SK103594A3 - Hepatitis "c" virus peptides - Google Patents
Hepatitis "c" virus peptides Download PDFInfo
- Publication number
- SK103594A3 SK103594A3 SK1035-94A SK103594A SK103594A3 SK 103594 A3 SK103594 A3 SK 103594A3 SK 103594 A SK103594 A SK 103594A SK 103594 A3 SK103594 A3 SK 103594A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- peptide
- seq
- dna sequence
- antibody
- hcv
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 139
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 35
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 8
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title description 5
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 22
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 34
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 34
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 13
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 8
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 8
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 6
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 claims description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 5
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 5
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 4
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical group CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical group CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims description 2
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 2
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004474 valine Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 claims 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims 1
- ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N zinc nitrate Chemical group [Zn+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 2
- 206010019786 Hepatitis non-A non-B Diseases 0.000 abstract 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Chemical group 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- -1 amino, hydroxy Chemical group 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NOGFHTGYPKWWRX-UHFFFAOYSA-N 2,2,6,6-tetramethyloxan-4-one Chemical compound CC1(C)CC(=O)CC(C)(C)O1 NOGFHTGYPKWWRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2N(CC)C(S(O)(=O)=O)SC2=C1 PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 208000037319 Hepatitis infectious Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000577979 Peromyscus spicilegus Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000000664 diazo group Chemical group [N-]=[N+]=[*] 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- JDSHMPZPIAZGSV-UHFFFAOYSA-N melamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(N)=N1 JDSHMPZPIAZGSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007826 nucleic acid assay Methods 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000003375 selectivity assay Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCS([O-])(=O)=O DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000003239 susceptibility assay Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Peptidy účinné proti vírusovej hepatitíde C
Oblasť, techniky
Tento vynález sa týka nových peptidov, ktoré sú schopné viazať protilátky špecifické pre parenterálne prenášanú hepatitídu ne-A a ne-B hepatitídu (PT-NANBH), predovšetkým HCV a použitia takých peptidov pri imunologickom teste na stanovenie HCV alebo vakcíny na jej prevenciu.
Doterajší stav techniky
Ne-Λ a ne-B hepatitída (NANBH) je definovaná vylučovacou diagnózou a všeobecne sa používa na popis prípadov vírusovej infekčnej hepatitídy u živých ludí, ktorí nie sú chorí v dôsledku pôsobenia vírusov spôsobujúcich hepatitídu A alebo B. PT-NANBH vírus sa tiež označuje ako vírus hepatitídy C (HCV). Vo väčšine takýchto prípadov príčina infekcie nie je identifikovaná, hoci na klinických a epidemiologických základoch sa u pôvodcoch predpokladá, že sú za tento stav zodpovední, ako uviedol vo svojom prehľade Shih a kol. (Prog. Liver Dis. £3 , 433-452 /1986/). V samotných Spojených štátoch až 10 % krvných transfúzií môže mať za výsledok NANBH, čo vytvára významný problém.
GB patent č. 2 239 245Λ popisuje nukleotidové a polypeptidové sekvencie vírusového pôvodcu zodpovedného za posttransfúzne NANBH tohto vírusového pôvodcu nájdená v nukleotidových jadra nájdeného vírusového nie je v GB patente
I oblasti jadra boli to v BHC-11, ako je (PT-NANBH), kde oblasť jadra zodpovedného za PT-NANBH je a peptidových sekvenciách. Oblasť pôvodcu zodpovedného za PT-NANBH
č. 2 239 245A popísaná. Podstatné časti použité v rekombinantných polypeptidoch, a uvedené v GB patente č. 2 239 245.
Podstatné oblasti jadrá vírusového pôvodcu zodpovedného za PT-NANBH, popísané v GB patente č. 2 239 245A, sa tiež používajú na detekciu HCV infekcie V GB patentovej prihláške č. 92 03 803.3, podané menom firmy The Wellcome Foundation Limited dňa 21. februára 1992.
Európsky patent č. 0 445 423A popisuje test detekcie prítomnosti protilátky k HCV antigénu tým, že sa uvedie do styku vzorka s polypeptidom, ktorý obsahuje aspoň jeden epitop HCV antigénu. Pritom sa používajú polypeptidy zo zdanlivej oblasti jadra HCV. Špecifické epitopné oblasti polypeptidov nie sú identi f ikované.
Nedávno s prekvapením pôvodcovia tohto vynalézu zistili, že niekolko sfér (domain) s N-terminálnou oblasťou (región) HCV je epitopných. S prekvapením sa tiež vynašlo, že s N-terminálnou oblasťou jadra proteínu z väčšej s jedinou sférou výlučne alebo v kombinácii iných epitopných sfér. Táto jediná sféra bola označená ako imunodominantný epitop.. Tento imunodominantný epitop bol izolovaný pôvodcami tohto vynálezu.
jadra proteínu séra reaktívne časti reagujú s niektorou z
Podstata vynálezu
Tento vynález sa preto týka HCV vírusového peptidu, ktorý má ďalej popísanú sekvenciu (SEQ ID č. 1 a 2)
Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg (YLLPRR).
Táto sekvencia sa môže zistiť vo zvyškoch 35 až 40 jadra
I
I proteínu. Tento vynález tiež poskytuje DNA sekvenciu kódujúcu peptid, ktorý je vymedzený vyššie. DNA sekvencia môže byť syntetického pôvodu alebo klonovaná. S výhodou DNA sekvencia je uvedená v SEQ ID č. 1.
Nový syntetický peptid bol tiež syntetizovaný a tento peptid zdokonaľuje test senzitivity a selektivity, pokiaľ sa uskutoční porovnanie s prírodným peptidom uvedeným vyššie pri teste HCV.
Preto tento vynález tiež poskytuje peptid všeobecného vzorca I X1X2“X3X4X5X6 (SEQ ID č. 3) (I), v ktorom
X1 predstavuje tyrozín, kyselinu asparágovú, kyselinu glutamovú, leucín alebo izoleucín,
X2 predstavuje leucín, cysteín, kyselinu asparágovú alebo kyselinu glutamovú,
X3 znamená leucín alebo valín,
X4 znamená prolín alebo metionín,
X5 znamená arginín, kyselinu asparágovú, kyselinu glutamovú, prolín, cysteín, fenylalanín, izoleucín, asparagín, glutamín alebo metionín a
X6 predstavuje arginín, kyselinu asparágovú, kyselinu glutamovú, serín alebo cysteín, a kde peptid nezodpovedá všeobecnému vzorcu Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg (SEQ ID č. 1 a 2).
i
I
Tento vynález tiež dáva k dispozícii DNA sekvenciu kódujúcu peptid všeobecného vzorca I, kde sa sekvencia môže jednoducho zistiť, pokiaľ sa vezme do úvahy degenerácia genetického kódu a použitie kodónu.
Peptidy podía<tohto vynálezu sa môžu používat jednotlivo ako časť; väčšieho polypeptidu a/alebo ako zmes peptidov s inými peptidami z HCV crenómu, heterologného genómu alebo topograficky príbuzných peptidov.
Tento vynález tiež poskytuje peptidy, ktoré zahŕňajú peptidy vymedzené vyššie, a to SEQ ID č. 4 a 5 a SEQ ID č. 6 a 7.
Tento vynález tiež poskytuje DNA sekvencie kódujúce peptid, ako je vysvetlené vyššie. S výhodou DNA sekvencie sú uvedené v SEQ ID č. 4 a 6. '
Prítomný vynález tiež poskytuje expresné vektory obsahujúce DNA sekvencie, ako sú definované tu, kde vektory sú schopné vo vhodnom hostiteľovi, vyvolať expresiu DNA sekvencie za vzniku peptidov, ktoré sú vymedzené vyššie.
Expresný faktor zvyčajne obsahuje riadiace prvky DNA, ktoré pôsobia expresiou DMA sekvencie v príslušnom hostitelovi. Tieto prvky sa môžu meniť podía hostiteľa, ale zvyčajne zahŕňajú promotor, miesto viazajúče ribozóm, štartovacie a koncové miesta prenosu a transkripčné koncové väzbové miesto. Príklady takých vektorov zahŕňajú plazmidy a vírusy. Expresné vektory podía tohto vynálezu zahŕňajú ako extrachromozonálne vektory, tak aj vektory, ktoré sú integrované do bunkových chromozómov hostiteľa. Pri použití napr. E. coli môže expresný vektor obsahovať DNA sekvenciu podía tohto vynálezu prípadne ako fusovanú väzbu buď k 5 - alebo 3 -konci DNA sekvencie kódujúcej napr. β-galaktozidázu alebo k 3 -konci DNA sekvencie kódujúcej napr. trp E gén. Pri použití bakulovírusového systému (AcNPV) hmyzu je prípadne DNA ďekvencia pripojená k polyedrovej kódujúcej sekvencii.
Tento vynález sa tiež týka hostiteľovej bunky transformovanej expresnými vektormi, ktoré sú tu definované.
• ť·· ľ ;
i Príklady hostiteľových buniek vhodných na použitie podlá tohto vynálezu zahŕňajú prokaryotické a eukaryotické bunky, ako sú bunky baktérií, kvasiniek, cicavcov a hmyzu. Zvláštne príklady takých buniek zahŕňajú E. coli, S. cerevisiae, P. pastoris, bunky vaječníka čínskeho škrečka a myšie bunky a tiež Spodoptera frugiperda a Tricoplusia ni. Volba hostiteľovej bunky môže závisieť od okolností, ale pokiaľ je dôležitá posttransformačná modifikácia HCV vírusového peptidu, potom by sa mala dat prednosť eukaryotickému hostitelovi.
Tento vynález sa tiež týka spôsobu výroby peptidov, ktoré sú tu vymedzené, ktorý spočíva v tom, že sa izoluje DNA sekvencia, tu definovaná, z HCV genómu alebo syntetizuje DNA sekvencia kódujúca peptidy, tu vymedzená alebo vytvorí DNA sekvencia kódujúca peptid všeobecného vzorca I, zavedie sa DNA sekvencia do expresného vektora tak, že je schopný vo vhodnom hostiteľovi dosiahnuť expresiu, transformujú sa hostiteľove bunky expresným vektorom, kultivujú sa transformované hostiteľove bunky a izoluje sa peptid.
DNA sekvencia kódujúca peptid sa môže syntetizovať s použitím štandardných postupov (Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approac-h, Oxford, IRL Press /1984/).
Požadovaná DNA sekvencia, získaná ako je popísané vyššie, sa môže zaviesť do expresného vektora s použitím známych a štandi^rdných technických postupov. Expresný vektor sa zvyčajne odstrihne s použitím reštrikčných enzýmov a DNA sekvencia sa zavedie s použitím ligácie so zarovnaným koncom alebo s posunutým koncom. Strih sa zvyčajne uskutočňuje na reštrikčnom mieste v obvyklej polohe v expresnom vektore tak, že raz zavedené DNA sekvencie sú pod kontrolou funkčných prvkov DNA, čo spôsobí jeho expresiu.
Transformácia hostiteľovej bunky sa môže uskutočňovať s použitím šteindardných technických postupov. Zvyčajne sa používa určité fsnotypické označenie, na odlíšenie medzi transformantami, ktoré sa úspešne viazali na expresný vektor a transformantami, u ktorých k tomu nedošlo. Odstrihnutie transformovaných buniek hostiteľa, a podľa potreby izolácie peptidu, sa môže tiež uskutočňovať s použitím štandardných technických postupov.
Peptidy podľa tohto vynálezu sa môžu pripraviť syntetickými spôsobmi alebo rekombinantnou DNA technológiou. Peptidy sú s výhodou syntetizované s použitím automatických syntezátorov.
Protilátka špecifická pre peptidy podľa tohto vynálezu sa môže zvýšiť s použitím peptidu. Protilátka môže byt polyklonálna alebo monoklonálna. Protilátka sa môže použiť pri kontrolnom testovaní akosti šarže peptidov, čistení peptidu alebo vírusového lyzátu, epitopnom mapovaní, pokiaľ bolo uskutočnené označenie, ako konjugátu pri kompetitívnom type testu, na detekciu protilátky a pri detekčnom teste antigénu.
Polyklonálna protilátka proti peptidu podľa tohto vynálezu sa môže získať injekciou peptidu, podľa potreby viazaného na nosnú látku, na podporu imunitnej odozvy u cicavcov ako hostiteľa, ako v prípade myši, krysy, ovce alebo králika a získanie takto pripravovanej protilátky. Peptid sa zvyčajne podáva vo forme prostriedku na zavedenie injekciou, v ktorom je peptid zmiešaný s fyziologicky prijateľným riedidlom. Pomocná látka, ako je úplné Freudove adjuvants (FCA) alebo neúplné Freudove adjuvants (FIA), môže byt tiež*zahrnuté do prostriedku. Prostriedok sa zvyčajne zavádza injekciou hostiteľovi počas vhodného časového obdobia,
I pričom v príslušných intervaloch sa odoberajú vzorky plazmy pre test. anti-HCVŕvírusovej protilátky. Pokiaľ sči dosiahne vhodná úroveň ak.tivity, hostiteľ sa nechá vykrvácať. Protilátka 'sa potom extrahuje a vyčistí z krvnej plazmy s použitím štandardných technických postupov, napr. proteínom A alebo ióntomeničovou chromatografiou.
···
·. í.áV'är
Monoklonálna protilátka proti peptidu podľa tohto vynálezu sa môže získať fúziou buniek umŕtvenej bunkovej línie s bunkami, ktoré produkujú protilátku proti vírusovo alebo topograficky príbuznému peptidu a kultiváciou fúzovanej umŕtvenej bunkovej línie. Bežne sa peptidom naočkuje cicavec odlišný od človeka ako hostiteľ, napr. myš alebo krysa. Potom, keď uplynie dostatočná doba na zvýšenie hostiteľovej odozvy formou protilátky, odstránia sa bunky produkujúce protilátku, ako splenocyty. Bunky umŕtvenej bunkovej línie, ako bunkovej línie tvorenej myelomami myši alebo krysy, sa fúzujú s bunkami produkujúcimi protilátku a výsledná fúzia sa sleduje na identifikáciu bunkovej línie, ako hybridómu, ktorý spôsobuje sekréciu požadovanej monoklonálnej protilátky. Fúzovaná bunková línia sa môže kultivovať a monoklonálna protilátka vyčistiť od kultivačného prostredia podobným spôsobom, ako sa čistí polyklonálna protilátka.
Diagnostické testy založené na tomto vynáleze sa môžu použiť na stanovenie prítomnosti alebo neprítomnosti HCV infekcie. Tieto cesty sa môžu tiež používať na sledovanie výsledku ošetrenia takých infekcií, napr. pri interferónovej terapii.
Pri teste diagnózy vírusovej infekcie sú v zásade tri zreteľné prístupy, ktoré sa môžu prispôsobiť tak, aby zahrnuli detekciu vírusovej nukleovej kyseliny, vírusového antigénu alebo vírusovej protilátky. Na vírusové nukleové kyseliny sa zvyčajne pozerá ako na najlepší indikátor prítomnosti samotného vírusu a mali by sa pokladať za identifikačné materiály, ktoré sú pravdepodobne infekčné. Avšak detekcia nukleovej kyseliny nie je zvyčajne tak priamočiara, ako detekcia antigénov alebo protilátok, pretože úroveň cielovej látky môže byť velmi nízka. Vírusový antigén sa používa ako značkovacia látka na stanovenie prítomnosti vírusu a ako indikátor nákazlivosti. V závislosti od vírusu, množstvo antigénu prítomného vo vzorke môže byt veľmi nízke a obtiažne na stanovenie. Detekcia protilátky je relatívne priamočiara, pretože hostiteľov imunitný systém má rozšírenú odozvu na infekciu, ktorá vedie k produkcii veľkých množstiev cirkulujúcich protilátky. Charakter odozvy protilátky môže byť často klinicky vhodný, napr. protilátky zo skupiny IgM skôr ako zo skupiny IgG sú ukazovateľom novej infekcie alebo odozva na zvláštneho vírusového pôvodcu môže byť spojená s clearanciou vírusu. Presný prístup prispôsobený pre diagnózu vírusových infekcií závisí od zvláštnych okolností a zdroja informácií. V prípade HCV diagnostický test môže zahŕňať ktorýkoľvek z týchto troch prístupov.
Pri teste diagnózy HCV, obsahujúcom stanovenie vírusovej nukleovej kyseliny, spôsob môže zahŕňať hybridáciu vírusovej RNA prítomnej v testovanej vzorke alebo cDNA syntetizovanej z takej vírusovej RNA, s DNA sekvenciou zodpovedajúcou nukleotidovej sekvenc.i.;i SEQ ID č. 1, 4 alebo 6 alebo kódujúcim peptidom všeobecného vzorca I a vyšetria sa výsledné hybridy nukleovej kyseliny, na identifikáciu ľubovoľnej HCV vírusovej nukleovej Aplikácia tohto spôsobu je vzorku príslušného tkaniva, zvyčajne obmedzená na ako na biopsiu pečene, kyseliny. testovanú v ktorom vírusová RNA je pravdepodobne prítomná vo vysokej hladine. DNA sekvencia, zodpovedajúca nukleotidovej sekvencií SEQ ID č. 1, 4 alebo 6 alebo kódujúcemu peptidu všeobecného vzorca I, môže mať formu oligonukleotidu alebo cDNA sekvencie prípadne obsiahnutej s plazmidom. Vyšetrenie hybridov nukleovej kyseliny sa zvyčajne uskutočňuje s použitím označenej DNA sekvencie. Výhodne je peptid podľa tohto vynálezu časťou oligonukleotidu, v ktorom je označenie umiestnené v dostatočnej vzdialenosti od peptidu tak, že väzba peptidu k vírusovej nukleovej kyseline neinterferuje so schopnosťou označenia, ktoré nastávajú príliš blízko k väzbovému miestu. Môže sa uskutočniť aspoň jeden dodatočný rad vyšetrení jedného alebo iného druhu na charakterizáciu ďalších hybridov a tak identifikáciu ľubovoľnej HCV vírusovej1nukleovej kyseliny. Stupne hybridácie a vyšetrenia sa uskutočňujú podľa spôsobov známych v obore.
Tento vynález tiež poskytuje testovaciu súpravu na detekciu HCV vírusovej nukleovej kyseliny, ktorá zahŕňa
i) označený oligonukleotid, ktorý obsahuje DNA sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidovej sekvencii SEQ ID č. 1, 4 alebo 6 alebo kódujúci peptid všeobecného vzorca I a prípadne ii) premývacie roztoky, reakčné pufry a substrát, pokial značkovacou látkou je enzým.
Výhodne testovacia súprava tiež obsahuje pozitívnu kontrolnú vzorku na zjednodušenie identifikácie vírusovej nukleovej kyseliny.
Pri teste diagnózy IICV, obsahujúcom detekciu vírusového antigénu alebo protilátky, spôsob môže zahŕňať, uvedenie testovanej vzorky do styku s peptidom podlá tohto vynálezu alebo s polyklonálnou alebo monoklonálnou protilátkou proti peptidu a stanovenie, či je v testovanej vzorke obsiahnutá nejaká väzba antigén-protilátka. Na tento účel testovacia súprava môže byt opatrená peptidom, aký je tu vymedzený alebo polyklonálnou alebo monoklonálnou protilátkou a zariadením na stanovenie, či existuje nejaká väzba s protilátkou alebo antigénom obsiahnutým v testovanej vzorke. Testovaná vzorka môže byt vybratá z íubovolných príslušných tkanív a získaná z fyziologických tekutín spomenutých vyššie, na stanovenie vírusovej nukleotidovej kyseliny. Ak sa získa fyziologická tekutina, môže sa podlá potreby zahustiť na stanovenie lubovolného prítomného vírusového antigénu alebo protilátky.
Využitelnosť '
Môžu sa používať obmeny testovacej štruktúry. Peptid sa môže použiť na zachytenie selektívne pôsobiacej protilátky proti HCV z roztoku, na označenie už zachytenej selektívne pôsobiacej alebo v obidvoch týchto prípadoch a na označenie Okrem toho sa peptid môže používať v určitých typoch homogénnej testovacej štruktúry, v ktorých protilátka reagujúca s peptidom sa stanovuje v roztoku s neoddelenými fázami.
proti).átky protilátky.
Druhy testu, pri ktorých sa peptid používa na zachytenie protilátky z roztoku, zahŕňajú immobilizáciu peptidu na povrchu tuhej látky. Tento povrch by mal byt schopný nejakým spôsobom premytý. Príklady vhodných povrchov zahŕňajú polyméry rôznych typov (tvarované do mikrotitračných jamiek, guličiek, meracích tyčiniek rôznych typov, odsávacích ihiel, elektród a optických zariadení), častice (napr. latex, stabilizované červené krvné bunky, bunky baktérií alebo húb, spóry, zlato alebo iné kovové alebo kov obsahujúce soli a proteínové koloidy), s obvyklou veľkosťou častíc od 0,02 do 5 p.m membrány (napr. z nitrocelulózy, papiera, acetátu celulózy a membrány · z organických alebo anorganických materiálov, s vysokou peréznosťou a/alebo velkou plochou povrchu).
Viazanie peptidu na povrchu sa môže dosahovať pasívnou adsorbciou z roztoku optimálneho zloženia, ktorý môže obsahovať povrchovo aktívne látky, rozpúšťadlá, soli a/alebo chaotropné látky alebo aktívnym chemickým viazaním. Pod aktívnym viazaním sa rozumie zmena reaktívnych alebo aktivovateľných funkčných skupín, ktoré môžu byt vystavené účinku na povrchu (napr. kondenzačných činidiel, aktívnych esterov, halogenidov a anhydridov kyselín, v látkach obsahujúcich aminoskupiny, hydroxyskupiny alebo karboxyskupiny, merkaptoskupiny, karbonylové skupiny, diazoskupiny alebo nenasýtené skupiny). Pod aktívnym viazaním sa prípadne môže rozumieť väzba cez proteín (samotný, pripojený na povrchu pasívne alebo aktívnou väzbou), ako je albumín alebo kazeín, ku ktorému vírusový peptid môže byt chemicky viazaný lubovolr.ým z rôznych spôsobov. Použitie proteínu týmto spôsobom • * , sa môže ukázat ako výhodné, pre izoelektrický bod, náboj, hydrofilnost alebo iné fyzikálne chemické vlastnosti. Vírusový peptid môže byt tiež pripojený na povrch (zvyčajne ale nie je potrebná membrárfa), s nasledujúcim elektrof oréznym delením reakčnej zmesi, rovnako ako imunoprecipitáciou.
Po kontaktovaní (zreagovaní) povrchu nesúceho peptid s testovanou vzorkou sa všetko nechá určitú dobu na prebehnutie reakcie a pokiaľ je potrebné, odstráni sa prebytok vzorky niektorým z možných riešení (ako premývaním, odstreďovaním, filtráciou, magnetickým pôsobením alebo účinkom kapiláry) a zachytená protilátka sa stanoví na ľubovoľnom zariadení, ktoré poskytne signál schopný detekcie. Napríklad toto možno dosiahnuť s použitím označenej molekuly alebo častice ako je popísaná vyššie, ktorá bude reagovať so zachytenou protilátkou (napr. proteínom A alebo proteínom G a pod., anti-speciom alebo podtypom anti-imunoglobulínu, reumatiódnym faktorom alebo protilátkou k peptidu, s použitím kompetitívneho alebo blokujúceho spôsobu) alebo ľubovoľnej molekuly obsahujúcej epitop obsiahnutý v peptide.
Signál schopný detekcie môže byt optický, rádioaktívny alebo fyzikálne chemický a môže byt poskytnutý priamo označenou molekulou alebo časticou, napr. účinkom farbiva, rádioaktívneho označenia, elektroaktívneho druhu, magnetickej rezonančnej analýzy alebo fluóroforu alebo nepriamo označením molekuly alebo častice enzýmom samotným schopným zvýšiť merateľnú zmenu ľubovoľného druhu. Podľa iného uskutočnenia signál schopný detekcie sa môže získať napr. s použitím aglutinácie alebo difrakciou alebo účinkom spôsobujúcim dvojlom, pokiaľ povrch je vo forme častíc.
ktorá umožní, aby bola priamo chemicky alebo
Testy, pri ktorých sa samotný peptid používa na označenie už zachytenej protilátky, vyžadujú určitú formu označenia peptidu, stanovená. Označenie sa môže uskutočňovať pasívnym pripojením, napr. rádioaktívnym označením, magnetickým rezonančnýln druhom označenia, označením častice alebo enzýmu peptidom alebo nepriamo, viazaním ľubovoľnej formy označenia na molekulu, ktorá bude sama reagovať s peptidom. Chemické viazanie označených častí na peptid môže byť nepriame, cez časť už prítomnú v peptide, ako cez aminoskupinu alebo cez intermediárnu časť, ako je melamínová skupina. Zachytenie protilátky môže prebehnúť na ľubovoľných povrchoch už spomenutým ľubovoľným reakčným činidlom, zahrňujúcim pasívnu alebo aktivovanú adsorbciou, ktorá bude pôsobiť v špecifickej protilátke alebo ich výsledkom bude špecifická protilátka alebo viazaný imunokomplex. Predovšetkým viazanie protilátky by nastalo pôsobením anti-species alebo podtypu anti-imunoglobulínu, reumatiódneho faktora alebo proteínu A, G a pod. alebo lubovolnej molekuly obsahujúcej epitop obsiahnutý v peptide.
Označený peptid sa môže použiť pri kompetitívnom spôsobe viazania, pri ktorom je viazanie k ľubovoľnej zvláštnej molekule, na niektorom z povrchov uvedených formou príkladov vyššie, ^blokované antigénom vo vzorke. Podľa iného uskutočnenia sa môže použiť nekompetívny spôsob, pri ktorom antigén vo vzorke je viazaný špecificky alebo nešpecifický na niektorom z povrchov uvedených vyššie a je tiež viazaný k bivalentnej alebo polyvalentnej molekule (napr. protilátke) so zvyšnými valenciami, ktoré sú použité na zachytávanie označeného peptidu.
Často pri homogénnych testoch peptid a protilátka sú oddelene označené tak, že pokial protilátka reaguje s rekombinantným vo voľnom roztoku, obidve označené látky navzájom aby sa dosiahol napr. nerádioaktívny prenos energie, na jednej označenej látke, na druhú označenú látku detekciou z excitovaného druhého označenia alebo ukončenia prvého označenia (napr.
magnetickou rezonanciou alebo meraním enzýmu). vírusový peptid, tak protilátka vo výsledných vzorkách má za výsledok omedzenú interakciu označeného páru a tak rozdielnu úroveň signálu v detektore.
peptidom reagujú,, zachytenej s vhodnou rýchleho fluórimetricky, Okrem toho ako
Vhodná testovacia formácia pre detekciu HCV protilátky je priama sendvičová formácia enzýmu pre imunologické stanovenie poťahuje na mikrotitračné jamky. Testovaná ku ktorému je enzým viazaný, sa pridávajú súčasne. Ktorákoľvek HCV protilátka prítomná v testovanej vzorke sa viaže ako k peptidu poťahujúcemu jamku, tak k peptidu viazanému s enzýmom. Zvyčajne sa používajú rovnaké peptidy na (EIA). vzorka
Peptid sa a peptid, j obidvoch stranách sendviča. Po premytí sa viazaný enzým stanoví ; priamo s použitím špecifického substrátu, čo je spojené so zmenou farby. Testovacia súprava na použitie v EIA zahŕňa:
!
1) peptid, ktorý je tu definovaný, označený enzýmom, j
2) substrát pre enzým,
3) prostriedok opatrený povrchom, na ktorom je peptid imobilizovaný a prípadne
4) premývacie roztoky a/alebo pufry.
Je tiež možné používať systém ELISA na zachytávanie IgG/IgM protilátky, v ktorom je anti-ludská protilátka potiahnutá na jamkách s objemom v mikrolitroch a testovaná vzorka sa pridáva do jamky. Akákolvek IgG alebo IgM protilátka prítomná v testovanej vzorke sa bude potom viazať k anti-íudskej protilátke. Peptid podía tohto vynálezu, ktorý je označený, sa pridá do jamky a peptid sa bude viazať k lubovolnej IgG alebo IgM protilátke, čo je spôsobené v dôsledku HCV infekcie. IgG alebo IgM protilátka sa môže vizualizovat účinkom označenia na peptide.
Tak môže byť zrejmé, že peptidy podía tohto vynálezu sa môžu používať na detekciu HCV infekcie v mnohých štruktúrach, teda voíných peptidoch, pri testoch vrátane kompetičnej ELIS.A, membránovo viazanej EIA zrážania. Peptidové konjugáty sa môžu používať pri rozšírených testoch a ELISA zachytávajúca IgG/IgM protilátku.
klasickej ELISA, a imunologického
Peptid. podía tohto vynálezu sa prostriedku na vyvolanie imunity na peptid môže byt prítomný spoločne nosnou látkou.
môže vpraviť do vakcínového HCV u človeka. Na tento účel s farmaceutický prijateínou
Na použitie vo vakcínovom prostriedku, peptid môže byť prípadne prítomný ako časť častice z jadrovej fúzie hepatitídy B, ako popísal Čiarke a kol. (Náture 330, 381-384 /1987/) alebo polymér na báze polylyzínu, ako popísal Tam (PNAS 85, 5409-5413 /1988/). Podlá iného uskutočnenia sa môže prípadne peptid pripojiť ku štruktúre častice, ako sú lipozómy alebo ISCOMS.
Farmaceutický prostredie vhodné zavedenie peptidu prijateľné nosné látky zahŕňajú kvapalné na použitie ako pomocná látka (vehikulum), na do tela pacienta. Príkladom takého kvapalného prostredia je fyziologický roztok (roztok chloridu sodného). Peptid sa môže rozpustiť alebo suspendovať ako tuhá látka v nosnej látke.
Vakcínový prostriedok môže tiež obsahovať pomocnú látku (adjuvants) na stimuláciu imunitnej odozvy a tým zvýšenie účinku vakcíny. Príklady adjuvants zahŕňajú hydroxid hlinitý a fosforečnan hlinitý.
Vakcínový prostriedok môže obsahovať peptid v konečnej koncentrácii, ktorá je v rozsahu od 0,01 do 5 mg/ml, výhodne od 0,03 do 2 mg/ml. Vakcínový prostriedok sa môže vniesť do sterilného zásobníka, ktorý sa potom vzduchotesne uzavrie a skladuje pri nízkej teplote, napr. pri 4 °C alebo sa môže lyofilizovať.
Za účelom vyvolania imunity u človeka voči HCV sa môže podať jedna dávka alebo väčší počet dávok vakcínového prostriedku. Každá dávka môže mat objem od 0,1 do 2 ml, s výhodou od 0,2 do 1 ml. Spôsob vyvolania imunity u človeka voči HCV zahŕňa podanie účinného množstva vakcínového prostriedku, ako to bolo vymedzené vyššie.
Tento vynález tiež poskytuje použitie peptidu, ktorý je tu vymedzený, pri príprave vakcíny na použitie pri vyvolaní imunity u človeka voči HCV.
Vakcíny podľa tohto obvyklým spôsobom na a parenterálneho (napr.
vynálezu sa môžu podávať ľubovoľným podávanie vakcín, vrátane orálneho intravenózneho, subkutánneho alebo intramuskulárneho) podania v injekcii. Ošetrenie môže pozostávať z jedinej dávky vakcíny alebo väčšieho počtu dávok počas určitého časového obdobia.
V sekvenčnom zázname sú zahrnuté SEQ ID č. 1 až 29, na ktoré sa odvoláva v popise a patentových nárokoch.
Prílvlady uskutočnenia vynálezu
Uskutočnenia tohto vynálezu budú teraz ilustrované.
Príklad 1
Identifikácia epitopnej sféry HCV jadra proteínu
N-Terminálny 97 aminokyselinový zvyšok HCV jadra proteínu SEQ ID č. 8 sa mapuje analýzou PEPSCAN. Tento proces zahŕňa serologické analýzy sekvenčne prekrývajúcich sa peptidov, u ktorých trvá oblasť záujmu, na identifikáciu epitopnej sféry. Deväťdesiat prekrývajúcich sa oktamérnych peptidov sa syntetizuje na polypropylénových nosičoch charakteru hrotu (pin supports) podľa inštrukcií výrobcu (Cambridge Research Biochemicals) tak, že každý peptid sa prekrýva s predchádzajúcou sekvenciou siedmimi N-koncovými zvyškami a s nasledujúcim peptidom siedmimi C-koncovými zvyškami. Sérum alebo IgG čistený zo séra jednotlivcov potvrdzuje, že sú séropozitívne na HCV použitie na vyšetrenie peptidov.
i
Príklad 2
Vyšetrenie peptidov
Skúšobný postup sa uskutočňuje v zásade ako je popísané v manuále získanom ako inštrukcia od výrobcu. Doba a teplota inkubácie testovanej protilátky sa odlišujú od predpísaných údajov, pričom sa skracuje doba adsorbcie pri každom teste.
Sérum
Celkovo sa testuje 16 sér pomocou analýzy PEPSCAN. Tie pozostávajú z 12 sér zakúpených v U.S. Donors, u ktorých sa zistilo, že sú pozitívne na protilátky voči HCV, pri obvyklom vyšetrení na mieste získania. Zvyšné štyri séra sú od pacientov, u ktorých bola stanovená diagnóza, že majú ne-A a ne-B hepatitídu a u ktorých sa následne ukazuje, že obsahujú protilátku k HCV. Séra sa : vyšetrujú buď ako frakcia surového séra alebo ako prípravok na báze kyseliny kaprylovej. Čistenie kyseliny kaprylovej z IgG zo séra sa uskutočňuje tak, ako popisuje Stienbuch a Audran v Árch. Biochem. Biophys. 134, 279-284 /1969/).
Test
Testovacia štruktúra zahŕňa sekvenčné inkubovanie rôznych hrotov v mikrojamkových doskách obsahujúcich blokujúcu testovanú protilátku, konjugát a substrátové roztoky. Imunulogický komplex sa vytvorí na hrote s konjugátom označeným enzýmom, kde konjugát je imobilizovaný na väzbe antipeptid-protilátka z testovaného séra. Pokiaľ sa hrot potom ponorí do substrátu, enzým zmení farbu, čo sa použije na stanovenie množstva väzieb antipeptid-protilátka.
Blokovanie
Hroty sa ponoria do 200 μΐ superkoktailu (1 % ovalbumínu, 1 % hovädzieho sérového albumínu v 0,15-molárnom fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom, s hodnotou pH 7,2 a 0,1 % Tween 20) a nechajú stáť pri laboratórnej teplote počas 1 hodiny.
Testovaná protilátka
Testovaná protilátka sa zriedi od 1:200 (IgG) do 1:1000 (sérum) superkoktailom. I-Iroty sa potom nechajú štát v tomto roztoku (175 μΐ na jamku) pri teplote 37 °C počas 1 hodiny. Po tejto inkubácii sa hroty štyrikrát premyjú 0,15-molárnym fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom, s hodnotou pH 7,2 a 0,05 % Tween 20, vždy pri laboratórnej teplote počas 10 minút.
Konjugát
Králičí anti-ludský IgG kopulovaný s peroxidázou z chrenu sedliackeho sa zriedi v pomere 1:1000 superkoktailom. Peptid nesúci hroty sa potom nechá stáť v tomto roztoku pri laboratórnej teplote počas 1 hodiny. Hroty sa potom znovu štyrikrát premyjú, ako je uvedené vyššie.
Substrát
Roztok substrátu sa pripravuje čerstvý pre každý test. Do 100 ml 0,1-molárneho fosfátu sa pridá 0,08-molárny citrátový tlmivý roztok s hodnotou pH 4,0 rozpustený v 50 mg kyseliny
2,2 -azino-bis(3-etylbenztiazolínsulfónovej) (ABTS) a 0,3 μΙ/ml 30 % peroxidu vodíka. Hroty sa ponoria do jamiek obsahujúcich roztok substrátu (150 μΐ na jamku) a inkubujú pri laboratórnej teplote v tme. Potom keď sa vytvorí dostatok farby, reakcia sa zastaví odstránením hrotov. Dosky sa potom hneď odčítajú v zariadení t pa vyhodnocovanie spektometrických dosiek, pri vlnovej dĺžke 405 nm. Hodnoty absorbancie sa potom vynesú v závislosti na počte hrotov. Epitopná sféra sa potom definuje ako kontinuálna sekvencia aminokyselín všeobecne ku všetkým pozitívnym hrotom vo sfére, t.j.
pozitívny hrot 1 Gly-Val-Tyr-Leu~Leu-Pro-Arg-Arg (SEQ ID č. 9) (GVYLLPRR)
·: '.Γ λ'Λ''
pozitívny hrot 2 Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly (SEQ ID č. 10) (V Y L L P R R G) pozitívny hrot 3 Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-Pro (SEQ ID č. 11) (Y L L P R R G P)
V tomto príklade má epitop sekvenciu Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg (YLLPRR) (SEQ ID Č. 1 a 2).
Čistenie
Po použití sa hroty čistia pôsobením ultrazvuku v prerušovanom tlmivom roztoku (1 % dodecylsulfonátu sodného a 0,1 % 2-merkaptoetanolu v 0,1-molárnom dihydrogénfosforečnane sodnom) zohriatym na teplotu 60 °C. Hroty sa vystavia pôsobeniu ultrazvuku na dobu 30 minút a potom dvakrát premyjú v destilovanej vode pri teplote 60 °C a jedenkrát vo vriacom metanole. Hroty sa potom uložia pri laboratórnej teplote vzduchotesne uzavreté vo vreckách obsahujúcich silikagel alebo sa môžu hneď použiť pri nasledujúcom teste.
U niekolkých sfér v N-koncovej oblasti HCV jadra proteínu sa takto zistí, že sú epitopné. Jedna z týchto oblastí, epitop imunologickej sféry, sa stanoví vo väčšom alebo menšom rozsahu u všetkých testovaných sér. Epitop imunologickej sféry je situovaný vo zvyškoch 35 až 40 jadra proteínu, ktoré má aminokyselinovú sekvenciu Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg (YLLPRR) SEQ ID č. 1 a 2. Výsledky skúšok vzoriek sú uvedené v tabuľke 1.
•j ί
Tabulka 1
Jednotky absorbancie pre odlišné séra
Peptid | SEQ ID č. | 65221 | 65241 | 65276 | 65234 | L |
GGGQIVGG | 12 | 137 | 121 | 127 | 134 | 121 |
GGQIVGGV | 13 | 323 | 122 | 119 | 179 | 119 |
GQIVGGVY | 14 | ' 216 | 112 | 128 | 165 | 138 |
QIVGGVYL | 15 | 329 | 125 | 165 | : 152 | 161 |
IVGGVYLL | 16 | 268 | 126 | 183 | 186 | 158 |
VGGVYLLP | 17 | 83 | 144 | 182 | 235 | 169 |
GGVYLLPR | 18 | 132 | 311 | 246 | 344 | 191 |
GVYLLPRR | 19 | 613 | 511 | 350 | 229 | 378 |
VYLLPRRG | 20 | 769 | 641 | 440 | 280 | 306 |
YLLPRRGP | 21 | 332 | 367 | 248 | 17 7 | 242 |
LLPRRGPR | 22 | 142 | 129 | 98 | 101 | 133 |
LPRRGPRL | 23 | 97 | 94 | 139 | 145 | 148 |
PRRGPRLG | 24 | 85 | 73 | 129 | 109 | 110 |
RRGPRLGV | 25 | 145 | 85 | 150 | 146 | 123 |
RGPRLGVR | 26 | 168 | 94 | 167 | 99 | 132 |
GPRLGVRA | 27 | 111 | 60 | 146 | 75 | 101 |
PRLGVRAT | 28 | 166 | 79 | 155 | 88 | 115 |
RLGVRATR | 29 | 81 | 180 | 177 | 100 | 124 |
Aminokyselinové zvyšky jednotlivými písmenami (Eur Podčiarknuté charakteristiky sféry.
sú označované kódom tvoreným J. Biochem. 138, 9-37 /1984/).
predstavujú oblasť imunologickej
I
I
Príklad 3
Spôsob prípravy novej látky napodobňujúcej pôvodný epitop
Substitučný spôsob sieťovania (replacement net method) sa použije na sekvenčnú náhradu zložiek aminokyselinových zvyškov v epitope s každou z iných geneticky zakódovaných aminokyselín.
Pre analýzu substitučného sieťovania základnej sekvencie vstúpi do Software (Epitope Mapping Software), poskytnutého Cambridge Research Biochemicals a vytvorí · sa súbor substituovaných peptidov. Tento proces sa uskutočňuje pre šesť aminokyselinových zvyškov imunologickej sféry jadra epitopu HCV. Peptidy sa syntetizujú na polypropylénových hrotoch, podlá pokynov výrobcu (Cambridge Research Biochemicals). Skúšobná štruktúra je rovnaká ako je uvedená vyššie pre PEPSCAN.
Uvažuje sa so substitučným sieťovaním jadra v imunologickej sfére epitopovej sekvencie Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg (YLLPRR) (SEQ ID č. 1 a 2) pomocou 12 platených darcov ludského séra, ako je popísané vyššie.
Pre každú polohu v epitope je daná frekvencia každej substitúcie zvyšku ako substitúcie prijateľnej pre základnú sekvenciu. Substituované zvyšky sa pokladajú za prijateľné, pokiaľ signál nového peptidu je 80 % základnej sekvencie alebo je väčší.
Na základe týchto výsledkov, sa získajú substituované aminokyselinové zvyšky pre každú polohu, ktoré sú uvedené v tabuľke 2. Zvyšky uvedené kurzívou sa týkajú základnej sekvencie.
Tabuľka 2
Základný | Amino- | Frekvencia | sily | relatívneho | signálu | (n=12) |
zvyšok | kyselina | najvyššia | 2 až | 5 6 až 10 | nad 10 | celková |
1-tyrozín | D | 1 | 8 | 1 | 0 | 10 |
E | 2 | 8 | 1 | 0 | 11 | |
I | 0 | 3 | 7 | 0 | 10 | |
L | 7 | 1 | 1 | 0 | 9 | |
Y | 2 | 3 | 5 | 1 | 11 | |
2-leucín | C | 2 | 8 | 1 | 0 | 11 |
D | 6 | 4 | 0 | 0 | 10 | |
E | 1 | 6 | 4 | 0 | 11 | |
L | 1 | 2 | 3 | 2 | 8 | |
3-leucín | L | 2 | 0 | 1 | 0 | 3 |
V | 6 | 5 | 0 | 0 | 11 | |
4-prolín | M | 4 | 5 | 0 | 0 | 9 |
P | 3 | 1 | 1 | 0 | 5 | |
5-arginín | C | 0 | 8 | 2 | 0 | 10 |
D | 4 | 5 | 1 | 1 | 11 | |
E | 2 | 4 | 3 | 1 | 10 | |
F | 0 | 2 | 7 | 3 | 12 | |
M | 0 | 2 | 2 | 6 | 10 | |
N | 0 | 0 | 6 | 5 | 11 | |
P | 1 | 5 | 4 | 1 | 11 | |
Q | 2 | 6 | 2 | 0 | 10 | |
P | 0 | ! 2 | 1 | 7 | 10 | |
6-arginin | c | 0 | 4 | 0 | 6 | 10 |
D | 3 | 2 | 3 | 2 | 10 | |
E | 1 | 6 | 2 | 1 | 10 | |
P | 2 | 1 | 5 | 3 | 11 | |
S | 3 | 5 | 1 | 1 | 10 |
' *
2
Príklad 4
Spôsob prípravy AC 2 2
Úplne chránená peptidová živica sa zostaví na p-hydroxymetylfenoxymetylovej (HMP) živici postupnou syntézou v tuhej fáze (spracovaním od karboxylového koncového zvyšku smerom k zvyšku tvorenému koncovou aminoskupinou) podľa všeobecného postupu uvedeného v Applied Biosystems User Bulletin, č. 33 /november 1990/. HMP živica sa prenesie do reakčnej nádoby (Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 431Λ). Aminokyselinový zvyšok s koncovými karboxyskupinami sa kopuluje na živici s použitím štandardného postupu popísaného v popise spôsobu výroby Applied Biosystems Fastmoc Cycle Protocol. Nezreagované kopulujúce miesta na živici sa potom blokujú tým, že sa chránia anhydridom kyseliny benzoovej. Všetky nasledujúce aminokyseliny sa potom pridávajú postupným spôsobom, pričom sa pohybuje od konca obsahujúceho karboxyskupinu ku kuncu tvorenému aminoskupinou, s použitím výrobného postupu Applied Biosystems Fastmoc Cycle Protocol. Ν-α-ľnninoskupina u všetkých peptidov je chránená väzbou s 9-fluórfenylmetoxykarbonylovou (Fmoc) skupinou. Bočné reťazce funkčných skupín príslušných aminokyselín sú chránené týmito skupinami:
Cys-Trt (trityl)
Gly-Trt (trityl)
Tyr-tBu (terc.-butyl)
Arg-Pmc (2,2,5,7,8-pantametylchromán-6-sulŕonyl).
t
Úplne chránená peptidová živica sa prenesie do flaše tvaru hrušky a spracuje si 0,25 ml etánditiolu, 0,5 ml tioanizolu, 0,5 ml vody a 8,75 ml kyseliny trifluóroctovej. Zmes sa mieša pri laboratórnej teplote počas 90 minút a potom filtruje cez sklenenú vlnu v Pasteurovej pipete. chladného éteru, obsiahnutého načo sa peptid vyzráža. Obsah odsáva, čím sa v skúmavke premyje éterom (s použitím
Filtrát sa nakvapka dó ladovo v odstredivkovej skúmavke Corex, skúmavky sa odstred'uje a kvapalina získajú pelety peptidu. Peptid sa špachtle na odstránenie agregácie
Λ;
peliet) a peptid sa získa celkom šesťkrát. Peptid zníženom tlaku.
odstreďovaním. Tento postup sa opakuje sa nakoniec suší odstreďovaním pri
Príklad 5
Vakcínový prostriedok
Vakcínový prostriedok sa môže pripraviť obvyklým technickým postupom s použitím ďalej uvedených zložiek v danom množstve.
HCV vírusový peptid (buď samotný ako ďalší polypeptid alebo s koktailom z iných peptidov)
Claims (14)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. HCV vírusový peptid, ktorý obsahuje sekvenciuTyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg (SEQ ID č. 1 a 2)
- 2. Peptid obsahujúci sekvenciu všeobecného vzorca I XlX2~X3_X4_X5X6 ' (SEQ ID Č.3) (I), v ktoromΧγ predstavuje tyrozín, kyselinu asparágovú, kyselinu glutamovú, leucín alebo izoleucín,X2 predstavuje leucín, cysteín, kyselinu asparágovú alebo kyselinu glutamovú,X-j znamená leucín alebo valín,X4 znamená prolín alebo metionín,X5 znamená arginín, kyselinu asparágovú, kyselinu glutamovú,. prolín, cysteín, fenylalanín, izoleucín, asparagín, glutamín alebo metionín aX6 predstavuje arginín, kyselinu asparágovú, kyselinu glutamovú, serín alebo cysteín, ia kde peptid nezodpovedá všeobecnému vzorcuTyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg (SEQ ID č. l a 2).
- 3. Vírusový peptid, ktorý je vysvetlený v SEQ ID č. 4a 5 aleboSEQ ID č. 6 a 7.
- 4. DNA sekvencia kódujúca peptid podía nároku 1, 2 alebo 3.
- 5. DNA sekvencia podía nároku 4, ktorá je vysvetlená v SEQ ID č. 1, 4 alebo 6.
- 6. Expresný vektor obsahujúci DNA sekvenciu podía nároku 4 alebo 5, ktorý je schopný, vo vhodnom hostiteíovi, vyvolať expresiu DNA sekvencie počas vzniku peptidov.
- 7. Hostiteíova bunka transformovaná expresným faktorom podía nároku 6. ·
- 8. Spôsob prípravy peptidu podía niektorého z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že sa izoluje DNA sekvencia vysvetlená v SEQ ID č. 1, 4 alebo 6 z HCV genómu alebo syntetizuje DNA sekvencia kódujúca peptidy vysvetlená v SEQ ID č. 1, 4,6 alebo vytvorí DNA sekvencia kódujúca peptid všeobecného vzorca I, zavedie sa DNA sekvencia do expresného vektora tak, že je schopný vo vhodnom hostiteíovi dosiahnuť expresiu, transformuje sa hostiteíova bunka expresným vektorom, kultivuje sa transformovaná hostiteíova bunka a izoluje sa peptid.
- 9. Spôsob prípravy peptidu podía niektorého z nárokov l až 3, vyznačujúci sa tým, že sa pripravuje synteticky.
- 10. Polvklonálna alebo monoklonálna protilátka proti peptidu podía niektorého z nárokov 1 až 3.;
- 11. Spôsob detekcie HCV vírusovej 1 nukleovej kyseliny, vyznačujúci sa tým, že sa hybriduje vírusová RNA prítomná v testovanej vzorke alebo cDNA syntetizovaná ;· z takej vírusovej RNA, s DNA sekvenciou zodpovedajúcou SEQ IDč. 1, 4 alebo 6 alebo kódujúcim peptidom všeobecného vzorca la vyšetria sa výsledné hybridy nukleovej kyseliny, na ) identifikáciu íubovoínej HCV vírusovej nukleovej kyseliny.t.
- 12. Spôsob detekcie HCV vírusovej protilátky, vyznačujúci sa t ý m, že sa uvedie testovaná vzorka do styku s peptidom podlá niektorého z nárokov 1 až 3 alebo s polyklonálnou alebo monoklonálnou protilátkou podlá nároku 10 a stanoví sa, či je v testovanej vzorke obsiahnutá nejaká väzba antigén-protilátka.
- 13. Testovacia súprava na detekciu HCV vírusovej protilátky, vyznačujúca sa tým, že obsahuje peptid podlá • niektorého z nárokov 1 až 3 alebo polyklonálnu alebo * monoklonálnu protilátku podlá nároku 10 a prostriedok na stanovenie, či je v testovanej vzorke obsiahnutá nejaká väzba antigén-protilátka.
- 14. Vakcínový prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje peptid podlá niektorého z nárokov 1 až 3 spolu s farmaceutický prijateľnou nosnou látkou.Spôsob vyvolania imunity u človeka voči HCV, vyznačujúci sa tým, že sa podáva účinné množstvo vakcínového prostriedku pódia nároku 14.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB929204274A GB9204274D0 (en) | 1992-02-28 | 1992-02-28 | Novel peptides |
PCT/GB1993/000410 WO1993017111A1 (en) | 1992-02-28 | 1993-02-26 | Hepatitis c virus peptides |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK103594A3 true SK103594A3 (en) | 1995-06-07 |
Family
ID=10711198
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK1035-94A SK103594A3 (en) | 1992-02-28 | 1993-01-01 | Hepatitis "c" virus peptides |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0628079A1 (sk) |
JP (1) | JPH07504562A (sk) |
AU (1) | AU688259B2 (sk) |
CA (1) | CA2131028A1 (sk) |
CZ (1) | CZ285834B6 (sk) |
FI (1) | FI943929A0 (sk) |
GB (1) | GB9204274D0 (sk) |
SK (1) | SK103594A3 (sk) |
WO (1) | WO1993017111A1 (sk) |
ZA (1) | ZA931299B (sk) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2711670B1 (fr) * | 1993-10-22 | 1996-01-12 | Pasteur Institut | Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite. |
EP0829488A4 (en) * | 1995-04-28 | 1999-04-07 | Srl Inc | ANTIGENIC PEPTIDE COMPOUND AND IMMUNOLOGICAL ASSAY METHOD |
FR2775690B1 (fr) * | 1998-03-09 | 2001-12-14 | Bio Merieux | Anticorps monoclonal et utilisations pour detecter des antigenes de la proteine core de vhc |
CA2316130A1 (en) * | 1999-08-19 | 2001-02-19 | Masanori Fukui | Method for detection or determination of hcv core antigens and reagent for detection or determination for use therein |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1990014436A1 (en) * | 1989-05-18 | 1990-11-29 | Chiron Corporation | Nanbv diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis c virus |
KR940000755B1 (ko) * | 1990-02-16 | 1994-01-29 | 유나이티드 바이오메디칼 인코오포레이티드 | Hcv에 대한 항체 검출, hcv 감염의 진단 및 백신으로서의 그 예방에 특히 적합한 합성 펩티드 |
JP3516681B2 (ja) * | 1991-06-24 | 2004-04-05 | カイロン コーポレイション | C型肝炎ウイルス(hcv)ポリペプチド |
-
1992
- 1992-02-28 GB GB929204274A patent/GB9204274D0/en active Pending
-
1993
- 1993-01-01 SK SK1035-94A patent/SK103594A3/sk unknown
- 1993-02-24 ZA ZA931299A patent/ZA931299B/xx unknown
- 1993-02-26 JP JP5514676A patent/JPH07504562A/ja active Pending
- 1993-02-26 CZ CZ942068A patent/CZ285834B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-02-26 CA CA002131028A patent/CA2131028A1/en not_active Abandoned
- 1993-02-26 WO PCT/GB1993/000410 patent/WO1993017111A1/en not_active Application Discontinuation
- 1993-02-26 EP EP93904270A patent/EP0628079A1/en not_active Withdrawn
- 1993-02-26 AU AU35725/93A patent/AU688259B2/en not_active Ceased
-
1994
- 1994-08-26 FI FI943929A patent/FI943929A0/fi unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CZ206894A3 (en) | 1995-03-15 |
EP0628079A1 (en) | 1994-12-14 |
AU3572593A (en) | 1993-09-13 |
FI943929A (fi) | 1994-08-26 |
CZ285834B6 (cs) | 1999-11-17 |
AU688259B2 (en) | 1998-03-12 |
FI943929A0 (fi) | 1994-08-26 |
ZA931299B (en) | 1993-10-13 |
CA2131028A1 (en) | 1993-09-02 |
WO1993017111A1 (en) | 1993-09-02 |
GB9204274D0 (en) | 1992-04-08 |
JPH07504562A (ja) | 1995-05-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2130969C1 (ru) | Композиция для диагностики гепатита c человека (варианты), способ и набор для обнаружения антител к вирусу гепатита c человека | |
JP3895747B2 (ja) | C型肝炎ウイルス4、5及び6型 | |
US6312889B1 (en) | Combinations of hepatitis c virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies | |
US5683864A (en) | Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies | |
RU2155228C2 (ru) | Hcv геномные последовательности для диагностических и терапевтических целей | |
KR970010925B1 (ko) | Hcv 펩티드-항원 및 c형 간염 바이러스(hcv)의 검사 방법 | |
JP4458556B2 (ja) | C型肝炎のe2短縮型ポリペプチドの細胞内生成 | |
JP2004525613A (ja) | E型肝炎ウイルスのポリペプチド断片、それを含むワクチン組成物及び診断キット、並びにその使用 | |
EP0642666B1 (en) | Hepatitis c assay | |
JP2666903B2 (ja) | Hcv ペプチド抗原及びhcv の測定方法 | |
SK103594A3 (en) | Hepatitis "c" virus peptides | |
CA2072092A1 (en) | Non-a non-b sequences | |
EP0525910A1 (en) | Non-A, non-B peptide | |
US20020150990A1 (en) | Hepatitis C virus peptides | |
EP0595638B1 (en) | Epitope-related peptides of human parvovirus | |
EP0536838A2 (en) | Non-A, non-B peptides | |
AU639560C (en) | Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies | |
WO1993011158A2 (en) | Non-a, non-b peptides | |
PT96223B (pt) | Processo para a preparacao de um agente viral responsavel pela hepatite nao-a bnao-b de pos-transfusao |