitím volfrámových mikroprojektilov nespracovaných kyselinou dusičnou v časticovom diele s použitím štandardného protokolu, doporučeného a verejne publikovaného fou DuPont. Publikovaný protokol fy DuPont znie:In this example, the process of the invention using tungsten pretreated with nitric acid is compared to tungsten beads not treated with nitric acid. It is also compared to cell bombardment using tungsten microprojectiles not treated with nitric acid in a particle assembly using a standard protocol recommended and publicly published by DuPont. DuPont's published protocol reads:

Navážit 60 mg častíc a suspendovať v 1 ml 100% etanolu. Sonifikovať. Odstred'ovať 1 min pri 10 000 min^-1. Zliať supernatant etanolu a nahradiť 1 ml sterilnej deionizovanej vody. Sonifikovať. Odstred'ovať 1 min pri 10 000 min^-1. Po konečnom premytí resuspendovať v 1 ml deionizovanej vody. Uchovávať v mrazničke. Po príprave DNA je možné dokončiť povliekanie častíc.Weigh 60 mg of the particles and suspend in 1 ml of 100% ethanol. Sonicated. Centrifuge at 10,000 rpm for ¹ min. Pour ethanol supernatant and replace with 1 ml sterile deionized water. Sonicated. Centrifuge at 10,000 rpm for ¹ min. After the final wash, resuspend in 1 ml deionized water. Store in a freezer. After the DNA has been prepared, the coating of the particles can be completed.

Pripraviť v malých alikvótach v mikroskúmavkách častice povlečené DNA (každá alikvóta má vystačiť na tri bombardovania). Súčasne je možné pripraviť viac alikvót. Pre každú alikvótu umiestniť 25 μΐ premytých častíc (zaistiť úplné resuspendovanie) do mikroskúmavky, potom postupne pridať: 2,5 μΐ DNA (1 μ9/μ1) a päťkrát premiešať tyčinkou; 25 μΐ 2,5 CaCl₂ a päťkrát premiešať tyčinkou a 10 μΐ spermidinu (0,1 M volná báza) a päťkrát premiešať tyčinkou. Ponechať asi 10 min stáť. Odstred’ovať 3 min a odstrániť 40 až 50 μΐ supernatantu (tým sa zakoncentrujú častice a zostane práve dostatoč né množstvo pre 3 bombardovania). Pre všetky zostatkové alikvóty opakovať tento postup.Prepare DNA coated particles in small aliquots in microtubes (each aliquot should suffice for three bombings). Multiple aliquots may be prepared simultaneously. For each aliquot, place 25 μΐ of the washed particles (ensure complete resuspension) in the microtube, then add in succession: 2.5 μ (DNA (1 μ9 / μ1) and mix five times with a stick; 25 μΐ 2.5 CaCl ₂ and mix five times with the stick and 10 μΐ spermidine (0.1 M free base) and mix five times with the stick. Let stand for about 10 min. Centrifuge for 3 min and remove 40 to 50 μΐ of the supernatant (this will concentrate the particles and leave just enough for 3 bombardments). Repeat this procedure for all residual aliquots.

V tomto príklade sa DuPontov protokol porovnáva s protokolom podlá vynálezu, kde sa volfrámové častice 1,8 μπι pripravia podlá tohoto postupu:In this example, the DuPont protocol is compared to the protocol of the invention, wherein 1.8 µπ tungsten particles are prepared according to the following procedure:

Navážiť 375 mg Ι,δμπι volfrámových častíc a suspendovať v 2 ml 0,IM kyseliny dusičnej. Sonifikovať 20 min na lade. Odstred’ovať 1 min pri 10 000 min^-1 a odstrániť kyselinu dusičnú. Pridať 2 ml sterilnej deionizovanej vody, krátko sonifikovať a potom odstrediť, pridať znova vodu a dvakrát premyť. Vodný supernatant zliať a pridať 2 ml 100% etanolu. Resuspendovať častice sonifikáciou a po každej sonifikácii odobrať 25μ1 alikvót. Alikvóty umiestniť do jednotlivých Eppendorfových skúmaviek. Suspenziu volfrám/etanol rýchlo vysušiť vo vákuu. Častice uchovávať prikryté pri teplote miestnosti .Weigh out 375 mg Ι, δμπι of tungsten particles and suspend in 2 ml of 0.1M nitric acid. Sonify for 20 min on ice. Centrifuge at 10,000 rpm for ¹ min and remove nitric acid. Add 2 ml of sterile deionized water, sonicate briefly and then centrifuge, add water again and wash twice. Discard the aqueous supernatant and add 2 mL of 100% ethanol. Resuspend the particles by sonication and remove a 25μ1 aliquot after each sonication. Place aliquots in individual Eppendorf tubes. Dry the tungsten / ethanol suspension rapidly in vacuo. Keep the particles covered at room temperature.

Zrážanie volfrám/DNA metódou Pioneer sa uskutočňuje takto: pridať 10 μΐ (1 μ9/μ1) DNA k volfrámu rýchlo vysušenému vo vákuu, premiešať pipetou. K suspenzii volfrám/DNA pridať 25 μΐ 2,5M CaCl₂, premiešať pipetou. K suspenzii volfrám/DNA/CaCl pridať 10 μΐ 0,IM sperminu, premiešať tyčinkou. Nechať suspenziu stáť 15 min pri teplote miestnosti a potom odobrať 15 μΐ supernatantu. Sonifikovať suspenziu a potom odobrať 1,5μ1 alikvóty na makroprojektily.Tungsten / DNA precipitation by the Pioneer method is performed as follows: add 10 μΐ (1 μ9 / μ1) of DNA to the tungsten rapidly dried under vacuum, mix by pipette. Add 25 μΐ 2.5M CaCl _{2 to the} tungsten / DNA suspension, mix by pipette. To the tungsten / DNA / CaCl suspension add 10 μΐ of 0, 1M sperm, mix with a stick. Allow the suspension to stand at room temperature for 15 min and then collect 15 μΐ of the supernatant. Sonify the suspension and then take 1.5 µl aliquots for macroprojectiles.

Použije sa embryogénna kukuričná suspenzia 2-122-4 (W23 x B73). Kultivačné médium a postup bombardovania je rovnaký ako v príklade 1.Embryogenic maize suspension 2-122-4 (W23 x B73) is used. The culture medium and the bombardment procedure are the same as in Example 1.

Z časticových preparátov, pripravených jednotlivými metódami v deň 1, sa v deň 1, 2,3,4 a 5 postupne odoberajú vzorky s použitím častíc v deň 1. Každý deň sa zodpovedajúcimi postupmi uskutočňuje miešanie DNA/častice. Pre každú sadu v tomto príklade se zhotoví šestnásť vzoriek. Na štrnásť z nich sa pôsobí pDP460 DNA. Plazmid pDP460 obsahuje preklenovacie nukleotidy s posilneným promotorom -421 až +2 z CaMV 35S [R.C. a d., Nucleic Acid Res. 9, 2871 (1981)], fragment o 79 pároch báz Hind III-Sal I z pJIHOl, prekleňujúci 5' vedúcu sekvenciu víru tabakovej mozaiky [D.R. Gallie, D.E. Sleat, J.W. Watts, P.C. Turner, T.M.A. Wilson, Nucleic Acid Res. 15, 3257 (1987)], fragment o 579 pároch báz prekleňujúci prvý intron z kukuričného Adhl-S [E.S. Dennis a d., ibid. 12, 3983 (1984)], fragment o 1870 pároch báz z pRAJ275 prekleňujúci GUS kódujúcu sekvenciu [R. Jefferson, S. Burgess, D. Hirsh, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8447 (1986)] a fragment o 281 pároch báz obsahujúci polyadenylačné miesto génu nopalin synthasy z Agrobacterium tumefaciens [M. Bevan, W.M. Barnes, M. D. Chilton, Science II, 369 (1983)] v pUC18 [C. Yanisch - Perron, J. Vieira, J. Messing, Gene 33, 103 (1985)]. Zostávajúce dve vzorky predstavujú nespracované kontroly. Všetky spracované vzorky boli podrobené jednému bombardovaniu časticovým delom. Bezprostredne po bombardovaní boli vzorky prenesené do kukuričného suspenzného média a udržované 36 h v tme pri 28 °C.Particle preparations prepared by the individual methods on day 1 are sampled sequentially on day 1, 2, 3, 4 and 5 using particles on day 1. DNA / particle mixing is performed each day by appropriate procedures. Sixteen samples are made for each set in this example. Fourteen of them were treated with pDP460 DNA. Plasmid pDP460 contains bridging nucleotides with the enhanced -421 to +2 promoter from CaMV 35S [R.C. and d., Nucleic Acid Res. 9, 2871 (1981)], a 79 base pair fragment of Hind III-Sal I from pJIHO1, spanning the 5 'tobacco mosaic virus leader sequence [D.R. Gallie, D.E. Sleat, J.W. Watts, P.C. Turner, T.M.A. Wilson, Nucleic Acid Res. 15, 3257 (1987)], a 579 base pair fragment spanning the first intron of maize Adhl-S [E.S. Dennis et al., Ibid. 12, 3983 (1984)], a 1870 base pair fragment of pRAJ275 spanning the GUS coding sequence [R. Jefferson, S. Burgess, D. Hirsh, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8447 (1986)] and a 281 base pair fragment containing the polyadenylation site of the nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens [M. Bevan, W.M. Barnes, M. D. Chilton, Science II, 369 (1983)] in pUC18 [C. Yanisch-Perron, J. Vieira, J. Messing, Gene 33,103 (1985)]. The remaining two samples represent untreated controls. All processed samples were subjected to a single particle gun bombardment. Immediately after the bombardment, the samples were transferred to the corn suspension medium and kept at 28 ° C in the dark for 36 h.

Po 36 h po spracovaní boli vzorky podrobené cytochemickému testu na GUS. Boli zaznamenané jednotlivé bunky, ktoré reagujú pozitívne na GUS, ako v prípade vynálezu, tak v prípade protokolu DuPont. Celkovo bola génová expresia pre každé spracovanie v každom dni porovnaná stanovením pomeru medzi postupom podlá vynálezu a DuPontovým protokolom, pričom DuPontov protokol nevykazuje predbežné spracovanie kyselinou dusičnou. Výsletky sú uvedené v tabuľke 2.36 hours after treatment, the samples were subjected to a cytochemical GUS assay. Individual cells that respond positively to GUS were recorded, both for the invention and for the DuPont protocol. Overall, gene expression for each treatment on each day was compared by determining the ratio between the process of the invention and the DuPont protocol, with the DuPont protocol not showing pre-treatment with nitric acid. The results are shown in Table 2.

TABUĹKA 2TABLE 2

SpracovaJednotlivé bunky GUS PomerProcess Single Cell GUS Ratio

nie deň N no day N protokol protocol min. stred min. the middle max. max. vyn/DuPont Inv / DuPont 1 1 7 7 vynález invention 339 339 452 452 572 572 1,7:1,0 1.7: 1.0 7 7 DuPont DuPont 173 173 274 274 319 319 2 2 7 7 vynález invention 207 207 258 258 292 292 1,8:1,0 1.8: 1.0 7 7 DuPont DuPont 84. 84th 146 146 180 180 3 3 7 7 vynález invention 148 148 211 211 301 301 2,9:1,0 2.9: 1.0 7 7 DuPont DuPont 4 4 73 73 100 100 4 4 7 7 vynález invention 228 228 380 380 485 485 3,5:1,0 3.5: 1.0 7 7 DuPont DuPont 8 8 110 110 194 194 5 5 7 7 vynález invention 62 62 217 217 389 389 2,4:1,0 2.4: 1.0 7 7 DuPont DuPont 0 0 91 91 137 137 Signifikantnými údajmi Significant data v tabuľke 2 in Table 2 sú They are údaje data pod pomerom below the ratio vyn/DuPont. Ukazujú, že gén Inv / DuPont. They show the gene GUS GUS (pDP460) (PDP460) je úspešne dodávaný is successfully delivered a and exprimovaný v expressed in bunkách, cells, ako than dokumentuje modranie buniek documents cell blueing v in ovela vyššom pomere v procese much higher in the process podlá according to vynálezu invention oproti štan- against stand- dardnému postupu standard procedure DuPont, DuPont, ktorý which používa uses podobn similarly é volfrámové é tungsten

častice, ale neošetruje ich vopred kyselinou dusičnou.but does not pre-treat them with nitric acid.

Príklad 3Example 3

V tomto príklade sa porovnáva postup podlá vynálezu s použitím perličiek vopred spracovaných kyselinou dusičnou spôsobom podlá príkladu 2, a postup podlá štandardného DuPontova protokolu s volfrámovými perličkami, ktoré nie sú vopred spracované; perličky sa pripravujú presne podlá vyššie uvedeného postupu. Tento príklad sa uskutočňuje nielen pre ilustráciu úspešného transportu do buniek, ale aj pre zistenie, či je DNA po transporte integrovaná do rastlinnej DNA a či dochádza k oddeleniu buniek nesúcich cudziu DNA. Inými slovami, či je možné nielen preniesť DNA do buniek, ale či je možné v takomto prípade úspešne vypestovať rastlinu, ktorá má v rastlinnej DNA integrovanú cudziu DNA. V tomto príklade sa používajú volfrámové perličky, vopred spracované štandardným postupom kyselinou dusičnou, a použitým rostlinným materiálom sú delohy tabaku Xanthi. Exprimovaná DNA je pDP456 [NPTII+GUS]. Plazmid pDP456 obsahuje dve rôzne rastlinné transkripčné jednotky (PTU). Prvé PTU obsahuje prekleňovacie nukleotídy s posilneným promotorom -421 až +2 z CaMV 35S s tandemovo duplikovanou oblasťou -421 až -90 [R.C. Gardner ad., Nucleic Äcid Res. 9, 2871 (1981)], fragment o 79 pároch báz Hind III-Sal I z pJIHOl, prekleňujúci 5' vedúcu sekvenciu víru tabakovej mozaiky [D.R. Gallie, D.E. Sleat, J.W. Watts, P.C. Turner, T.M.A. Wilson, Nucleic Acid Res. 15, 3257 (1987)], fragment o 1870 pároch báz z pRAJ275 prekleňujúci GUS kódujúcu sekvenciu [R. Jefferson, S. Burgess, D. Hirsh, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8447 (1986)] a fragment o 281 pároch báz obsahujúci polyadenylačné miesto génu nopalin syntásy Agrobacterium tumefaciens [M. Bevan, W.M. Barnes, M.D. Chilton, ibid, 11, 369 (1983)] v pUC18 [C. Yanisch-Perron, J. Vieira, J. Messing, Gene 33, 103 (1985)]. Druhá PTU je identická s prvou, avšak obsahuje namiesto GUS sekvencie kódujúce NPTII [R.T. Frayley a d., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A 80, 4803 (1983)]. Podlá tohoto príkladu sa pripravia in vitro štyry narastené klíčne listy Xanthi a bombardujú, ako uvedené v Tomes ad., Plánt Mol. Biol. 14, 261-268 (1990) .In this example, the process of the invention is compared using nitric acid pretreated beads according to Example 2, and the standard DuPont protocol procedure with tungsten beads that are not pretreated; the beads are prepared exactly as described above. This example is carried out not only to illustrate successful transport into cells, but also to determine whether the DNA after transport is integrated into the plant DNA and whether the cells carrying the foreign DNA are separated. In other words, whether it is not only possible to transfer the DNA into the cells, but whether, in such a case, it is possible to successfully grow a plant having integrated foreign DNA in the plant DNA. In this example, tungsten beads that have been pretreated with standard nitric acid are used, and the plant material used is Xanthi tobacco. The expressed DNA is pDP456 [NPTII + GUS]. Plasmid pDP456 contains two different plant transcriptional units (PTUs). The first PTU contains bridging nucleotides with the enhanced -421 to +2 promoter from CaMV 35S with a tandem duplicated region of -421 to -90 [R.C. Gardner et al., Nucleic Acid Res. 9, 2871 (1981)], a 79 base pair fragment of Hind III-Sal I from pJIHO1, spanning the 5 'tobacco mosaic virus leader sequence [D.R. Gallie, D.E. Sleat, J.W. Watts, P.C. Turner, T.M.A. Wilson, Nucleic Acid Res. 15, 3257 (1987)], a 1870 base pair fragment of pRAJ275 spanning the GUS coding sequence [R. Jefferson, S. Burgess, D. Hirsh, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8447 (1986)] and a 281 base pair fragment containing the polyadenylation site of the Agrobacterium tumefaciens nopaline synthase gene [M. Bevan, W.M. Barnes, M.D. Chilton, ibid., 11, 369 (1983)] in pUC18 [C. Yanisch-Perron, J. Vieira, J. Messing, Gene 33,103 (1985)]. The second PTU is identical to the first, but contains NPTII coding sequences [R.T. Frayley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 4803 (1983)]. Four grown Xanthi sprouted leaves were prepared in vitro and bombarded as described in Tomes et al., Plant Mol. Biol. 14, 261-268 (1990).

Uskutočnia sa dva nezávislé pokusy, pri ktorých sa delohy bombardujú v každom protokole mikroprojektil/DNA.Two independent experiments were carried out in which the delohas were bombarded in each microprojectile / DNA protocol.

Porovnávacie spracovanie mikroprojektil/DNA DuPont sa uskutoční podľa skôr opísaného štandardného DuPontovho protokolu. Ošetrenie podľa vynálezu sa uskutoční, ako je uvedené v predchádzajúcom príklade. Všetky vzorky DNA sa podrobia jednému bombardovaniu časticovým delom. Po spracovaní časticovým delom sa všetky spracované vzorky DNA prenesú do selekčného média, opísaného v publikácii Tomes a d.The microprojectile / DNA comparative processing of DuPont was performed according to the standard DuPont protocol described above. The treatment according to the invention is carried out as described in the previous example. All DNA samples are subjected to a single particle gun bombardment. After treatment with the particle gun, all processed DNA samples are transferred to the selection medium described in Tomes et al.

Zaznamená sa počet kolónií, získaných u každého spracovania a tabulka 3 ukazuje, že test enzýmu NPTII potvrdil stabilnú integráciu pH1456 v každej vzorke, označenú ako NPTII+. V tabulke 3 sú uvedené výsledky testov pre nezávislé trans-gény z postupu podlá vynálezu a z procesu podlá DuPontova protokolu.The number of colonies obtained for each treatment was recorded and Table 3 shows that the NPTII enzyme assay confirmed stable integration of pH1456 in each sample, designated NPTII +. Table 3 shows test results for independent transgenes from the process of the invention and the process of the DuPont protocol.

TABUĽKA 3TABLE 3

Vzorka sample DNA DNA Protokol protocol NPT. NPT. 25 ,C1 25, C1 456 456 vynález invention 4- 4 52 ,C1 52, C1 456 456 vynález invention + + 52 ,C2 52, C2 456 456 vynález invention - - 20,CI 20, C 456 456 vynález invention 4- 4 26 ,C1 26, C1 456 456 vynález invention -t- -t- 26 ,C2 26, C2 456 456 vynález invention - - 26 ,C3 26, C3 456 456 vynález invention 4· 4 · 26 ,C4 26, C4 456 456 vynález invention + + 55,CI 55, C 456 456 vynález invention 4- 4 50 ,C1 50, C1 456 456 vynález invention 4· 4 · 10 ,C1 10, C1 456 456 DuPont DuPont + + 12 ,C1 12, C1 456 456 DuPont DuPont 4 4 14 ,C1 14, C1 456 456 DuPont DuPont 4 4 14 ,C2 14, C2 456 456 DuPont DuPont 4 4 2 ,C1 2, C1 456 456 DuPont DuPont 4 4 41 ,C1 41, C1 456 456 DuPont DuPont - - 43 ,C1 43, C1 456 456 DuPont DuPont 4- 4 34 ,C1 34, C1 456 456 DuPont DuPont 4- 4 kontrola inspection — - — - — - kontrola inspection — - — - - -

Zo všetkých vzoriek, spracovaných postupom podlá vynálezu a podrobených skúmaniu, vykázalo 80 % delôh stabilne transformované kolónie. Zo všetkých vzoriek, spracovaných podlá DuPontovho protokolu DNA, vykázalo stabilne transformované kolónie 6 % delôh. Postup podlá vynálezu vykázal vyšší počet transformácií.Of all the samples processed according to the invention and examined, 80% of the deletions showed stably transformed colonies. Of all the samples treated according to the DuPont DNA protocol, 6% of the colonies showed stably transformed colonies. The process of the invention showed a higher number of transformations.

Príklad 4Example 4

Príklad 4 sa uskutoční pre potvrdenie, či spracovanie kyselinou dusičnou vedie k vzrastu transfromácie u DuPontovho protokolu v porovnaní s protokolom podlá vynálezu. Použitým materiálom je genotyp 2-122-4 (W23 x 3) embryogénnej kukuričnej suspenzie. Ako DNA sa použije pDP460. Pri spracovaní časticovým delom sa použije postup podlá vynálezu s spracovaním kyselinou dusičnou a porovná s DuPontovým protokolom miešania DNA/částice a s DuPontovým protokolom s použitím kyseliny dusičnej ako jedinej varianty. Metodika je rovnaká ako v príklade 1.Example 4 is performed to confirm whether treatment with nitric acid leads to an increase in transfection in the DuPont protocol compared to the protocol of the invention. The material used is genotype 2-122-4 (W23 x 3) of the embryogenic corn suspension. PDP460 was used as DNA. In the particle gun treatment, the nitric acid treatment of the present invention is used and compared with the DuPont DNA / particle mixing protocol and the DuPont protocol using nitric acid as the only variant. The methodology is the same as in Example 1.

V tomto príklade sa pripraví 40 vzoriek. Ošetrí sa pDP460 DNA a testuje sa 20 vzoriek pre každú metódu. Všetky testované vzorky sa podrobujú jednému bombardovaniu časticovým delom.In this example, 40 samples were prepared. PDP460 DNA is treated and 20 samples are tested for each method. All test samples are subjected to a single particle gun bombardment.

Potom sa postupuje podlá štandardného protokolu miesenia DNA/častice, opísaného v príkladu 2, a podlá protokolu DuPontovej metódy, opísanej v príklade 2. Po spracovaní časticovým dielom sa všetky vzorky prenesú do kukuričného kalusového média a udržujú v tme pri 28 'C.The standard DNA / particle mixing protocol described in Example 2 and the DuPont method protocol described in Example 2 are then followed.

Po 36 h po spracovaní sa všetky vzorky podrobia cytochemickému testu GUS. Potom sa pre obidve spracovania porovná génová expresia, vztiahnuté na počet viditeľných modro zafarbených buniek, prítomných v každej vzorke. Údaje sú zahrnuté v tabuľke 4.36 hours after processing, all samples were subjected to a GUS cytochemical assay. Then, for both treatments, the gene expression based on the number of visible blue-stained cells present in each sample is compared. Data are included in Table 4.

TABUĹKA 4TABLE 4

Jednotlivé bunky GUS VariačnýSingle GUS Cell Variation

Protokol protocol N N min. min. stred the middle max. max. koeficient coefficient originálny original DuPont DuPont 20 20 113 113 326,2 326.2 491 491 25,19 % 25,19% štandardný standard vynález invention 20 20 203 203 430,9 430.9 728 728 29,61 % 29,61% Z tabuľky From the table 4 je 4 is zrejmé, že Obviously that v tomto in this experimente boli ziste- experiment were

né štatisticky významné rozdiely (číslice označujú štatistický rozdiel s 95% konfidenciou s použitím variačnej analýzy) medzi DuPontovým protokolom a protokolom podľa vynálezu. Tieto výsledky sú v súlade so skoršími experimentami, ukazujúcimi, že predbežné spracovanie kyselinou dusičnou skutočne umožňuje oveľa vyššiu prechodovú génovú expresiu.statistically significant differences (numbers indicate a statistical difference of 95% confidence using variation analysis) between the DuPont protocol and the protocol of the invention. These results are consistent with earlier experiments showing that pretreatment with nitric acid indeed allows for much higher transient gene expression.

Claims

PATENT CLAIMS

A method of transporting biological materials into living cells by bombarding cells with particles coated with biological material and accelerated particle gun, characterized in that the particles are pretreated with strong inorganic acid and then washed prior to coating the biological material.

The process according to claim 1, wherein the inorganic acid is selected from the group consisting of nitric acid, sulfuric acid, hydrochloric acid and phosphoric acid.

3. The process of claim 2 is nitric acid. characterized by that acid, 4. The method of claim 3, characterized by that acid nitric has a concentration 0.1 to 1.0 M. 5th The method of claim 4, characterized by that acid nitric has a concentration 0.1 to 0.5 M. 6th The method of claim 1, characterized by that particles

the beads are selected from the group consisting of tungsten, palladium, platinum and gold or an alloy thereof.

Method according to claim 6, characterized in that the beads are tungsten beads.

The method of claim 6, wherein the beads have a diameter of about 0.5 to about 3.0 µτη.

The method of claim 7, wherein the particles are mixed during the pretreatment.

Method according to claim 9, characterized in that the mixing is carried out by sonication.

The method of claim 9, wherein the stirring is performed for about 5 to about 60 minutes.

The method of claim 11, wherein the stirring is performed for about 10 to about 20 minutes.

The method of claim 1, wherein the biological material is DNA.

The method of claim 1, wherein the biological material is RNA.

15. An improved method of successfully transporting DNA into living cells, characterized in that the projectile tungsten beads are pretreated with a quantity of nitric acid effective for purification, then washed, coated with DNA and accelerated into living cannon cells.

Method according to claim 15, characterized in that the beads are continuously mixed during the pretreatment.

The method of claim 16, wherein the nitric acid has a molar concentration of 0.1 to 0.5 M.

The method of claim 17, wherein the beads are mixed by sonication.