CZ232894A3

CZ232894A3 - Pretreatment of micro-projectiles prior their use in a particle gun

Info

Publication number: CZ232894A3
Application number: CZ942328A
Authority: CZ
Inventors: Dwight Tomes; Margit Ross; Leigh Bangs
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int
Priority date: 1993-01-29
Filing date: 1993-01-29
Publication date: 1995-02-15
Also published as: CA2132517A1; CA2132517C

Abstract

An improvement in the process of transporting biological materials into living cells by bombarding the cells with microprojectile particles coated with biological material. In the improved process prior to coating of the particles such as tungsten beads for example, with biological material such as DNA, the particles are first pretreated with a strong inorganic acid such as nitric acid.

Description

Preabéžné zpracování mikronroiekti iú před použitím v úásticoven dělu tib lasu technikvContinuous processing of micronroiecti prior to use in tib lasu guns

Vynalez se týká zlepšeného způsobu přenosu biologických materiálů, jako isou nukleové kyseliny, do cytoplasmy živých buněk.The invention relates to an improved method for transferring biological materials, such as nucleic acid, into the cytoplasm of living cells.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

S rychlým rozvoiem rekombinační technologie DNA jsou biologové stavěni před rozsáhlý úkol přenášet biologické látky z iedné buftkv do druhé a přenášet syntetický biologický materiál do živých buněk, abv zde mohl účinně působit. Takovýto materiál může zahrnovat biologická barviva. proteiny (protilátky nebo enzymy) a nejčastěi i genetický materiál na bázi nukleových kyselin (buď RNA nebo DNA). Většina používaných technik ie velmi pomalá a používá metody, kterými se materiál dopraví současně nanejvýš do několika buněk. V poslední doně byl vyvinut postup bombardování částicemi s použitím částicového děla, který je popsán v Sanford a d., 1987, Deliverv ofWith the rapid development of recombinant DNA technology, biologists are faced with the huge task of transferring biological agents from one cell to another, and transferring synthetic biological material to living cells to be effective. Such material may include biological dyes. proteins (antibodies or enzymes) and most often also nucleic acid-based genetic material (either RNA or DNA). Most of the techniques used are very slow and use methods by which the material is delivered at most to several cells simultaneously. In the last donation, a particle bombardment process using a particle gun has been developed as described in Sanford et al., 1987, Deliverv of

Substances Into Cells and Tissues Using A Rarticle Bombardment Process , Journal of Particíe Science and Technology 5, 27-37. na kteroužto práci se zde tímto odkazuje.Substances Into Cells and Tissues Using A Rarticle Bombardment Process, Journal of Particle Science and Technology 5, 27-37. which work is hereby incorporated herein by reference.

Dřívější vynález jednoho ze spolupůvodcu, Dwighta Tomeše, se týká zlepšeného částicového děla. které používá dělo s rýhovanou hlavní- Na popis bombardování částicovým dělem a způsobu transportu biologických materiálů, jako je DNA. do živých buněk, uvedený v patentové přihlášce Tomeše z 12.5.1989 pod číslem 07/351.075 o názvu Zlepšené částicové dělo, se zde tímto odkazuje.The earlier invention of one of the co-inventors, Dwight Tomes, relates to an improved particle gun. which uses a cannon with a knurled barrel- To describe a particle cannon bombardment and a method of transporting biological materials such as DNA. to living cells, disclosed in Tomes Patent Application of May 12, 1989 under No. 07 / 351.075 entitled Improved Particle Cannon, is hereby incorporated herein by reference.

ΛΛ

Účinnost transportu částic se samozřejmě měří schopností živých buněk, do nichž byly transportované částice vloženy, zachytávat a exprimovat biologický materiál. Ta však ovšem závisí na velmi různých podmínkách. Cím íe exprese nižší, tím méně úspěšný íe transport. Podobně čím úspěšnější je exprese živých buněk, ti. rozsah, v němž zachytávají a exprimuií transportovaný biologický materiál, tím lepší isou experimenty s insercí nukleových kyselin.The efficiency of particle transport is, of course, measured by the ability of living cells into which the transported particles have been introduced to capture and express biological material. However, this depends on very different conditions. The lower the expression, the less successful the transport. Similarly, the more successful the expression of living cells, ti. the extent to which they capture and express the transported biological material, the better are the nucleic acid insertion experiments.

V technice částicového děla se biologický materiál (například DNA) mísí s nosičem. Nosič ie obvykle tvořen v podstatě inertním materiálem ve formě malých perliček, které funguií iako mikroproiektily. Mikroproiektily maií obvykle průměr v rozmezí asi 1 až asi 4 um. Tyto perličky mohou být vyrobeny z wolframu, paladia, platiny nebo zlata nebo z jejich slitiny. Z ekonomických důvodů se dává přednost wolframu. Wolfram však obvykle neposkytuje tak dobrý nebo úspěšný transport jako zlato, pokud se neaplikuje předběžná úprava. Perličky mohou mít obvykle průměr asi 1 až asi 1,5 um.In a particle gun technique, biological material (e.g., DNA) is mixed with a carrier. The carrier is usually a substantially inert material in the form of small beads which function as microproctects. The microproiectiles typically have a diameter in the range of about 1 to about 4 µm. These beads may be made of tungsten, palladium, platinum or gold or an alloy thereof. For economic reasons, tungsten is preferred. However, tungsten usually does not provide as good or successful transport as gold unless pretreatment is applied. The beads may typically have a diameter of about 1 to about 1.5 µm.

V nejvýhodnějším procesu stvím biologického materiálu, se mísí s chloridem vápenatým lyaminu.In the most preferred process, through the biological material, it is mixed with calcium chloride lyamine.

se perličky mísí s malým množ jako je DNA nebo RNA. Produkt a přidá se určité množství pothe beads are mixed with small amounts such as DNA or RNA. The product was added and some amount was added

Tyto přísady se obvykle používají v takovýchto množstvích :These additives are generally used in the following amounts:

ul wolframových částic o koncentraci 15 až 400 mg ve 2 ml sterilní vody se umístí do sterilní 10 ml odstředivkové zkumavky a perličky se suspendují mícháním. Výhodné množství perliček ie 375 mg/2 ml. 25 ul suspendovaných wolframových perliček se umístí do Eppendorřovv zkumavky a přidá se DNA o koncentraci 1 ud/μΙ v množství pohybujícím se mezi 1 a 20 ul. výhodně 10 ul. Se směsí DNA/perličky se promíchá roztok chloridu vápenatého v množství 25/ul o koncentraci 1,0 až 4,0 M, výhodně 2,5 M.µl of 15 to 400 mg tungsten particles in 2 ml of sterile water is placed in a sterile 10 ml centrifuge tube and the beads are suspended by stirring. A preferred amount of beads is 375 mg / 2 ml. Place 25 µl of suspended tungsten beads in an Eppender tube and add 1 µl / µΙ of DNA ranging between 1 and 20 µl. Preferably 10 µl. Mix 25 µl of calcium chloride solution with the DNA / bead mixture. concentration of 1.0 to 4.0 M, preferably 2.5 M.

Přídavek spermidinu ke kombinaci biologický materiál/mikroprojekti1 byl liž použit dříve, avšak nyní bylo obecněji zjištěno, že přídavek různých polyaminů ke směsím wolframových perliček a DNA nebo RNA při přípravě mikroprojektilů významně zlepšuje rychlost transformace. Bez omezení teorií se má za to, že polyamin při tomto procesu zlepšuje dopravu biologického materiálu k buňkám zvyšováním adhese materiálů k mikroprojektilovým perličkám. Bylo zjištěno, že vhodné polvaminy zahrnuli například spermin, spermidin, kaldin, thermin a pod. Výhodný polyamin spermin se projevil jako lepší oproti dříve popsanému spermidinu. V tomto okamžiku se tedy přidává polyamin, výhodně spermin. v množství 10 μΐ a o koncentraci 0.05 až 0,5 M, výhodně 0,1 M, a směs se promíchá tyčinkou. Tato směs se nechá 10 min stát, načež se odstřeďuie 1 až 2 min při 9000 ot/min. Odstřeďování je možno použít, avšak není nutné. Směs mikroproiektilů vytvoří na dně Eppendorfovy zkumavky peletu. Před použitím se ze zkumavxy od 1í ie supernatant a konečný oblém činí 30 μΐ.The addition of spermidine to the biological material / microprojectin combination has been used previously, but it has now been found more generally that the addition of various polyamines to mixtures of tungsten beads and DNA or RNA in the preparation of microprojectiles significantly improves the transformation rate. Without being limited by theory, it is believed that polyamine in this process improves the transport of biological material to cells by increasing the adhesion of materials to microprojectile beads. Suitable polvamines have been found to include, for example, spermine, spermidine, caldine, thermin, and the like. The preferred polyamine spermine has proven superior to the previously described spermidine. Thus, at this point, a polyamine, preferably spermine, is added. in an amount of 10 μΐ and at a concentration of 0.05 to 0.5 M, preferably 0.1 M, and the mixture is mixed with a rod. The mixture is allowed to stand for 10 min and centrifuged at 9000 rpm for 1-2 min. Centrifugation may be used but is not necessary. The microproiectile mixture forms a pellet at the bottom of the Eppendorf tube. Before use, the supernatant from the test tube is 30 μΐ.

Směs DNA/perličky se před použitím krátce sonifikuje za účelem suspendování mikroproiektilů. Suspendované mikroproiektily, nesoucí biologický materiál, se přenesou na přední konec makroprojektilu mikropipetou v alikvotech po 1 až 5 ul, výhodně 1,5 ul Mezi potíže, které nastávaly v minulosti při použití mikroprojektilů, patří skutečnost, že na částice se nabalí velké hmoty DNA, což ztěžuje jejich separaci a zvyšuje pravděpodobnost, že běhen bombardování částice usmrtí buňky.The DNA / bead mixture is briefly sonicated prior to use to suspend the microproctiles. Suspended microproctiles carrying the biological material are transferred to the anterior end of the macroprojectile by micropipette in 1 to 5 µl aliquots, preferably 1.5 µl. which makes it difficult to separate and increases the likelihood that the particles will kill cells during the particle bombardment.

Jak je zřejmé, existuje trvalá potřeba vyvinout proces bombardování mikroproiektily pro zlepšenou transformaci biologických materiálů do živých buněk, při němž by buňky nebyly při bombardování usmrcovány, při němž by bylo možno používat levnější wolframové perličky a který by i při použití těchto levnějších perliček umožňoval vysoce úspěšnou transformaci a expresi. Primárním účelem vynálezu je uspokojit tuto potřebu.As is evident, there is a continuing need to develop a microproctile bombardment process to improve the transformation of biological materials into living cells, in which cells would not be killed in the bombardment, using cheaper tungsten beads, and allowing highly successful beads to be used. transformation and expression. The primary purpose of the invention is to satisfy this need.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Vynález se týká zlepšení způsobu úspěšného transportu biologických materiálů do buněk pomocí částic povlečených tímto biologickým materiálem. Výhodné částice jsou wolframové a způsob podle vynálezu umožňuje použití ekonomičtějších wolframových perliček místo zlatých. Účelu vynálezu se dosahuje zařazením předběžného zpracováni výhodných wolframových perliček silnou anorganickou kyselinou, výhodně kyselinou dusičnou .The invention relates to the improvement of a method of successfully transporting biological materials into cells by means of particles coated with the biological material. Preferred particles are tungsten and the process of the invention allows the use of more economical tungsten beads instead of gold. The purpose of the invention is achieved by including the pretreatment of the preferred tungsten beads with a strong inorganic acid, preferably nitric acid.

Podle vynálezu se před povlékáním mikroproiektilových perliček nejprve provede jejich ošetření silnou anorganickou kyselinou. Silná anorganická kyselina se volí ze skupiny zahrnující kyselinu dusičnou, kyselinu sírovou, kyselinu chlorovodíkovou a kyselinu fosforečnou nebo jejich směsi. Výhodnou kyselinou je kyselina dusičná.According to the invention, before coating the microproctile beads, they are first treated with a strong inorganic acid. The strong inorganic acid is selected from the group consisting of nitric acid, sulfuric acid, hydrochloric acid and phosphoric acid or mixtures thereof. The preferred acid is nitric acid.

Koncentrace silné anorganické kyseliny není kritická. Na spodní hranici byla úspěšně použita až 0,01 molární koncentrace a horní mez se zdá záviset pouze na ekonomické úvaze. Zvlášť přebytečná množství nejsou škodlivá vůči metalurgiiThe concentration of the strong inorganic acid is not critical. Up to 0.01 molar concentration was successfully used at the lower limit and the upper limit seems to depend solely on economic considerations. Especially excess amounts are not harmful to metallurgy

- 5 nebo povrchu perliček, ale není dúvcdu používat koncentrace nad hodnotu koncentrace dostatečné k účinnému vyčištění a předběžnému zpracování perliček. Obecně je možno za horní mez považovat praktickou hranici 1,0 molární koncentrace; výhodně bude koncentrace kyseliny v rozmezí 0,1 až asi 0,5 molární koncentrace.- 5 or the surface of the beads, but there is no need to use concentrations above the concentration sufficient to effectively clean and pre-treat the beads. In general, a practical limit of 1.0 molar concentration can be considered the upper limit; preferably the acid concentration will be in the range of 0.1 to about 0.5 molar concentration.

Dělka zpracování není kritická, ale obvykle se může pohybovat od asi 5 do asi 60 min, výhodně od asi 10 do asi 20 min. Význam doby zpracování spočívá v tom, aby byla dostatečná k úspěšnému kontaktu perliček s kyselinou dusičnou. V tomto ohledu se dostatečného kontaktu dosáhne neilépe, jestliže se perličky během předběžného zpracování míchaií- Míchání ie výhodně kontinuální a neivýhodněii se provádí sonifikací. Po sonifikací by částice, pokud byly ošetřeny kyselinou dusičnou, neměly vypadávat z kapalné suspenze, isou-li čisté- Po 20 min sonifikace zůstaly vyprané částice v suspenzi, a tak bylo stanoveno, že praní po dobu 20 min je dostatečné k úspěšnému vyčištění wolframových částic. Před praním kyselinou dusičnou wolfram okamžitě vypadával ze suspenze.The processing time is not critical, but it can usually be from about 5 to about 60 minutes, preferably from about 10 to about 20 minutes. The importance of processing time is that it is sufficient to successfully contact the beads with nitric acid. In this regard, sufficient contact is achieved best if the beads are preferably continuous during the pretreatment. The mixing is preferably continuous and, more preferably, performed by sonication. After sonication, the particles, when treated with nitric acid, should not fall out of the liquid suspension when they are clean. After 20 min of sonication, the washed particles remain in suspension, and it has been determined that washing for 20 min is sufficient to successfully clean the tungsten particles. . Before washing with nitric acid, tungsten immediately fell out of the suspension.

Přesné použité perličky nejsou kritické a proces vykazuje zřetelné výhody, jedná-li se jakékoli perličky zvolené ze skupiny zahrnující wolfram, palachům, platinu a zlato nebo jejich slitinu. Výhodně mají perličky průměr asi 1 až asiThe precise beads used are not critical and the process exhibits distinct advantages if any of the beads is selected from the group consisting of tungsten, palachos, platinum and gold or an alloy thereof. Preferably, the beads have a diameter of about 1 to about

1,5 um. Nejvýhodněiší perličky isou wolframové, poněvadž s aplikací předběžného zpracování podle vynálezu může být wolfram používán stejně účinně jako dražší kovy, jako je platina, paladium a zlato.1.5 µm. The most preferred beads are tungsten, since with the pretreatment of the invention tungsten can be used as effectively as more expensive metals such as platinum, palladium and gold.

Po předběžném zpracování podle vynálezu ie možno aplikovat různé běžné stupně. Z perliček se vymývá kyselina a vymývání se může provádět vodou, například s následujícím vymýváβ nin alkoholem, například ethanolen. Periičkv se pak suší obvyklým způsoben na vzduchu, například rychlým vakuovým sušením. Poté íe k nikroproiektilům přidáván biologický materiál, íako íe DNA, a provádí se příslušné míšení. S biologickým materiálem íe známo mísit běžné přísady, íako íe chlorid vápenatý a určité množství aminů, íako íe polyamin. Pak se bombarduíe rostlinná tkáň k uskutečnění transportu biologického materiálu do živých buněk nebo íeíich stimulace.After the pretreatment according to the invention, various conventional steps can be applied. The beads are eluted with acid and the elution may be carried out with water, for example followed by elution with alcohol, for example ethanolene. The platelets are then dried in the usual manner in air, for example by rapid vacuum drying. Subsequently, biological material, such as DNA, is added to the nicroproctiles and the appropriate mixing is performed. Conventional additives such as calcium chloride and some amines such as polyamine are known to be mixed with the biological material. The plant tissue is then bombarded to effect transport of the biological material into living cells or their stimulation.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

K osvětlení, ale nikoli k omezení vynálezu ísou uvedeny příklady. Demonstrují, že předběžné zpracování wolframu podle vynálezu íe účinněíší než u zlatých perliček.Examples are provided to illustrate but not limit the invention. They demonstrate that the pretreatment of tungsten according to the invention is more effective than that of gold beads.

Příklad 1Example 1

V tomto příkladu se v částicovém dělu zkouší wolfram a zlato po použití kyseliny dusičné k vyčištění povrchu částic íako prostředku ke snížení flokuláce a zvvšeni vazby DNA.In this example, in a particle gun, tungsten and gold are tested after using nitric acid to clean the surface of the particles as a means to reduce flocculation and increase DNA binding.

Účelem íe zhodnotit účinek čištění kyselinou dusičnou na wolframové a zlaté částice před íeíich sušením rychlým vakuem. Porovnávali se se standardní kontrolou.The purpose is to evaluate the effect of nitric acid purification on tungsten and gold particles prior to rapid vacuum drying. They were compared to a standard control.

Jako genotypový materiál se použiíe suspenze zárodečné kukuřičné DNA. Kukuřičné suspenzní médium obsahuíe soli podle Murashigeho a Skooga, viz A Revised Method for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures, Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962), s přídavkem 2,0 mg/1 2,4-D. což íe kyselina 2.4-dichlorfenoxyoctová, a 3 % sacharosy. Navíc médium obsahuíe kukuřičné kalusové médium, popsané takto^; AT soli s 700 mq/1 prolinu, 0,75 mg/1 2,4-D, 3 % sacharosy, viz To7 nes, D., Cell Culture, Somatic Embrvouenesís and Plant Reaeneration in Maize, Rice. Sorghum, and Millets, Cerea i Tissue and Cell Culture, Nijnofí and Junk, Amsterdam, 1985.Germ maize DNA suspensions are used as genotypic material. Corn suspension medium containing salt according to Murashige and Skoog, see A Revised Method for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures, Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962), with the addition of 2.0 mg / l 2,4-D. 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, and 3% sucrose. In addition, the medium comprises corn callus medium described as follows ^; AT salts with 700 mq / l proline, 0.75 mg / l 2,4-D, 3% sucrose, see To7 nes, D. Cell Culture, Somatic Embrvouenesis and Plant Reaeneration in Maize, Rice. Sorghum and Millets, Cerea and Tissue and Cell Culture, Nijnofi and Junk, Amsterdam, 1985.

Částicové dělo se používá stejné, jaké je popsáno v citované Tomešově přihlášce. Perličky se použiji' wolframové 1,8 μη od GTE, wolframové 1,2 pm od GE, zlaté (bez vloček! od Engelhard Industries a používá se 25 mg tkáně na potah. Provádí se předběžné zpracování mannitolen pres noc a jedno bombardování na vzorek s použitím pDP460 DNA, která obsahuje gen GUS. pDP460 je popsán dále v příkladu 2.The particle gun is used as described in the cited Tomes application. The beads are tungsten 1.8 μη from GTE, tungsten 1.2 µm from GE, gold (flake-free! From Engelhard Industries) and 25 mg of tissue per coating are used. using pDP460 DNA that contains the GUS gene, pDP460 is described in Example 2 below.

Bombardování probíhá takto: Suspensní buňky se používají leden den po subkultivaci, prosívají přes síto 710 um a resuspendují v kukuřičném suspensnin médiu + 0,25 M mannitolu v koncentraci 50 mg/ml (1 g tkáně ve 20 ml média). Pak se směs třepe pres noc na třepačce. K přípravě pro částicové dělo se 0,5ml alikvoty napipetují na střed dvojité vrstvy filtračního papíru Vhatman typ 617, na něíž bylo přidáno 1 ml kukuřičného suspensního média +· 0,25 M mannitolu. Buňky se shromáždí ve středu každé destičky k maximalizaci účinku bombardování .Bombardment proceeds as follows: Suspension cells are used January the day after subculturing, sieved through a 710 µm sieve and resuspended in corn suspension medium + 0.25 M mannitol at a concentration of 50 mg / ml (1 g tissue in 20 ml medium). The mixture was shaken overnight on a shaker. To prepare for the particle gun, 0.5 ml aliquots were pipetted to the center of a double layer Vhatman type 617 filter paper to which 1 ml corn suspension medium + 0.25 M mannitol was added. Cells are collected at the center of each plate to maximize the bombardment effect.

Pro veškeré zpracování částic se použije šestinásobné opakování včetně šestinásobného opakování standardní pozitivní kontroly. Celkem se použije 26 vzorků. Doplní se dvě nezávislá opakování experimentu.Six-fold repeats, including six-fold standard positive control, are used for all particle processing. A total of 26 samples were used. Two independent replicates of the experiment were added.

K vyčištění wolframových a zlatých částic se naváží '375 mg částic ve 2 ml 0,1 M kyseliny dusičné. Pak se provádí 20 min sonifikace na ledu s použitím sonifikátoru nastaveného na minimum, udržující částice v suspenzi. Pak se částice promvjí dvakrát sterilní deionizovanou vodou; při konečném promývání se nahradí 1 ml 95¾ EtOH. Nato se provede rychlé sušení ve vakuu.To clean the tungsten and gold particles, weigh 375 mg of the particles in 2 ml of 0.1 M nitric acid. Thereafter, sonication is carried out on ice for 20 min using the sonication set to the minimum, keeping the particles in suspension. The particles are then washed twice with sterile deionized water; at the final wash replace 1 ml of 95¾ EtOH. A rapid vacuum drying is then carried out.

Všechnv vzorky se podrobí jednomu bombardování částicovým dělem.All samples are subjected to a single particle gun bombardment.

Po zpracování částicovým dělem se vrchní filtrační papír z každého vzorku přenese do kukuřičného kalusového média. Buňky se inkubují 48 h v temnu při 28 °C a pak se zjistuje přechodná aktivita GUS.After treatment with the particle gun, the top filter paper from each sample is transferred to corn callus medium. Cells are incubated for 48 h in the dark at 28 ° C and then transient GUS activity is detected.

Po 48 h po zpracování se vzorky použijí k cytochenickému testu GUS. Na základě přechodné aktivity GUS se porovnávají typy částic, čištění částic a zdroje částic.48 hours after processing, the samples are used for the GUS cytochenic assay. Based on transient GUS activity, particle types, particle cleaning, and particle sources are compared.

Analýzou odchylek byly zjištěny významné rozdíly mezi typy mikroprojektilu (zlato, wolfram) a mezi provedením čištěním mikroprojektilfi v tomto pokusu, avšak nebyla nalezena statisticky významná interakce mezi těmito proměnnými. S použitím t-testu k oddělené analýze jednotlivých typů a zpracování mikroprojektilfi byla nalezena jediná sinnifikance u wolframu GTE. Tento výsledek byl očekáván, poněvadž existoval velký rozdíl ve výsledcích u wolframu GTE oproti GE. Po zpracování kyselinou dusičnou jsou výsledky u obou typů wolframu téměř stejné.Analysis of variation revealed significant differences between the microprojectile types (gold, tungsten) and the microprojectile purification performed in this experiment, but no statistically significant interaction between these variables was found. Using a t-test to separately analyze individual types and process microprojectiles, a single sinnification was found in tungsten GTE. This result was expected because there was a large difference in the results of GTE tungsten compared to GE. After treatment with nitric acid, the results for both types of tungsten are almost the same.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.The results are shown in Table 1.

Tabulka 1. Cytochemická analýza β-glukuronidasy na přechodnou expresi genu dokončenou po 36 h po zpracováníTable 1. Cytochemical analysis of β-glucuronidase for transient gene expression completed 36 h after processing

Genotyp: 54-68-5, kukuřičná embryooenní suspenzeGenotype: 54-68-5, maize embryo suspension

DNA= _PPHI460DNA = _P PH1460

Jedno bombardování na vzorek skupiny buněk GUSOne bombardment per sample of GUS cell group

typ částice particle type zpracování částice processing particles DNA DNA N N min min střed center max max wolfram GE tungsten GE EtOH EtOH 460 460 12 12 29 29 137 137 342 342 wolfram GE tungsten GE kys. dusičná nitric acid 460 460 12 12 62 62 217 217 460 460 wolfram GTE tungsten GTE EtOH EtOH 460 460 11 11 3 3 81 81 169 169 wolfram GTE tungsten GTE kys. dusičná nitric acid 460 460 12 12 39 39 187 187 440 440 váha = 0,023 weight = 0.023 nevíočkové zlato nevíočkové zlato EtOH EtOH 460 460 12 12 4 4 53 53 122 122 neví očkové zlato does not know the seed gold kys. dusičná nitric acid 460 460 12 12 8 8 100 100 ALIGN! 259 259

váha = 0,119weight = 0.119

Váha zpracování částice uvnitř jednoho typu částice se zjišťuje na malém vzorku pomocí t-statistiky.The processing weight of a particle within one particle type is determined on a small sample using t-statistics.

Z údajů v tabulce 1 vyplývá, že první čistění povrchu vo1frámových částic je účinným prostředkem snížení flokulace a zvýšení vazby DNA v porovnání s použitím částic neošetrených kyselinou dusičnou oproti zlatým ošetřeným nebo neošetrenym částicím.The data in Table 1 shows that the first cleaning of the surface of the framed particles is an effective means of reducing flocculation and increasing DNA binding compared to the use of untreated particles compared to gold treated or untreated particles.

Příklad 2Example 2

V tomto příkladu se způsob podle vynálezu s použitím wolframu, předem ošetřeného kyselinou dusičnou, porovnává s wolframovými perličkami neošetřenými kyselinou dusičnou. Porovnává se rovněž s bombardováním buněk s použitím wolframových mikroprojektilů neošetřených kyselinou dusičnou v částicovém dělu s použitím standardního protokolu, doporučeného a veřejně publikovaného íou DuPont. Publikovaný protokol fy DuPont zní :In this example, the method of the invention using tungsten pretreated with nitric acid is compared with tungsten beads not treated with nitric acid. It is also compared to cell bombardment using non-nitric acid-treated tungsten microprojectiles in a particle gun using a standard protocol recommended and publicly published by DuPont. DuPont's published protocol is:

Navážit. 60 mg částic a suspendovat v 1 ml 100¾ ethanolu Sonifikovat. Odstřeďovat lmin při 10000 min^-1. Slít supernatant ethanolu a nahradit 1 ml sterilní deionizované vody. So nifikovat. Odstreďovat 1 min při 10000 min^-1. Po konečném promyti resuspendovat v 1 ml deionizované vody. Uchovávat v mrazničce. Po přípravě DNA je možno dokončit povlékání čás t ic.Weigh. 60 mg particles and suspend in 1 ml 100¾ ethanol Sonify. Centrifuge at 10000 rpm for lmin ^-1. Decant the ethanol supernatant and replace with 1 ml sterile deionized water. So nifikovat. Centrifuge at 10000 rpm for ¹ min. After the final wash, resuspend in 1 ml deionized water. Store in a freezer. After the DNA has been prepared, the coating of the particles can be completed.

Připravit v malých alikvotech v mikrozkumavkách částice povlečené DNA (každý alikvot má vystačit na tri bombardování). Současně je možno připravit více aiikvotú. Pro každý alikvot umístit 25 ul promytvch částic (zajistit úpLné resus pendování) do mikrozkumavky, pak postupně přidat: 2,5 jul DNA (1 pg/pl) a pětkrát promíchat tyčinkou; 25 jjI 2,5 CaClz a pětkrát promíchat tyčinkou a 10 pl spermidinu (0,1 M volná báze) a pětkrát promíchat tyčinkou. Ponechat asi 10 min stát Odstreďovat 3 min a odstranit 40 až 50 ul supernatantu (tím se zakoncentruji částice a zbyde právě dostatečné množství pro 3 bombardování). Pro všechnv zbylé alikvoty opakovat ten to postup.Prepare particles coated with DNA in small aliquots in microtubes (each aliquot should suffice for three bombardments). Multiple aliquots may be prepared simultaneously. For each aliquot, place 25 µl of washed particles (ensure complete resuspension) into the microtube, then sequentially add: 2.5 µl DNA (1 µg / µl) and mix five times with a stick; 25 µl 2.5 CaCl 2 and mix five times with the stick and 10 µl spermidine (0.1 M free base) and mix five times with the stick. Allow to stand for about 10 minutes. Centrifuge for 3 minutes and remove 40 to 50 µl of supernatant (this will concentrate the particles and leave just enough for 3 bombardments). Repeat the procedure for all the remaining aliquots.

V tomto příkladu se DuPontův protokol porovnává s proto kolem podle vynálezu, kde se wolframové částice 1,8 pm připraví podle tohoto postupu:In this example, the DuPont protocol is compared to the inventive wheel, where 1.8 µm tungsten particles are prepared according to the following procedure:

Navážit 375 mg l,8pm wolframových částic a suspendovat ve 2 ml 0,IM kyseliny dusičné. Sonifikovat 20 min na ledu. Odstreďovat 1 min při 10000 min^-1 a odstranit kyselinu dusič nou. Přidat 2 ml sterilní deionizované vody, krátce sonifiko vat a pak odstředit, přidat znovu vodu a dvakrát promýt. Vod ný supernacant slit a přidat 2 ml 100% ethanolu. Resuspendovat částice sonifikací a po každé sonlfikaci odebrat 25pl alikvot. Aiikvoty umístit do jednotlivých Eppendortových zkumavek. Suspenzi wolfram/ethanol rychle vysušit ve vakuu. Částice uchovávat přikryté při teplotě místnosti.Weigh 375 mg of 1.8 µm tungsten particles and suspend in 2 ml of 0.1 M nitric acid. Sonify for 20 min on ice. Be centrifuged 1 min at 10,000 min ^-1 and remove nitric acid Nou. Add 2 ml of sterile deionized water, sonicate briefly and then centrifuge, add water again and wash twice. The aqueous supernacant was decanted and added with 2 ml of 100% ethanol. Resuspend the particles by sonication and remove a 25 µl aliquot after each sonication. Place aliquots in individual Eppendort tubes. Dry the tungsten / ethanol suspension rapidly in vacuo. Keep the particles covered at room temperature.

Srážení woifram/DNA metodou Pioneer se provádí takto^:přidat 10 jul <1 ug/jul) DNA k wolframu, rychle vysušenému ve vakuu, promíchat pipetou. K suspenzi wolfram/DNA přidat 25 μΐ 2,5M CaCÍ2, promíchat pipetou. K suspenzi wolfram/DNA/CaCl přidat 10 jul 0,1M sperminu, promíchat tyčinkou. Nechat suspenzi stát 15 min při teplotě místnosti a pak odebrat 15 μΐ supernatantu. Sonifikovat suspenzi a pak odebrat l,5ul alikvoty na makroprojektily.The Pioneer woifram / DNA precipitation is performed as follows ^: add 10 µl <1 µg / µl) of DNA to the tungsten, rapidly dried under vacuum, by pipette. Add 25 μΐ 2.5M CaCl2 to the tungsten / DNA suspension, mix by pipette. To the tungsten / DNA / CaCl suspension add 10 µl of 0.1M sperm, mix with a stick. Allow the suspension to stand at room temperature for 15 min and then collect 15 μΐ of the supernatant. Sonify the suspension and then take 1.5 µl aliquots for macroprojectiles.

Použije se embryogenni kukuřičná suspenze 2-122-4 (W23 x B73). Kultivační médium a postup bombardování je stejný iako v příkladu 1.Embryogenic maize suspension 2-122-4 (W23 x B73) is used. The culture medium and the bombardment procedure are the same as in Example 1.

Z částicovvch preparátů, připravených jednotlivými metodami v den 1. se v den 1, 2. 3. 4 a 5 postupně odebírají vzorky s použitím částic v den 1- Každý den se odpovídajícími postupy provádí míchání DNA/částice. Pro každou sadu v tomto příkladu se zhotoví šestnáct vzorků. Na čtrnáct z nich se působí pDP460 DNA. Plasmid pDP460 obsahuje překlenovací nukleotidy s posíleným promotorem -421 až -*-2 z CaMV 35S [R.C. a d. , Nuc+leic· Tle i d Res. 9, 2871 (1981)1, fragment o 79 párech bází Hind III-Sal I z pJIHOl, překienující 5' vedoucí sekvenci viru tabákové mozaiky [D.R. Gallie, D.E. Sleat, J.W. Watts, P.C. Turner, T.M.A. Wilson, Nucleic l\c id Res. 15, '3257 (1987)1, fragment o 579 párech bází překienující první intron z kukuřičného Adhl-S [E.S. Dennis a d., ibid. 12, 3983 (1984)1, fragment o 1870 párech bází z pRAJ275 překienujícíThe particulate preparations prepared by the individual methods on day 1 are sequentially sampled on day 1, 2, 3, 4, and 5 using the particles on day 1-. DNA / particle mixing is performed each day by appropriate procedures. Sixteen samples are made for each set in this example. Fourteen of them were treated with pDP460 DNA. Plasmid pDP460 contains bridging nucleotides with the enhanced -421 to - * - 2 promoter from CaMV 35S [R.C. and d., Nuc + leic · Tle i d Res. 9, 2871 (1981) 1, a 79 base pair Hind III-Sal I fragment of pJIHO1, spanning the 5 'leader sequence of the tobacco mosaic virus [D.R. Gallie, D.E. Sleat, J.W. Watts, P.C. Turner, T.M.A. Wilson, Nucleic Acid Res. 15, 3257 (1987) 1, a 579 base pair fragment spanning the first intron of maize Adhl-S [E.S. Dennis et al., Ibid. 12, 3983 (1984) 1, a 1870 base pair fragment of pRAJ275 overlapping

GUS kódující sekvenci [R. Jefferson, S. Burqess, D. Hirsh, Proč. Nati. Acad. Sc i . U.S.A. 83, 8447 (1986)] a fragment o 281 párech bází obsahující polyadenylační místo menu nopalin synthasy z Acrrohacteriuia tunefáciens [M. Bevan, W.M. Barnes, M.D. Chilton, Science II, 369 (1983)] v pUC18 [C. Yanisch - Perron. J. Vieira, J. Messing, Gene 33. 103 (1985)]- Zbývající dva vzorky představují neošetrené kontroly. Všechny ošetřené vzorky byly podrobeny jednomu bombardování částicovým dělem. Bezprostředně po bombardování byly vzorky přeneseny do kukuřičného suspenzního média a udržovány 36 h v temnu při 28 °C.GUS coding sequence [R. Jefferson, S. Burqess, D. Hirsh, Proc. Nati. Acad. Sc i. U.S.A. 83, 8447 (1986)] and a 281 base pair fragment containing the polyadenylation site of the nopaline synthase menu from Acrrohacteriuia tunefaciens [M. Bevan, W.M. Barnes, M.D. Chilton, Science II, 369 (1983)] in pUC18 [C. Yanisch-Perron. J. Vieira, J. Messing, Gene 33. 103 (1985)] - The remaining two samples represent untreated controls. All treated samples were subjected to a single particle gun bombardment. Immediately after the bombardment, samples were transferred to the maize suspension medium and kept at 28 ° C in the dark for 36 h.

Po 36 h po ošetření byly vzorky podrobeny cytochemickemu testu na GUS- Byly zaznamenány jednotlivé buňky, které reagují pozitivně na GUS jak v případě vynálezu, tak v případe protokolu DuPont. Celkově byla genová exprese pro každé ošetření v každém dni porovnána stanovením poměru mezi postupem podle vynálezu a DuPontovým protokolem, přičemž DuPontílv protokol nevykazuje předběžné ošetření kyselinou dusičnou. Výsledky isou uvedeny v tabulce 2.36 hours after treatment, the samples were subjected to a cytochemical GUS assay. Individual cells that respond positively to GUS were recorded for both the invention and the DuPont protocol. Overall, gene expression for each treatment was compared on each day by determining the ratio between the process of the invention and the DuPont protocol, whereas the DuPont protocol did not show nitric acid pretreatment. The results are shown in Table 2.

- 13 Tabulka 2 ošetření jednotlivé buňky GUS poměr- 13 Table 2 single cell treatment GUS ratio

den day N N protokol protocol min min střed center max max vyn/DuPont vyn / DuPont 1 1 7 7 vynález invention 339 339 452 452 572 572 1,7=1,0 1.7 = 1.0 7 7 DuPont DuPont 173 173 274 274 319 319 2 2 7 7 vynález invention 207 207 258 258 292 292 1,8--1,0 1,8--1,0 7 7 DuPont DuPont 84 84 146 146 180 180 3 3 7 7 vynález invention 148 148 211 211 301 301 2,9:1,0 2.9: 1.0 7 7 DuPont DuPont 4 4 73 73 100 100 ALIGN! 4 4 7 7 vynález invention 228 228 380 380 485 485 3,5:1,0 3.5: 1.0 7 7 DuPont DuPont 8 8 110 110 194 194 5 5 7 7 vynález invention 62 62 217 217 389 389 2,4:1,0 2.4: 1.0 7 7 DuPont DuPont 0 0 91 91 137 137 Siunií ikant Siunií ikant .nimi daty v .nimi data in tabule sheet e 2 js e 2 js ou údaje ou data pod poměřen below measured

vyn/DuPont. Ukazují, že gen GUS (pDP4601 je úspěšné dodáván a exprinován v buňkách, jak dokumentuje modrání buněk v mnohem vyšším poměru v procesu podle vynálezu oproti standardnímu postupu OuPont, který používá podobné volfranové částice, ale neošetřuie je předem kyselinou dusičnou.vyn / DuPont. They show that the GUS gene (pDP4601) is successfully delivered and expressed in cells, as evidenced by cell blueing at a much higher rate in the process of the invention compared to the standard OuPont procedure which uses similar volfran particles, but the non-treatment is pre-nitric acid.

Příklad 3Example 3

V tomto příkladu se porovnává postup podle vynálezu s použitím perliček předem ošetřených kyselinou dusičnou způsobem podle příkladu 2, a postup podle standardního DuPontova protokolu s wolframovými perličkami, které nejsou předem ošetřeny; perličky se připravují přesně podle výše uvedeného postupu. Tento příklad se provádí nejen k ilustraci úspěšného transportu do buněk, ale i ke zjištění, zda je DNA po transportu integrována do rostlinné DNA a zda dochází k oddělení buněk nesoucích cizí DNA. Jinými slovy, zda lze nejen přenést DNA do buněk, ale zda lze v takovém případě úspěšně vypěsto14 vat rostlinu, která má v rostlinné DNA integrovánu cizí DNA. V tomto příkladu se používají wolframové perličky, předem ošetřené standardním postupem kyselinou dusičnou, a použitým rostlinným materiálem jsou dělohy tabáku Xanthi. Exprimovaná DNA ie pDP456 CNPTII+GUS3. Plasmid pDP456 obsahuje dvě různé rostlinné transkripční jednotky (PTU). První PTU obsahuje překlenovací nukleotidy s posíleným promotorem -421 až +2 z CaMV 35S s tandemově duplikovanou oblastí -421 až -90 [R.C. Gardner a d. , Nucleic Ucid Res. 9, 2871 <1981)3, fragment o 79 párech bází Hind III-Sal I z pJIHOl, překlenující 5' vedoucí sekvenci viru tabákové mozaiky [D.R. Gallie, D.E. Sleat, J.W. Watts, P.C. Turner, T.M.A. Wilson, Nucleic Acid Res. 15, 3257 (1987)3, fragment o 1870 párech bází z pRAJ275 překlenující GUS kódující sekvenci [R. Jefferson, S. Burgess D. Hirsh, Proč. Necti . Ac<ad. Sc i . U.S.A. 83. 3447 <1986)3 a fragment o 281 párech bází obsahující polyadenylační místo genu nopalin synthasy Agrobacterium tusiefaciens CM. Bevan, W.M. Barnes, M.D. Chilton, ibid, 11, 369 (1983)3 v _PUC18 CC. Yanisch-Perron, J. Vieira, J. Messing, Gene 33, 103 <1985)3. Druhá PTU je identická s první, avšak obsahuje namísto GUS sekvenci kódující NPTII CR-T. Erayley a d., Proč . Nati. Acad Sc i . U.S.A 80, 4803 <1983)3- Podle tohoto príklacu se připra ví in vitro čtyři vzrostlé dělohy Xanthi a bombardují, jak uvedeno v Tomeš a d., Plant Hol. Biol. 14, 261-268 (1990).In this example, the process of the invention is compared using nitric acid pretreated beads according to the method of Example 2, and the standard DuPont protocol procedure with tungsten beads that are not pretreated; the beads are prepared exactly as described above. This example is carried out not only to illustrate successful transport into cells, but also to determine whether DNA, after transport, is integrated into plant DNA and whether cells carrying foreign DNA are separated. In other words, whether not only can DNA be transferred to cells, but whether, in such a case, a plant that has foreign DNA integrated in the plant DNA can be successfully grown. In this example, tungsten beads pretreated with standard nitric acid are used, and the plant material used is Xanthi uterus. The expressed DNA is pDP456 CNPTII + GUS3. Plasmid pDP456 contains two different plant transcriptional units (PTUs). The first PTU contains bridging nucleotides with the enhanced -421 to +2 promoter of CaMV 35S with a tandem duplicated region of -421 to -90 [RC Gardner et al., Nucleic Ucid Res. 9, 2871 (1981) 3, a Hind III-Sal I fragment of pJIHO1, 79 bp spanning the 5 'leader sequence of tobacco mosaic virus [DR Gallie, DE Sleat, JW Watts, PC Turner, TMA Wilson, Nucleic Acid Res. 15, 3257 (1987) 3, a 1870 base pair fragment of pRAJ275 spanning the GUS coding sequence [R. Jefferson, S. Burgess, D. Hirsh, Proc. Necti. Ac <ad. Sc i. USA 83, 3447 (1986) 3 and a 281 base pair fragment containing the polyadenylation site of the Agrobacterium tusiefaciens CM nopaline synthase gene. Bevan, WM Barnes, MD Chilton, ibid., 11, 369 (1983) 3 in _P UC18 CC. Yanisch-Perron, J. Vieira, J. Messing, Gene 33, 103 (1985) 3. The second PTU is identical to the first, but contains the NPTII CR-T coding sequence instead of the GUS. Erayley et al., Proc. Nati. Acad Sc i. USA 80, 4803 (1983) 3- According to this example, four mature Xanthi uteri are prepared in vitro and bombed, as described in Tomes et al., Plant Hol. Biol. 14, 261-268 (1990).

Provedou se dva nezávislé pokusy, při nichž se dělohy bombardují v každém protokolu mikroprojekti1/DNA.Two independent experiments were performed in which the uteri were bombarded in each microproject / DNA protocol.

Porovnávací ošetření mikroprojekti1/DNA DuPont se prová dějí podle dříve popsaného standardního DuPontova protokolu. Ošetření podle vynálezu se provádí, jak uvedeno v předchozím příkladu. Všechny vzorky DNA se podrobí jednomu bombardování částicovým dělem. Po zpracování částicovým dělem se všechny ošetřené vzorky DNA přenesou do selekčního raedia, popsaného v publikaci Toneš a d.DuPont microprojection / DNA comparative treatments are performed according to the previously described standard DuPont protocol. The treatment according to the invention is carried out as described in the previous example. All DNA samples are subjected to a single particle gun bombardment. After treatment with the particle gun, all the treated DNA samples are transferred to the selection media described in Tonones et al.

Zaznamená se počet kolonií, získaných u každého ošetření, a tabulka 3 ukazuje, že testy enzymu NPTII potvrdil stabilní integraci pH1456 v každém vzorku, označenou jako NPTII-»-. V tabulce 3 jsou uvedeny výsledky testů pro nezávislé trans-geny z postupu podle vynálezu a z procesu podle DuPontova protokolu.The number of colonies obtained for each treatment is recorded and Table 3 shows that the NPTII enzyme assays confirmed stable integration of pH1456 in each sample, designated NPTII - »-. Table 3 shows test results for independent transgenes from the process of the invention and from the DuPont protocol process.

Tabulka 3Table 3

vzorek sample DNA DNA protokol protocol NPTII NPTII 25, Cl 25, Cl 456 456 vynález invention 4- 4- 52, Cl 52, Cl 456 456 vynález invention 4- 4- 52, C2 52, C2 456 456 vynález invention - - 20, Cl 20, Cl 456 456 vynález invention 4- 4- 26, Cl 26, Cl 456 456 vynález invention 4- 4- 26, C2 26, C2 456 456 vynález invention - - 26, C3 26, C3 456 456 vynalez invention 4- 4- 26, C4 26, C4 456 456 vynález invention 4- 4- 55, Cl 55, Cl 456 456 vynález invention 4- 4- 50 , Cl 50, Cl 456 456 vynález invention 4- 4- 10.Cl 10.Cl 456 456 DuPont DuPont 4» 4 » 12.Cl 12.Cl 456 456 DuPont DuPont 4- 4- 14, Cl 14, Cl 456 456 DuPont DuPont 4- 4- 14, C2 14, C2 456 456 DuPont DuPont 4- 4- 2, Cl 2, Cl 456 456 DuPont DuPont 4- 4- 41,Cl 41, Cl 456 456 DuPont DuPont - - 43, Cl 43, Cl 456 456 DuPont DuPont 4- 4- 34, Cl 34, Cl 456 456 DuPont DuPont 4- 4- kontrola control — - — - - - kontrola control — - — - - -

Ze všech vzorků, ošetřených postupem podle vynálezu a podrobených zkoumání, vykázala 80 % děloh stabilně transformované kolonie. Ze všech vzorků, ošetřených podle DuPontova protokolu DNA, vykázalo stabilně transformované kolonie 6 % děloh. Postup podle vynálezu vykázal vyšší počet transformac i .Of all the samples treated according to the invention and examined, 80% of the uteri showed stable transformed colonies. Of all samples treated according to the DuPont DNA protocol, 6% of the uteri showed stable transformed colonies. The process according to the invention showed a higher number of transformations.

Příklad 4Example 4

Příklad 4 se provádí k potvrzení, zda ošetření kyselinou dusičnou vede ke vzrůstu transfromace u DuPontova protokolu ve srovnání s protokolem podle vynálezu. Použitým materiálem Ie genotyp 2-122-4 CV23 x 3) embryogenní kukuřičné suspenze. Jako DNA se použije pDP460. Při ošetření částicovým dělem se použilo postup podle vynálezu s ošetřením kyselinou dusičnou a porovná s DuPontovým protokolem míšení DNA/částice a s DuPontovým protokolem s použitím kyseliny dusičné iako jediné varianty. Metodika je stejná jako v příkladu 1.Example 4 is performed to confirm whether treatment with nitric acid leads to an increase in transfection in the DuPont protocol compared to the protocol of the invention. The material used was genotype 2-122-4 CV23 x 3) embryogenic corn suspensions. PDP460 was used as DNA. In the particle gun treatment, the process of the present invention was used with nitric acid treatment and compared to the DuPont protocol of DNA / particle mixing and the DuPont protocol using nitric acid as a single variant. The methodology is the same as in Example 1.

V tomto příkladu se připraví 40 vzorků. Ošetří se pDP460 DNA a testuje se 20 vzorků pro každou metodu. Všechny testované vzorky se podrobují jednomu bombardování částicovým dělem.In this example, 40 samples were prepared. PDP460 DNA is treated and 20 samples are tested for each method. All test samples are subjected to a single particle gun bombardment.

Pak se postupuje podle standardního protokolu míšení DNA/částice, popsaného v příkladu 2, a podle protokolu DuPontovy metody, popsané v přikladu 2. Po ošetření částicovým dělem se všechny vzorky přenesou do kukuřičného kalusového média a udržují v temnu při 28 °C.The standard DNA / particle mixing protocol described in Example 2 and the DuPont method protocol described in Example 2 are then followed. After treatment with the particle gun, all samples are transferred to corn callus medium and kept in the dark at 28 ° C.

Po 36 h po zpracování se všechny vzorky podrobí cytochemickému testu GUS. Poté se pro obě ošetření porovná genová exprese, vztaženo na počet viditelných modře zbarvených bu1736 hours after processing, all samples are subjected to a GUS cytochemical assay. Gene expression is then compared for both treatments based on the number of visible blue-stained bu17s

něk, přítomných v 4. some, present in 4. každém vzorku. Údaje of each sample. Data jsou are shrnuty v tabulce summarized in the table Tabulka 4 Table 4 jednotlivé buňky single cells GUS GUS variační variational protokol protocol N N min min střed center max max koef icient coefficient originální original DuPont DuPont 20 20 May 113 113 326,2 326.2 491 491 25,19 % 25,19% standardní standard vynález invention 20 20 May 203 203 430,9 430.9 728 728 29,61 % 29,61% Z tabulky 4 From Table 4 je Yippee zřejmé, apparently, že v tomto that in this experimentu byly zjis- experiment were

těny statisticky významné rozdíly (cifry označují statistický rozdíl s 95% konfidencí s použitím variační analýzy) mezi DuPontovým protokolem a protokolem podle vynálezu. Tyto výsledky jsou v souladu s dřívějšími experimenty, ukazujícími, že předběžné zpracování kyselinou dusičnou skutečně umožňuje mnohem vyšš í přechodnou genovou expres i.The statistically significant differences (digits indicate the statistical difference with 95% confidence using variation analysis) between the DuPont protocol and the protocol of the invention. These results are consistent with earlier experiments showing that pretreatment with nitric acid indeed allows for much higher transient gene expression.

Claims

PATENTOVÉ

Claims

A method of transporting biological materials into living cells by bombarding cells with particles coated with biological material and accelerated particle gun, characterized in that the particles are pretreated with strong inorganic acid and then washed prior to coating with biological material.

The method of claim 1, wherein the inorganic acid is selected from the group consisting of nitric acid, sulfuric acid, hydrochloric acid, and phosphoric acid.

3. The process of claim 2 wherein the acid is nitric acid.

The method of claim 3, wherein the nitric acid has a concentration of 0.1 to 1.0 M.

The method of claim 4, wherein the nitric acid has a concentration of 0.1 to 0.5 M.

The method of claim 1, wherein the particles are beads selected from the group consisting of tungsten, palladium, platinum and gold or an alloy thereof.

The method of claim 6, wherein the beads are tungsten beads.

The method of claim 6, wherein the beads have a diameter of about 0.5 to about 3.0 µm.

The method of claim 7, wherein the particles are agitated during the pretreatment

The method of claim 9, wherein the method is performed by sonication.

The method of claim 9, wherein the process is carried out for a period of about 5 to about 5 to about 10 to about 10 to about 10 to about 12

The method of claim 11, wherein the stirring is performed for about 10

13. The method of claim 1, wherein the material is DNA.

characterized in that it stirs for about 60 minutes, characterized in that it is fried for about 20 minutes.

characterized in that the biolo

The method of claim 1, the gic material is RNA.

characterized in that the biolo

15. An improved method of successfully transporting DNA into living cells, characterized in that the illi project of frame beads is pretreated with a quantity of nitric acid effective for purification, then washed, coated with DNA and accelerated into living target cells.

The method of claim 15, wherein the beads are continuously stirred during the pretreatment.

17. The method of claim 16 wherein the nitric acid has a molar concentration of 0.1 to 0.5 M.

The method of claim 17, wherein the beads are mixed by sonication.