SK103594A3

SK103594A3 - Hepatitis "c" virus peptides

Info

Publication number: SK103594A3
Application number: SK1035-94A
Authority: SK
Inventors: Ian Pike
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1992-02-28
Filing date: 1993-01-01
Publication date: 1995-06-07
Also published as: AU688259B2; WO1993017111A1; CZ285834B6; AU3572593A; EP0628079A1; FI943929A; ZA931299B; CZ206894A3; CA2131028A1; GB9204274D0; FI943929A0; JPH07504562A

Description

Peptidy účinné proti vírusovej hepatitíde C

Oblasť, techniky

Tento vynález sa týka nových peptidov, ktoré sú schopné viazať protilátky špecifické pre parenterálne prenášanú hepatitídu ne-A a ne-B hepatitídu (PT-NANBH), predovšetkým HCV a použitia takých peptidov pri imunologickom teste na stanovenie HCV alebo vakcíny na jej prevenciu.

Doterajší stav techniky

Ne-Λ a ne-B hepatitída (NANBH) je definovaná vylučovacou diagnózou a všeobecne sa používa na popis prípadov vírusovej infekčnej hepatitídy u živých ludí, ktorí nie sú chorí v dôsledku pôsobenia vírusov spôsobujúcich hepatitídu A alebo B. PT-NANBH vírus sa tiež označuje ako vírus hepatitídy C (HCV). Vo väčšine takýchto prípadov príčina infekcie nie je identifikovaná, hoci na klinických a epidemiologických základoch sa u pôvodcoch predpokladá, že sú za tento stav zodpovední, ako uviedol vo svojom prehľade Shih a kol. (Prog. Liver Dis. £3 , 433-452 /1986/). V samotných Spojených štátoch až 10 % krvných transfúzií môže mať za výsledok NANBH, čo vytvára významný problém.

GB patent č. 2 239 245Λ popisuje nukleotidové a polypeptidové sekvencie vírusového pôvodcu zodpovedného za posttransfúzne NANBH tohto vírusového pôvodcu nájdená v nukleotidových jadra nájdeného vírusového nie je v GB patente

I oblasti jadra boli to v BHC-11, ako je (PT-NANBH), kde oblasť jadra zodpovedného za PT-NANBH je a peptidových sekvenciách. Oblasť pôvodcu zodpovedného za PT-NANBH

č. 2 239 245A popísaná. Podstatné časti použité v rekombinantných polypeptidoch, a uvedené v GB patente č. 2 239 245.

Podstatné oblasti jadrá vírusového pôvodcu zodpovedného za PT-NANBH, popísané v GB patente č. 2 239 245A, sa tiež používajú na detekciu HCV infekcie V GB patentovej prihláške č. 92 03 803.3, podané menom firmy The Wellcome Foundation Limited dňa 21. februára 1992.

Európsky patent č. 0 445 423A popisuje test detekcie prítomnosti protilátky k HCV antigénu tým, že sa uvedie do styku vzorka s polypeptidom, ktorý obsahuje aspoň jeden epitop HCV antigénu. Pritom sa používajú polypeptidy zo zdanlivej oblasti jadra HCV. Špecifické epitopné oblasti polypeptidov nie sú identi f ikované.

Nedávno s prekvapením pôvodcovia tohto vynalézu zistili, že niekolko sfér (domain) s N-terminálnou oblasťou (región) HCV je epitopných. S prekvapením sa tiež vynašlo, že s N-terminálnou oblasťou jadra proteínu z väčšej s jedinou sférou výlučne alebo v kombinácii iných epitopných sfér. Táto jediná sféra bola označená ako imunodominantný epitop.. Tento imunodominantný epitop bol izolovaný pôvodcami tohto vynálezu.

jadra proteínu séra reaktívne časti reagujú s niektorou z

Podstata vynálezu

Tento vynález sa preto týka HCV vírusového peptidu, ktorý má ďalej popísanú sekvenciu (SEQ ID č. 1 a 2)

Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg (YLLPRR).

Táto sekvencia sa môže zistiť vo zvyškoch 35 až 40 jadra

I

I proteínu. Tento vynález tiež poskytuje DNA sekvenciu kódujúcu peptid, ktorý je vymedzený vyššie. DNA sekvencia môže byť syntetického pôvodu alebo klonovaná. S výhodou DNA sekvencia je uvedená v SEQ ID č. 1.

Nový syntetický peptid bol tiež syntetizovaný a tento peptid zdokonaľuje test senzitivity a selektivity, pokiaľ sa uskutoční porovnanie s prírodným peptidom uvedeným vyššie pri teste HCV.

Preto tento vynález tiež poskytuje peptid všeobecného vzorca I ^X1^X2“^X3^X4^X5^X6 (SEQ ID č. 3) (I), v ktorom

X₁ predstavuje tyrozín, kyselinu asparágovú, kyselinu glutamovú, leucín alebo izoleucín,

X₂ predstavuje leucín, cysteín, kyselinu asparágovú alebo kyselinu glutamovú,

X₃ znamená leucín alebo valín,

X₄ znamená prolín alebo metionín,

X₅ znamená arginín, kyselinu asparágovú, kyselinu glutamovú, prolín, cysteín, fenylalanín, izoleucín, asparagín, glutamín alebo metionín a

X₆ predstavuje arginín, kyselinu asparágovú, kyselinu glutamovú, serín alebo cysteín, a kde peptid nezodpovedá všeobecnému vzorcu Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg (SEQ ID č. 1 a 2).

i

I

Tento vynález tiež dáva k dispozícii DNA sekvenciu kódujúcu peptid všeobecného vzorca I, kde sa sekvencia môže jednoducho zistiť, pokiaľ sa vezme do úvahy degenerácia genetického kódu a použitie kodónu.

Peptidy podía<tohto vynálezu sa môžu používat jednotlivo ako časť; väčšieho polypeptidu a/alebo ako zmes peptidov s inými peptidami z HCV crenómu, heterologného genómu alebo topograficky príbuzných peptidov.

Tento vynález tiež poskytuje peptidy, ktoré zahŕňajú peptidy vymedzené vyššie, a to SEQ ID č. 4 a 5 a SEQ ID č. 6 a 7.

Tento vynález tiež poskytuje DNA sekvencie kódujúce peptid, ako je vysvetlené vyššie. S výhodou DNA sekvencie sú uvedené v SEQ ID č. 4 a 6. '

Prítomný vynález tiež poskytuje expresné vektory obsahujúce DNA sekvencie, ako sú definované tu, kde vektory sú schopné vo vhodnom hostiteľovi, vyvolať expresiu DNA sekvencie za vzniku peptidov, ktoré sú vymedzené vyššie.

Expresný faktor zvyčajne obsahuje riadiace prvky DNA, ktoré pôsobia expresiou DMA sekvencie v príslušnom hostitelovi. Tieto prvky sa môžu meniť podía hostiteľa, ale zvyčajne zahŕňajú promotor, miesto viazajúče ribozóm, štartovacie a koncové miesta prenosu a transkripčné koncové väzbové miesto. Príklady takých vektorov zahŕňajú plazmidy a vírusy. Expresné vektory podía tohto vynálezu zahŕňajú ako extrachromozonálne vektory, tak aj vektory, ktoré sú integrované do bunkových chromozómov hostiteľa. Pri použití napr. E. coli môže expresný vektor obsahovať DNA sekvenciu podía tohto vynálezu prípadne ako fusovanú väzbu buď k 5 - alebo 3 -konci DNA sekvencie kódujúcej napr. β-galaktozidázu alebo k 3 -konci DNA sekvencie kódujúcej napr. trp E gén. Pri použití bakulovírusového systému (AcNPV) hmyzu je prípadne DNA ďekvencia pripojená k polyedrovej kódujúcej sekvencii.

Tento vynález sa tiež týka hostiteľovej bunky transformovanej expresnými vektormi, ktoré sú tu definované.

• ť·· ľ ;

i Príklady hostiteľových buniek vhodných na použitie podlá tohto vynálezu zahŕňajú prokaryotické a eukaryotické bunky, ako sú bunky baktérií, kvasiniek, cicavcov a hmyzu. Zvláštne príklady takých buniek zahŕňajú E. coli, S. cerevisiae, P. pastoris, bunky vaječníka čínskeho škrečka a myšie bunky a tiež Spodoptera frugiperda a Tricoplusia ni. Volba hostiteľovej bunky môže závisieť od okolností, ale pokiaľ je dôležitá posttransformačná modifikácia HCV vírusového peptidu, potom by sa mala dat prednosť eukaryotickému hostitelovi.

Tento vynález sa tiež týka spôsobu výroby peptidov, ktoré sú tu vymedzené, ktorý spočíva v tom, že sa izoluje DNA sekvencia, tu definovaná, z HCV genómu alebo syntetizuje DNA sekvencia kódujúca peptidy, tu vymedzená alebo vytvorí DNA sekvencia kódujúca peptid všeobecného vzorca I, zavedie sa DNA sekvencia do expresného vektora tak, že je schopný vo vhodnom hostiteľovi dosiahnuť expresiu, transformujú sa hostiteľove bunky expresným vektorom, kultivujú sa transformované hostiteľove bunky a izoluje sa peptid.

DNA sekvencia kódujúca peptid sa môže syntetizovať s použitím štandardných postupov (Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approac-h, Oxford, IRL Press /1984/).

Požadovaná DNA sekvencia, získaná ako je popísané vyššie, sa môže zaviesť do expresného vektora s použitím známych a štandi^rdných technických postupov. Expresný vektor sa zvyčajne odstrihne s použitím reštrikčných enzýmov a DNA sekvencia sa zavedie s použitím ligácie so zarovnaným koncom alebo s posunutým koncom. Strih sa zvyčajne uskutočňuje na reštrikčnom mieste v obvyklej polohe v expresnom vektore tak, že raz zavedené DNA sekvencie sú pod kontrolou funkčných prvkov DNA, čo spôsobí jeho expresiu.

Transformácia hostiteľovej bunky sa môže uskutočňovať s použitím šteindardných technických postupov. Zvyčajne sa používa určité fsnotypické označenie, na odlíšenie medzi transformantami, ktoré sa úspešne viazali na expresný vektor a transformantami, u ktorých k tomu nedošlo. Odstrihnutie transformovaných buniek hostiteľa, a podľa potreby izolácie peptidu, sa môže tiež uskutočňovať s použitím štandardných technických postupov.

Peptidy podľa tohto vynálezu sa môžu pripraviť syntetickými spôsobmi alebo rekombinantnou DNA technológiou. Peptidy sú s výhodou syntetizované s použitím automatických syntezátorov.

Protilátka špecifická pre peptidy podľa tohto vynálezu sa môže zvýšiť s použitím peptidu. Protilátka môže byt polyklonálna alebo monoklonálna. Protilátka sa môže použiť pri kontrolnom testovaní akosti šarže peptidov, čistení peptidu alebo vírusového lyzátu, epitopnom mapovaní, pokiaľ bolo uskutočnené označenie, ako konjugátu pri kompetitívnom type testu, na detekciu protilátky a pri detekčnom teste antigénu.

Polyklonálna protilátka proti peptidu podľa tohto vynálezu sa môže získať injekciou peptidu, podľa potreby viazaného na nosnú látku, na podporu imunitnej odozvy u cicavcov ako hostiteľa, ako v prípade myši, krysy, ovce alebo králika a získanie takto pripravovanej protilátky. Peptid sa zvyčajne podáva vo forme prostriedku na zavedenie injekciou, v ktorom je peptid zmiešaný s fyziologicky prijateľným riedidlom. Pomocná látka, ako je úplné Freudove adjuvants (FCA) alebo neúplné Freudove adjuvants (FIA), môže byt tiež*zahrnuté do prostriedku. Prostriedok sa zvyčajne zavádza injekciou hostiteľovi počas vhodného časového obdobia,

I pričom v príslušných intervaloch sa odoberajú vzorky plazmy pre test. anti-HCV^ŕvírusovej protilátky. Pokiaľ sči dosiahne vhodná úroveň ak.tivity, hostiteľ sa nechá vykrvácať. Protilátka 'sa potom extrahuje a vyčistí z krvnej plazmy s použitím štandardných technických postupov, napr. proteínom A alebo ióntomeničovou chromatografiou.

···

·. í.áV'är

Monoklonálna protilátka proti peptidu podľa tohto vynálezu sa môže získať fúziou buniek umŕtvenej bunkovej línie s bunkami, ktoré produkujú protilátku proti vírusovo alebo topograficky príbuznému peptidu a kultiváciou fúzovanej umŕtvenej bunkovej línie. Bežne sa peptidom naočkuje cicavec odlišný od človeka ako hostiteľ, napr. myš alebo krysa. Potom, keď uplynie dostatočná doba na zvýšenie hostiteľovej odozvy formou protilátky, odstránia sa bunky produkujúce protilátku, ako splenocyty. Bunky umŕtvenej bunkovej línie, ako bunkovej línie tvorenej myelomami myši alebo krysy, sa fúzujú s bunkami produkujúcimi protilátku a výsledná fúzia sa sleduje na identifikáciu bunkovej línie, ako hybridómu, ktorý spôsobuje sekréciu požadovanej monoklonálnej protilátky. Fúzovaná bunková línia sa môže kultivovať a monoklonálna protilátka vyčistiť od kultivačného prostredia podobným spôsobom, ako sa čistí polyklonálna protilátka.

Diagnostické testy založené na tomto vynáleze sa môžu použiť na stanovenie prítomnosti alebo neprítomnosti HCV infekcie. Tieto cesty sa môžu tiež používať na sledovanie výsledku ošetrenia takých infekcií, napr. pri interferónovej terapii.

Pri teste diagnózy vírusovej infekcie sú v zásade tri zreteľné prístupy, ktoré sa môžu prispôsobiť tak, aby zahrnuli detekciu vírusovej nukleovej kyseliny, vírusového antigénu alebo vírusovej protilátky. Na vírusové nukleové kyseliny sa zvyčajne pozerá ako na najlepší indikátor prítomnosti samotného vírusu a mali by sa pokladať za identifikačné materiály, ktoré sú pravdepodobne infekčné. Avšak detekcia nukleovej kyseliny nie je zvyčajne tak priamočiara, ako detekcia antigénov alebo protilátok, pretože úroveň cielovej látky môže byť velmi nízka. Vírusový antigén sa používa ako značkovacia látka na stanovenie prítomnosti vírusu a ako indikátor nákazlivosti. V závislosti od vírusu, množstvo antigénu prítomného vo vzorke môže byt veľmi nízke a obtiažne na stanovenie. Detekcia protilátky je relatívne priamočiara, pretože hostiteľov imunitný systém má rozšírenú odozvu na infekciu, ktorá vedie k produkcii veľkých množstiev cirkulujúcich protilátky. Charakter odozvy protilátky môže byť často klinicky vhodný, napr. protilátky zo skupiny IgM skôr ako zo skupiny IgG sú ukazovateľom novej infekcie alebo odozva na zvláštneho vírusového pôvodcu môže byť spojená s clearanciou vírusu. Presný prístup prispôsobený pre diagnózu vírusových infekcií závisí od zvláštnych okolností a zdroja informácií. V prípade HCV diagnostický test môže zahŕňať ktorýkoľvek z týchto troch prístupov.

Pri teste diagnózy HCV, obsahujúcom stanovenie vírusovej nukleovej kyseliny, spôsob môže zahŕňať hybridáciu vírusovej RNA prítomnej v testovanej vzorke alebo cDNA syntetizovanej z takej vírusovej RNA, s DNA sekvenciou zodpovedajúcou nukleotidovej sekvenc.i.;i SEQ ID č. 1, 4 alebo 6 alebo kódujúcim peptidom všeobecného vzorca I a vyšetria sa výsledné hybridy nukleovej kyseliny, na identifikáciu ľubovoľnej HCV vírusovej nukleovej Aplikácia tohto spôsobu je vzorku príslušného tkaniva, zvyčajne obmedzená na ako na biopsiu pečene, kyseliny. testovanú v ktorom vírusová RNA je pravdepodobne prítomná vo vysokej hladine. DNA sekvencia, zodpovedajúca nukleotidovej sekvencií SEQ ID č. 1, 4 alebo 6 alebo kódujúcemu peptidu všeobecného vzorca I, môže mať formu oligonukleotidu alebo cDNA sekvencie prípadne obsiahnutej s plazmidom. Vyšetrenie hybridov nukleovej kyseliny sa zvyčajne uskutočňuje s použitím označenej DNA sekvencie. Výhodne je peptid podľa tohto vynálezu časťou oligonukleotidu, v ktorom je označenie umiestnené v dostatočnej vzdialenosti od peptidu tak, že väzba peptidu k vírusovej nukleovej kyseline neinterferuje so schopnosťou označenia, ktoré nastávajú príliš blízko k väzbovému miestu. Môže sa uskutočniť aspoň jeden dodatočný rad vyšetrení jedného alebo iného druhu na charakterizáciu ďalších hybridov a tak identifikáciu ľubovoľnej HCV vírusovej¹nukleovej kyseliny. Stupne hybridácie a vyšetrenia sa uskutočňujú podľa spôsobov známych v obore.

Tento vynález tiež poskytuje testovaciu súpravu na detekciu HCV vírusovej nukleovej kyseliny, ktorá zahŕňa

i) označený oligonukleotid, ktorý obsahuje DNA sekvenciu zodpovedajúcu nukleotidovej sekvencii SEQ ID č. 1, 4 alebo 6 alebo kódujúci peptid všeobecného vzorca I a prípadne ii) premývacie roztoky, reakčné pufry a substrát, pokial značkovacou látkou je enzým.

Výhodne testovacia súprava tiež obsahuje pozitívnu kontrolnú vzorku na zjednodušenie identifikácie vírusovej nukleovej kyseliny.

Pri teste diagnózy IICV, obsahujúcom detekciu vírusového antigénu alebo protilátky, spôsob môže zahŕňať, uvedenie testovanej vzorky do styku s peptidom podlá tohto vynálezu alebo s polyklonálnou alebo monoklonálnou protilátkou proti peptidu a stanovenie, či je v testovanej vzorke obsiahnutá nejaká väzba antigén-protilátka. Na tento účel testovacia súprava môže byt opatrená peptidom, aký je tu vymedzený alebo polyklonálnou alebo monoklonálnou protilátkou a zariadením na stanovenie, či existuje nejaká väzba s protilátkou alebo antigénom obsiahnutým v testovanej vzorke. Testovaná vzorka môže byt vybratá z íubovolných príslušných tkanív a získaná z fyziologických tekutín spomenutých vyššie, na stanovenie vírusovej nukleotidovej kyseliny. Ak sa získa fyziologická tekutina, môže sa podlá potreby zahustiť na stanovenie lubovolného prítomného vírusového antigénu alebo protilátky.

Využitelnosť '

Môžu sa používať obmeny testovacej štruktúry. Peptid sa môže použiť na zachytenie selektívne pôsobiacej protilátky proti HCV z roztoku, na označenie už zachytenej selektívne pôsobiacej alebo v obidvoch týchto prípadoch a na označenie Okrem toho sa peptid môže používať v určitých typoch homogénnej testovacej štruktúry, v ktorých protilátka reagujúca s peptidom sa stanovuje v roztoku s neoddelenými fázami.

proti).átky protilátky.

Druhy testu, pri ktorých sa peptid používa na zachytenie protilátky z roztoku, zahŕňajú immobilizáciu peptidu na povrchu tuhej látky. Tento povrch by mal byt schopný nejakým spôsobom premytý. Príklady vhodných povrchov zahŕňajú polyméry rôznych typov (tvarované do mikrotitračných jamiek, guličiek, meracích tyčiniek rôznych typov, odsávacích ihiel, elektród a optických zariadení), častice (napr. latex, stabilizované červené krvné bunky, bunky baktérií alebo húb, spóry, zlato alebo iné kovové alebo kov obsahujúce soli a proteínové koloidy), s obvyklou veľkosťou častíc od 0,02 do 5 p.m membrány (napr. z nitrocelulózy, papiera, acetátu celulózy a membrány · z organických alebo anorganických materiálov, s vysokou peréznosťou a/alebo velkou plochou povrchu).

Viazanie peptidu na povrchu sa môže dosahovať pasívnou adsorbciou z roztoku optimálneho zloženia, ktorý môže obsahovať povrchovo aktívne látky, rozpúšťadlá, soli a/alebo chaotropné látky alebo aktívnym chemickým viazaním. Pod aktívnym viazaním sa rozumie zmena reaktívnych alebo aktivovateľných funkčných skupín, ktoré môžu byt vystavené účinku na povrchu (napr. kondenzačných činidiel, aktívnych esterov, halogenidov a anhydridov kyselín, v látkach obsahujúcich aminoskupiny, hydroxyskupiny alebo karboxyskupiny, merkaptoskupiny, karbonylové skupiny, diazoskupiny alebo nenasýtené skupiny). Pod aktívnym viazaním sa prípadne môže rozumieť väzba cez proteín (samotný, pripojený na povrchu pasívne alebo aktívnou väzbou), ako je albumín alebo kazeín, ku ktorému vírusový peptid môže byt chemicky viazaný lubovolr.ým z rôznych spôsobov. Použitie proteínu týmto spôsobom • * , sa môže ukázat ako výhodné, pre izoelektrický bod, náboj, hydrofilnost alebo iné fyzikálne chemické vlastnosti. Vírusový peptid môže byt tiež pripojený na povrch (zvyčajne ale nie je potrebná membrárfa), s nasledujúcim elektrof oréznym delením reakčnej zmesi, rovnako ako imunoprecipitáciou.

Po kontaktovaní (zreagovaní) povrchu nesúceho peptid s testovanou vzorkou sa všetko nechá určitú dobu na prebehnutie reakcie a pokiaľ je potrebné, odstráni sa prebytok vzorky niektorým z možných riešení (ako premývaním, odstreďovaním, filtráciou, magnetickým pôsobením alebo účinkom kapiláry) a zachytená protilátka sa stanoví na ľubovoľnom zariadení, ktoré poskytne signál schopný detekcie. Napríklad toto možno dosiahnuť s použitím označenej molekuly alebo častice ako je popísaná vyššie, ktorá bude reagovať so zachytenou protilátkou (napr. proteínom A alebo proteínom G a pod., anti-speciom alebo podtypom anti-imunoglobulínu, reumatiódnym faktorom alebo protilátkou k peptidu, s použitím kompetitívneho alebo blokujúceho spôsobu) alebo ľubovoľnej molekuly obsahujúcej epitop obsiahnutý v peptide.

Signál schopný detekcie môže byt optický, rádioaktívny alebo fyzikálne chemický a môže byt poskytnutý priamo označenou molekulou alebo časticou, napr. účinkom farbiva, rádioaktívneho označenia, elektroaktívneho druhu, magnetickej rezonančnej analýzy alebo fluóroforu alebo nepriamo označením molekuly alebo častice enzýmom samotným schopným zvýšiť merateľnú zmenu ľubovoľného druhu. Podľa iného uskutočnenia signál schopný detekcie sa môže získať napr. s použitím aglutinácie alebo difrakciou alebo účinkom spôsobujúcim dvojlom, pokiaľ povrch je vo forme častíc.

ktorá umožní, aby bola priamo chemicky alebo

Testy, pri ktorých sa samotný peptid používa na označenie už zachytenej protilátky, vyžadujú určitú formu označenia peptidu, stanovená. Označenie sa môže uskutočňovať pasívnym pripojením, napr. rádioaktívnym označením, magnetickým rezonančnýln druhom označenia, označením častice alebo enzýmu peptidom alebo nepriamo, viazaním ľubovoľnej formy označenia na molekulu, ktorá bude sama reagovať s peptidom. Chemické viazanie označených častí na peptid môže byť nepriame, cez časť už prítomnú v peptide, ako cez aminoskupinu alebo cez intermediárnu časť, ako je melamínová skupina. Zachytenie protilátky môže prebehnúť na ľubovoľných povrchoch už spomenutým ľubovoľným reakčným činidlom, zahrňujúcim pasívnu alebo aktivovanú adsorbciou, ktorá bude pôsobiť v špecifickej protilátke alebo ich výsledkom bude špecifická protilátka alebo viazaný imunokomplex. Predovšetkým viazanie protilátky by nastalo pôsobením anti-species alebo podtypu anti-imunoglobulínu, reumatiódneho faktora alebo proteínu A, G a pod. alebo lubovolnej molekuly obsahujúcej epitop obsiahnutý v peptide.

Označený peptid sa môže použiť pri kompetitívnom spôsobe viazania, pri ktorom je viazanie k ľubovoľnej zvláštnej molekule, na niektorom z povrchov uvedených formou príkladov vyššie, ^blokované antigénom vo vzorke. Podľa iného uskutočnenia sa môže použiť nekompetívny spôsob, pri ktorom antigén vo vzorke je viazaný špecificky alebo nešpecifický na niektorom z povrchov uvedených vyššie a je tiež viazaný k bivalentnej alebo polyvalentnej molekule (napr. protilátke) so zvyšnými valenciami, ktoré sú použité na zachytávanie označeného peptidu.

Často pri homogénnych testoch peptid a protilátka sú oddelene označené tak, že pokial protilátka reaguje s rekombinantným vo voľnom roztoku, obidve označené látky navzájom aby sa dosiahol napr. nerádioaktívny prenos energie, na jednej označenej látke, na druhú označenú látku detekciou z excitovaného druhého označenia alebo ukončenia prvého označenia (napr.

magnetickou rezonanciou alebo meraním enzýmu). vírusový peptid, tak protilátka vo výsledných vzorkách má za výsledok omedzenú interakciu označeného páru a tak rozdielnu úroveň signálu v detektore.

peptidom reagujú,, zachytenej s vhodnou rýchleho fluórimetricky, Okrem toho ako

Vhodná testovacia formácia pre detekciu HCV protilátky je priama sendvičová formácia enzýmu pre imunologické stanovenie poťahuje na mikrotitračné jamky. Testovaná ku ktorému je enzým viazaný, sa pridávajú súčasne. Ktorákoľvek HCV protilátka prítomná v testovanej vzorke sa viaže ako k peptidu poťahujúcemu jamku, tak k peptidu viazanému s enzýmom. Zvyčajne sa používajú rovnaké peptidy na (EIA). vzorka

Peptid sa a peptid, j obidvoch stranách sendviča. Po premytí sa viazaný enzým stanoví ; priamo s použitím špecifického substrátu, čo je spojené so zmenou farby. Testovacia súprava na použitie v EIA zahŕňa:

!

1) peptid, ktorý je tu definovaný, označený enzýmom, j

2) substrát pre enzým,

3) prostriedok opatrený povrchom, na ktorom je peptid imobilizovaný a prípadne

4) premývacie roztoky a/alebo pufry.

Je tiež možné používať systém ELISA na zachytávanie IgG/IgM protilátky, v ktorom je anti-ludská protilátka potiahnutá na jamkách s objemom v mikrolitroch a testovaná vzorka sa pridáva do jamky. Akákolvek IgG alebo IgM protilátka prítomná v testovanej vzorke sa bude potom viazať k anti-íudskej protilátke. Peptid podía tohto vynálezu, ktorý je označený, sa pridá do jamky a peptid sa bude viazať k lubovolnej IgG alebo IgM protilátke, čo je spôsobené v dôsledku HCV infekcie. IgG alebo IgM protilátka sa môže vizualizovat účinkom označenia na peptide.

Tak môže byť zrejmé, že peptidy podía tohto vynálezu sa môžu používať na detekciu HCV infekcie v mnohých štruktúrach, teda voíných peptidoch, pri testoch vrátane kompetičnej ELIS.A, membránovo viazanej EIA zrážania. Peptidové konjugáty sa môžu používať pri rozšírených testoch a ELISA zachytávajúca IgG/IgM protilátku.

klasickej ELISA, a imunologického

Peptid. podía tohto vynálezu sa prostriedku na vyvolanie imunity na peptid môže byt prítomný spoločne nosnou látkou.

môže vpraviť do vakcínového HCV u človeka. Na tento účel s farmaceutický prijateínou

Na použitie vo vakcínovom prostriedku, peptid môže byť prípadne prítomný ako časť častice z jadrovej fúzie hepatitídy B, ako popísal Čiarke a kol. (Náture 330, 381-384 /1987/) alebo polymér na báze polylyzínu, ako popísal Tam (PNAS 85, 5409-5413 /1988/). Podlá iného uskutočnenia sa môže prípadne peptid pripojiť ku štruktúre častice, ako sú lipozómy alebo ISCOMS.

Farmaceutický prostredie vhodné zavedenie peptidu prijateľné nosné látky zahŕňajú kvapalné na použitie ako pomocná látka (vehikulum), na do tela pacienta. Príkladom takého kvapalného prostredia je fyziologický roztok (roztok chloridu sodného). Peptid sa môže rozpustiť alebo suspendovať ako tuhá látka v nosnej látke.

Vakcínový prostriedok môže tiež obsahovať pomocnú látku (adjuvants) na stimuláciu imunitnej odozvy a tým zvýšenie účinku vakcíny. Príklady adjuvants zahŕňajú hydroxid hlinitý a fosforečnan hlinitý.

Vakcínový prostriedok môže obsahovať peptid v konečnej koncentrácii, ktorá je v rozsahu od 0,01 do 5 mg/ml, výhodne od 0,03 do 2 mg/ml. Vakcínový prostriedok sa môže vniesť do sterilného zásobníka, ktorý sa potom vzduchotesne uzavrie a skladuje pri nízkej teplote, napr. pri 4 °C alebo sa môže lyofilizovať.

Za účelom vyvolania imunity u človeka voči HCV sa môže podať jedna dávka alebo väčší počet dávok vakcínového prostriedku. Každá dávka môže mat objem od 0,1 do 2 ml, s výhodou od 0,2 do 1 ml. Spôsob vyvolania imunity u človeka voči HCV zahŕňa podanie účinného množstva vakcínového prostriedku, ako to bolo vymedzené vyššie.

Tento vynález tiež poskytuje použitie peptidu, ktorý je tu vymedzený, pri príprave vakcíny na použitie pri vyvolaní imunity u človeka voči HCV.

Vakcíny podľa tohto obvyklým spôsobom na a parenterálneho (napr.

vynálezu sa môžu podávať ľubovoľným podávanie vakcín, vrátane orálneho intravenózneho, subkutánneho alebo intramuskulárneho) podania v injekcii. Ošetrenie môže pozostávať z jedinej dávky vakcíny alebo väčšieho počtu dávok počas určitého časového obdobia.

V sekvenčnom zázname sú zahrnuté SEQ ID č. 1 až 29, na ktoré sa odvoláva v popise a patentových nárokoch.

Prílvlady uskutočnenia vynálezu

Uskutočnenia tohto vynálezu budú teraz ilustrované.

Príklad 1

Identifikácia epitopnej sféry HCV jadra proteínu

N-Terminálny 97 aminokyselinový zvyšok HCV jadra proteínu SEQ ID č. 8 sa mapuje analýzou PEPSCAN. Tento proces zahŕňa serologické analýzy sekvenčne prekrývajúcich sa peptidov, u ktorých trvá oblasť záujmu, na identifikáciu epitopnej sféry. Deväťdesiat prekrývajúcich sa oktamérnych peptidov sa syntetizuje na polypropylénových nosičoch charakteru hrotu (pin supports) podľa inštrukcií výrobcu (Cambridge Research Biochemicals) tak, že každý peptid sa prekrýva s predchádzajúcou sekvenciou siedmimi N-koncovými zvyškami a s nasledujúcim peptidom siedmimi C-koncovými zvyškami. Sérum alebo IgG čistený zo séra jednotlivcov potvrdzuje, že sú séropozitívne na HCV použitie na vyšetrenie peptidov.

i

Príklad 2

Vyšetrenie peptidov

Skúšobný postup sa uskutočňuje v zásade ako je popísané v manuále získanom ako inštrukcia od výrobcu. Doba a teplota inkubácie testovanej protilátky sa odlišujú od predpísaných údajov, pričom sa skracuje doba adsorbcie pri každom teste.

Sérum

Celkovo sa testuje 16 sér pomocou analýzy PEPSCAN. Tie pozostávajú z 12 sér zakúpených v U.S. Donors, u ktorých sa zistilo, že sú pozitívne na protilátky voči HCV, pri obvyklom vyšetrení na mieste získania. Zvyšné štyri séra sú od pacientov, u ktorých bola stanovená diagnóza, že majú ne-A a ne-B hepatitídu a u ktorých sa následne ukazuje, že obsahujú protilátku k HCV. Séra sa ^: vyšetrujú buď ako frakcia surového séra alebo ako prípravok na báze kyseliny kaprylovej. Čistenie kyseliny kaprylovej z IgG zo séra sa uskutočňuje tak, ako popisuje Stienbuch a Audran v Árch. Biochem. Biophys. 134, 279-284 /1969/).

Test

Testovacia štruktúra zahŕňa sekvenčné inkubovanie rôznych hrotov v mikrojamkových doskách obsahujúcich blokujúcu testovanú protilátku, konjugát a substrátové roztoky. Imunulogický komplex sa vytvorí na hrote s konjugátom označeným enzýmom, kde konjugát je imobilizovaný na väzbe antipeptid-protilátka z testovaného séra. Pokiaľ sa hrot potom ponorí do substrátu, enzým zmení farbu, čo sa použije na stanovenie množstva väzieb antipeptid-protilátka.

Blokovanie

Hroty sa ponoria do 200 μΐ superkoktailu (1 % ovalbumínu, 1 % hovädzieho sérového albumínu v 0,15-molárnom fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom, s hodnotou pH 7,2 a 0,1 % Tween 20) a nechajú stáť pri laboratórnej teplote počas 1 hodiny.

Testovaná protilátka

Testovaná protilátka sa zriedi od 1:200 (IgG) do 1:1000 (sérum) superkoktailom. I-Iroty sa potom nechajú štát v tomto roztoku (175 μΐ na jamku) pri teplote 37 °C počas 1 hodiny. Po tejto inkubácii sa hroty štyrikrát premyjú 0,15-molárnym fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom, s hodnotou pH 7,2 a 0,05 % Tween 20, vždy pri laboratórnej teplote počas 10 minút.

Konjugát

Králičí anti-ludský IgG kopulovaný s peroxidázou z chrenu sedliackeho sa zriedi v pomere 1:1000 superkoktailom. Peptid nesúci hroty sa potom nechá stáť v tomto roztoku pri laboratórnej teplote počas 1 hodiny. Hroty sa potom znovu štyrikrát premyjú, ako je uvedené vyššie.

Substrát

Roztok substrátu sa pripravuje čerstvý pre každý test. Do 100 ml 0,1-molárneho fosfátu sa pridá 0,08-molárny citrátový tlmivý roztok s hodnotou pH 4,0 rozpustený v 50 mg kyseliny

2,2 -azino-bis(3-etylbenztiazolínsulfónovej) (ABTS) a 0,3 μΙ/ml 30 % peroxidu vodíka. Hroty sa ponoria do jamiek obsahujúcich roztok substrátu (150 μΐ na jamku) a inkubujú pri laboratórnej teplote v tme. Potom keď sa vytvorí dostatok farby, reakcia sa zastaví odstránením hrotov. Dosky sa potom hneď odčítajú v zariadení _t pa vyhodnocovanie spektometrických dosiek, pri vlnovej dĺžke 405 nm. Hodnoty absorbancie sa potom vynesú v závislosti na počte hrotov. Epitopná sféra sa potom definuje ako kontinuálna sekvencia aminokyselín všeobecne ku všetkým pozitívnym hrotom vo sfére, t.j.

pozitívny hrot 1 Gly-Val-Tyr-Leu~Leu-Pro-Arg-Arg (SEQ ID č. 9) (GVYLLPRR)

·: '.Γ λ'Λ''

pozitívny hrot 2 Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly (SEQ ID č. 10) (V Y L L P R R G) pozitívny hrot 3 Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-Pro (SEQ ID č. 11) (Y L L P R R G P)

V tomto príklade má epitop sekvenciu Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg (YLLPRR) (SEQ ID Č. 1 a 2).

Čistenie

Po použití sa hroty čistia pôsobením ultrazvuku v prerušovanom tlmivom roztoku (1 % dodecylsulfonátu sodného a 0,1 % 2-merkaptoetanolu v 0,1-molárnom dihydrogénfosforečnane sodnom) zohriatym na teplotu 60 °C. Hroty sa vystavia pôsobeniu ultrazvuku na dobu 30 minút a potom dvakrát premyjú v destilovanej vode pri teplote 60 °C a jedenkrát vo vriacom metanole. Hroty sa potom uložia pri laboratórnej teplote vzduchotesne uzavreté vo vreckách obsahujúcich silikagel alebo sa môžu hneď použiť pri nasledujúcom teste.

U niekolkých sfér v N-koncovej oblasti HCV jadra proteínu sa takto zistí, že sú epitopné. Jedna z týchto oblastí, epitop imunologickej sféry, sa stanoví vo väčšom alebo menšom rozsahu u všetkých testovaných sér. Epitop imunologickej sféry je situovaný vo zvyškoch 35 až 40 jadra proteínu, ktoré má aminokyselinovú sekvenciu Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg (YLLPRR) SEQ ID č. 1 a 2. Výsledky skúšok vzoriek sú uvedené v tabuľke 1.

•j ί

Tabulka 1

Jednotky absorbancie pre odlišné séra

Peptid	SEQ ID č.	65221	65241	65276	65234	L
GGGQIVGG	12	137	121	127	134	121
GGQIVGGV	13	323	122	119	179	119
GQIVGGVY	14	' 216	112	128	165	138
QIVGGVYL	15	329	125	165	^: 152	161
IVGGVYLL	16	268	126	183	186	158
VGGVYLLP	17	83	144	182	235	169
GGVYLLPR	18	132	311	246	344	191
GVYLLPRR	19	613	511	350	229	378
VYLLPRRG	20	769	641	440	280	306
YLLPRRGP	21	332	367	248	17 7	242
LLPRRGPR	22	142	129	98	101	133
LPRRGPRL	23	97	94	139	145	148
PRRGPRLG	24	85	73	129	109	110
RRGPRLGV	25	145	85	150	146	123
RGPRLGVR	26	168	94	167	99	132
GPRLGVRA	27	111	60	146	75	101
PRLGVRAT	28	166	79	155	88	115
RLGVRATR	29	81	180	177	100	124

Aminokyselinové zvyšky jednotlivými písmenami (Eur Podčiarknuté charakteristiky sféry.

sú označované kódom tvoreným J. Biochem. 138, 9-37 /1984/).

predstavujú oblasť imunologickej

I

Príklad 3

Spôsob prípravy novej látky napodobňujúcej pôvodný epitop

Substitučný spôsob sieťovania (replacement net method) sa použije na sekvenčnú náhradu zložiek aminokyselinových zvyškov v epitope s každou z iných geneticky zakódovaných aminokyselín.

Pre analýzu substitučného sieťovania základnej sekvencie vstúpi do Software (Epitope Mapping Software), poskytnutého Cambridge Research Biochemicals a vytvorí · sa súbor substituovaných peptidov. Tento proces sa uskutočňuje pre šesť aminokyselinových zvyškov imunologickej sféry jadra epitopu HCV. Peptidy sa syntetizujú na polypropylénových hrotoch, podlá pokynov výrobcu (Cambridge Research Biochemicals). Skúšobná štruktúra je rovnaká ako je uvedená vyššie pre PEPSCAN.

Uvažuje sa so substitučným sieťovaním jadra v imunologickej sfére epitopovej sekvencie Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg (YLLPRR) (SEQ ID č. 1 a 2) pomocou 12 platených darcov ludského séra, ako je popísané vyššie.

Pre každú polohu v epitope je daná frekvencia každej substitúcie zvyšku ako substitúcie prijateľnej pre základnú sekvenciu. Substituované zvyšky sa pokladajú za prijateľné, pokiaľ signál nového peptidu je 80 % základnej sekvencie alebo je väčší.

Na základe týchto výsledkov, sa získajú substituované aminokyselinové zvyšky pre každú polohu, ktoré sú uvedené v tabuľke 2. Zvyšky uvedené kurzívou sa týkajú základnej sekvencie.

Tabuľka 2

Základný	Amino-	Frekvencia	sily	relatívneho	signálu	(n=12)
zvyšok	kyselina	najvyššia	2 až	5 6 až 10	nad 10	celková
1-tyrozín	D	1	8	1	0	10
	E	2	8	1	0	11
	I	0	3	7	0	10
	L	7	1	1	0	9
	Y	2	3	5	1	11
2-leucín	C	2	8	1	0	11
	D	6	4	0	0	10
	E	1	6	4	0	11
	L	1	2	3	2	8
3-leucín	L	2	0	1	0	3
	V	6	5	0	0	11
4-prolín	M	4	5	0	0	9
	P	3	1	1	0	5
5-arginín	C	0	8	2	0	10
	D	4	5	1	1	11
	E	2	4	3	1	10
	F	0	2	7	3	12
	M	0	2	2	6	10
	N	0	0	6	5	11
	P	1	5	4	1	11
	Q	2	6	2	0	10
	P	0	! 2	1	7	10
6-arginin	c	0	4	0	6	10
	D	3	2	3	2	10
	E	1	6	2	1	10
	P	2	1	5	3	11
	S	3	5	1	1	10

' *

2

Príklad 4

Spôsob prípravy AC 2 2

Úplne chránená peptidová živica sa zostaví na p-hydroxymetylfenoxymetylovej (HMP) živici postupnou syntézou v tuhej fáze (spracovaním od karboxylového koncového zvyšku smerom k zvyšku tvorenému koncovou aminoskupinou) podľa všeobecného postupu uvedeného v Applied Biosystems User Bulletin, č. 33 /november 1990/. HMP živica sa prenesie do reakčnej nádoby (Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 431Λ). Aminokyselinový zvyšok s koncovými karboxyskupinami sa kopuluje na živici s použitím štandardného postupu popísaného v popise spôsobu výroby Applied Biosystems Fastmoc Cycle Protocol. Nezreagované kopulujúce miesta na živici sa potom blokujú tým, že sa chránia anhydridom kyseliny benzoovej. Všetky nasledujúce aminokyseliny sa potom pridávajú postupným spôsobom, pričom sa pohybuje od konca obsahujúceho karboxyskupinu ku kuncu tvorenému aminoskupinou, s použitím výrobného postupu Applied Biosystems Fastmoc Cycle Protocol. Ν-α-ľnninoskupina u všetkých peptidov je chránená väzbou s 9-fluórfenylmetoxykarbonylovou (Fmoc) skupinou. Bočné reťazce funkčných skupín príslušných aminokyselín sú chránené týmito skupinami:

Cys-Trt (trityl)

Gly-Trt (trityl)

Tyr-tBu (terc.-butyl)

Arg-Pmc (2,2,5,7,8-pantametylchromán-6-sulŕonyl).

t

Úplne chránená peptidová živica sa prenesie do flaše tvaru hrušky a spracuje si 0,25 ml etánditiolu, 0,5 ml tioanizolu, 0,5 ml vody a 8,75 ml kyseliny trifluóroctovej. Zmes sa mieša pri laboratórnej teplote počas 90 minút a potom filtruje cez sklenenú vlnu v Pasteurovej pipete. chladného éteru, obsiahnutého načo sa peptid vyzráža. Obsah odsáva, čím sa v skúmavke premyje éterom (s použitím

Filtrát sa nakvapka dó ladovo v odstredivkovej skúmavke Corex, skúmavky sa odstred'uje a kvapalina získajú pelety peptidu. Peptid sa špachtle na odstránenie agregácie

Λ;

peliet) a peptid sa získa celkom šesťkrát. Peptid zníženom tlaku.

odstreďovaním. Tento postup sa opakuje sa nakoniec suší odstreďovaním pri

Príklad 5

Vakcínový prostriedok

Vakcínový prostriedok sa môže pripraviť obvyklým technickým postupom s použitím ďalej uvedených zložiek v danom množstve.

HCV vírusový peptid (buď samotný ako ďalší polypeptid alebo s koktailom z iných peptidov)

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. HCV vírusový peptid, ktorý obsahuje sekvenciu

Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg (SEQ ID č. 1 a 2)
2. Peptid obsahujúci sekvenciu všeobecného vzorca I ^Xl^X2~^X3^_X4^_X5^X6 ' (SEQ ID Č.3) (I), v ktorom

Χγ predstavuje tyrozín, kyselinu asparágovú, kyselinu glutamovú, leucín alebo izoleucín,

X₂ predstavuje leucín, cysteín, kyselinu asparágovú alebo kyselinu glutamovú,

X-j znamená leucín alebo valín,

X₄ znamená prolín alebo metionín,

X₅ znamená arginín, kyselinu asparágovú, kyselinu glutamovú,. prolín, cysteín, fenylalanín, izoleucín, asparagín, glutamín alebo metionín a

X₆ predstavuje arginín, kyselinu asparágovú, kyselinu glutamovú, serín alebo cysteín, i

a kde peptid nezodpovedá všeobecnému vzorcu

Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg (SEQ ID č. l a 2).
3. Vírusový peptid, ktorý je vysvetlený v SEQ ID č. 4a 5 alebo

SEQ ID č. 6 a 7.
4. DNA sekvencia kódujúca peptid podía nároku 1, 2 alebo 3.
5. DNA sekvencia podía nároku 4, ktorá je vysvetlená v SEQ ID č. 1, 4 alebo 6.
6. Expresný vektor obsahujúci DNA sekvenciu podía nároku 4 alebo 5, ktorý je schopný, vo vhodnom hostiteíovi, vyvolať expresiu DNA sekvencie počas vzniku peptidov.
7. Hostiteíova bunka transformovaná expresným faktorom podía nároku 6. ·
8. Spôsob prípravy peptidu podía niektorého z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že sa izoluje DNA sekvencia vysvetlená v SEQ ID č. 1, 4 alebo 6 z HCV genómu alebo syntetizuje DNA sekvencia kódujúca peptidy vysvetlená v SEQ ID č. 1, 4,6 alebo vytvorí DNA sekvencia kódujúca peptid všeobecného vzorca I, zavedie sa DNA sekvencia do expresného vektora tak, že je schopný vo vhodnom hostiteíovi dosiahnuť expresiu, transformuje sa hostiteíova bunka expresným vektorom, kultivuje sa transformovaná hostiteíova bunka a izoluje sa peptid.
9. Spôsob prípravy peptidu podía niektorého z nárokov l až 3, vyznačujúci sa tým, že sa pripravuje synteticky.
10. Polvklonálna alebo monoklonálna protilátka proti peptidu podía niektorého z nárokov 1 až 3.

;
11. Spôsob detekcie HCV vírusovej ¹ nukleovej kyseliny, vyznačujúci sa tým, že sa hybriduje vírusová RNA prítomná v testovanej vzorke alebo cDNA syntetizovaná ;· z takej vírusovej RNA, s DNA sekvenciou zodpovedajúcou SEQ ID

č. 1, 4 alebo 6 alebo kódujúcim peptidom všeobecného vzorca la vyšetria sa výsledné hybridy nukleovej kyseliny, na ) identifikáciu íubovoínej HCV vírusovej nukleovej kyseliny.

t.
12. Spôsob detekcie HCV vírusovej protilátky, vyznačujúci sa t ý m, že sa uvedie testovaná vzorka do styku s peptidom podlá niektorého z nárokov 1 až 3 alebo s polyklonálnou alebo monoklonálnou protilátkou podlá nároku 10 a stanoví sa, či je v testovanej vzorke obsiahnutá nejaká väzba antigén-protilátka.
13. Testovacia súprava na detekciu HCV vírusovej protilátky, vyznačujúca sa tým, že obsahuje peptid podlá • niektorého z nárokov 1 až 3 alebo polyklonálnu alebo * monoklonálnu protilátku podlá nároku 10 a prostriedok na stanovenie, či je v testovanej vzorke obsiahnutá nejaká väzba antigén-protilátka.
14. Vakcínový prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje peptid podlá niektorého z nárokov 1 až 3 spolu s farmaceutický prijateľnou nosnou látkou.

Spôsob vyvolania imunity u človeka voči HCV, vyznačujúci sa tým, že sa podáva účinné množstvo vakcínového prostriedku pódia nároku 14.