SE528118C2 - Förfarande för klassificering av växtembryon genom användning av straffad logistisk regression - Google Patents

Description

528 118 2 gen placeras de omogna embryona på ett utvecklingsmedium, där de är avsedda att växa till somatiska analoger av mogna fröembryon. Det i föreliggande beskrivning använda uttrycket "somatiskt" embryo är ett växtembryo som ut- vecklats genom laboratorieodling av totipotenta växt- celler eller genom inducerad klyvningspolyembryogenif till skillnad från ett zygotiskt embryo, som är ett växt- embryo som avlägsnats från ett frö av motsvarande planta.

Dessa embryon selekteras därefter individuellt och place- ras på ett groningsmedium för ytterligare utveckling.

Alternativt kan embryona användas i artificiella frön, även kända som tillverkade frön.

Det finns nu en stor mängd allmän teknisk litteratur och en växande mängd patentlitteratur rörande embryogenes av växter. Exempel på förfaranden för barrträdsvävnads- odling finns i USA-patentskrifterna nr 5 036 007 och 5 236 841 i namnet Gupta et al, 5 183 757 i namnet Roberts, 5 464 769 i namnet Attree et al och 5 563 061 i namnet Gupta. Vissa exempel på tillverkade frön finns dessutom i USA-patentskriften nr 5 701 699 i namnet Carlson et al, vars beskrivning här är uttryckligen in- förlivad som referens. Sammanfattningsvis bildas ett typiskt tillverkat frö med utgångspunkt från ett fröhölje (eller en kapsel) tillverkad av ett flertal material, så- som cellulosamaterial, varefter fröet fylls med en synte- tisk gametofyt (ett groningsmedium), i vilket ett embryo omgivet av en rörliknande begränsning mottages. Efter det att det tillverkade fröet har planterats i jord, utveck- lar embryot inuti fröhöljet rötter och förskjuter slut- ligen begränsningen tillsammans med fröhöljet under gro- ning.

Ett av de mest insatskrävande och subjektiva stegen vid embryogenesförfarandet är den selektiva skörden från utvecklingsmediet av individuella embryon som är lämpliga för groning (t ex lämpliga för införlivning i tillverkade frön). Embryona kan föreligga i ett antal mognads~ och utvecklingsskeden. De som har störst sannolikhet för att ~ *OfYVøíYiERHIaBESER 'läßlfillâi-i Apfsí.icaLierttezlzïfalzwstrucftfiu: Om! ílÜf:-.";=-1T.=1.- 10 15 20 25 30 35 528 118 3 framgångsrikt gro till normala plantor väljs företrädes- vis genom användning av ett antal visuellt utvärderade selektionskriterier. En fackman på omrâdet utvärderar de morfologiska egenskaperna hos varje embryo inbäddat i utvecklingsmediet, såsom embryots storlek, form (t ex axiell symmetri), hjärtbladsutveckling, yttextur, färg etc, och väljer de embryon som uppvisar önskvärda morfo- loga egenskaper. Detta arbete kräver skicklighet, men är ändå omständligt, tids- och kostnadskrävande. Det medför dessutom en betydande produktionsflaskhals när det slut- liga önskade utbytet rör sig om miljontals plantor. _ Det har föreslagits att använda en viss form av instrumentell bildanalys för embryoselektion för att understödja eller ersätta den ovan beskrivna visuella utvärderingen och klassificeringen. I den internationella patentansökan PCT/US99/12128 (WO 99/63057), som explicit är införlivad som referens här, beskrivs t ex en metod för klassificering av somatiska embryon baserade på bild- er av embryon eller spektral information erhàllen från embryon. I allmänhet utvecklar metoden en klassificer- ingsmodell (eller "en klassificerare") baserad på digi- taliserade bilder eller NIR(nära infraröd)-spektraldata av embryon med känd embryokvalitet (t ex potential att gro och växa till normala plantor, såsom utvärderats genom verklig plantering av embryon och en uppföljande studie av densamma eller genom morfologisk jämförelse med normala zygotiska embryon). En "klassificerare" är ett system som identifierar ett invärde genom igenkänning av att invärdet är en medlem av en eller ett flertal möjliga klasser. Klassificeraren appliceras således på bild- eller spektraldata från ett embryo av okänd kvalitet för klassificering av embryot enligt dess förmodade embryo- kvalitet.

Olika klassificeringsmodeller, eller klassificerare, är tillgängliga, såsom Fishers linjära och kvadratiska diskriminantfunktioner, klassificeringsträd, modellen för anhopning av de k närmaste grannarna ("k-nearest- ' I-.Etlräßš .Ai-SLI šapplicsationlïeztïnïns=tzmxftoz GRK :Iz1šz5--f,-_1.~- 10 15 20 25 30 35 528 118 4 neighbors clustering“), neurala nätverk och SIMCA. Samt- liga av dessa modeller har med framgång använts vid flera tillämpningar, men har visat sig underskrida förväntning- arna vid klassificering av embryon, eftersom de antingen inte är tillräckligt snabba, eller så uppfyller inte er- hållna data om embryona kraven för att dessa klassificer- are skall fungera.

I PCT/US99/12128 (WO 99/63057), införlivad ovan, beskrivs en embryoklassificerare genom användning av en Lorenz-kurva och en optimal klassificerare av typ Bayes, benämnd klassificerare av typ "Lorenz-Bayes". I den sam- tidigt behandlade provisoriska USA-ansökan nr 60/507 631, inlämnad den 30 september 2003 med sama sökandenamn, beskrivs en generaliserad form av klassificerare av typ Lorenz-Bayes för klassificering av växtembryon. Även om dessa metoder har varit framgångsrika vid snabb och nog- grann klassificering av embryon alltefter deras embryo- kvalitet, föreligger ett fortsatt behov av ytterligare ökning av klassificeringshastigheten och -noggrannheten i syfte att uppnå den massklassificering som krävs för massproduktion av tillverkade fröer. Föreliggande upp- finning tillgodoser detta fortsatta behov.

Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfinning hänför sig till klassifice- ring av växtembryon genom tillämpning av klassificerings- algoritmer på digitaliserade bilder och/eller data som är relaterade till eller baserade på absorptions-, transmit- tans-, reflektans- eller excitationsspektra för embryona. Även om klassificeringsmetoderna enligt uppfinningen tillämpas på bildinformation- och spektralinformation inhämtad fràn embryon, hänför sig inte uppfinningen till eller är begränsad till någon särskild metod för inhämt- ning av bild- eller spektralinformation. Förfarandena kan faktiskt tillämpas pà bild- och spektralinformation in- hämtad med basis på ett flertal tekniker, som för närvar- ande är tillgängliga och som kan utvecklas i framtiden, inkluderande relativt sett mer komplexa tekniker, såsom 'ER 4 apr/l1ca:1-:ntextTc=lnstrucrtax' SBK 10 15 20 25 30 35 528 r1ii18 5 avbildning från flera betraktelsepunkter (t ex avbildning från en ovanvy, sidovy och ändvy av ett embryo), aVbild' ning i färg, avbildning genom användning av ej Synlí9a delar av det elektromagnetiska spektrat, avbildning genom användning av fluorescerande proteiner och/eller kvant- punktmarkörer för specifika molekyler och avbildning genom användning av energitillförsel till embryon i syfte att förmå vissa molekyler, vävnader eller organ att emittera särskilda energier, som kan detekteras. Bild- eller spektraldata kan erhållas från hela växtembryon eller en eller flera delar därav.

En klassificeringsmodell utvecklas med basis på digitala bild- eller spektralràdata från referensprover av växtembryon med känd embryokvalitet. Embryokvaliteten för referensproverna kan bestämmas med basis på embryots omvandlingspotential, resistens mot patogener, torkresi- stens och liknande, såsom utvärderas med hjälp av verklig plantering av embryona och en uppföljningsstudie av den- samma, eller genom morfologisk jämförelse av embryona med normala zygotiska embryon. Eventuellt kan dessa digitala eller spektrala ràdata bearbetas i förväg genom använd- ning av en eller flera förbearbetningsalgoritmer för reduktion av mängden av bild- eller spektralrådata, var- efter en eller flera mätstandarder ("metrics") beräknas med utgångspunkt från dessa digitala eller spektrala rà- data eller från dessa förbearbetade data.

Ovannämnda mätstandarder kan vara vilka kvantifier- bara egenskaper eller vilka statistiska värden som helst som anger viss information om ett embryo inkluderande, dock utan begränsning därtill, geometriska värden (längd, höjd, omkrets, area innefattad av omkretsen etc för ett embryo), färg- eller texturrelaterade värden och spek- tral- värden (absorption, transmittans eller reflektans vid olika våglängder etc). Nämnda mätstandarder kan även inkludera ovannämnda digitala eller spektrala ràdata.

Enligt föreliggande uppfinning appliceras en analys i form av straffad logistisk regression (PLR) pà uppsätt- _ påicaï,icw.utext?clna=tructo: 'TBK Ûfffßii-fl", i»- 10 15 20 25 30 35 528 118 6 ningen av mätstandarder, varvid varje uppsättning av mätstandarder erhålls från ett embryo vars embryokvalitet är känd, för utveckling av en PLR-baserad klassificer- ingsmodell (klassificerare). Den utvecklade klassificer- ingsmodellen kan därefter användas för klassificering av embryon av okänd kvalitet alltefter deras förmodade kvalitet.

Enligt en aspekt av föreliggande uppfinning till- handahàlls närmare bestämt ett förfarande för klassifi- cering av växtembryon alltefter deras kvalitet. Förfar- andet inkluderar i allmänhet sex steg. Först inhämtas uppsättningar av bild- och/eller spektraldata från växt- embryon av känd kvalitet. För det andra associeras varje uppsättning av bild- och/eller spektraldata erhållna från ett embryo med en av ett flertal klassmarkörer alltefter embryots kända kvalitet. Två klassmarkörer (dvs hög kvalitet och låg kvalitet) kan t ex användas, eller kan alternativt tre eller flera klassmarkörer användas, var- vid var och en associeras med en uppsättning av bild- eller spektraldata alltefter den kända kvaliteten för embryot från vilket uppsättningen av bild- eller spek- traldata erhålls. För det tredje beräknas en uppsättning av mätstandarder baserad på varje uppsättning av bild- eller spektraldata erhållna från ett embryo. I detta skede associeras således varje uppsättning av mätstand- arder beräknade från en uppsättning av bild- eller spek- traldata erhållna från ett embryo med en särskild klass- markör som är indikativ på detta embryos kända kvalitet.

För det tredje tillämpas en analys i form av straffad logistisk regression (PLR) på uppsättningen av mätstand- arder och deras motsvarande klassmarkörer för utveckling av en PLR-baserad klassificeringsmodell. För det femte inhämtas bild- eller spektraldata från ett växtembryo med okänd kvalitet, och en uppsättning av mätstandarder be- räknas med basis på nämnda inhämtade bild- eller spek- traldata av embryot med okänd kvalitet. För det sjätte tillämpas en PLR-baserad klassificeringsmodell på upp- nšlflßïl-JREZAELFSER k; lüïfl 52-; šgp-gzdiícat 1la~r-_tev'ï'ïc ïns; trfixflïfift 'IP-F flfiÜfiz-C' 10 15 20 25 30 35 528 118 7 sättningen av mätstandarder beräknad med utgångspunkt från växtembryot med okänd kvalitet för klassificering av detsamma.

Enligt en annan aspekt av föreliggande uppfinning tillhandahålls ett förfarande för utveckling av en klassificeringsmodell för klassificering av växtembryon alltefter deras kvalitet. Förfarandet inkluderar i all- mänhet tre steg. För det första erhålls uppsättningar av bild- och/eller spektraldata från växtembryon med känd kvalitet, och en av ett flertal klassmarkörer associeras med varje uppsättning av bild- och/eller spektraldata er- hållna frân ett embryo alltefter embryots kända kvalitet.

För det andra beräknas en uppsättning av mätstandarder med basis på den erhållna uppsättningen av bild- och/- eller spektraldata för varje embryo. För det tredje till- lämpas en analys i form av straffad logistisk regression (PLR) pà uppsättningarna av mätstandarder och deras mot- svarande klassmarkörer för utveckling av en PLR-baserad klassificeringsmodell.

Enligt en annan aspekt implementeras ett förfarande enligt föreliggande uppfinning i form av på dator exeku- terbara instruktioner (programvara) körda på en dator.

Vid en utföringsform utför instruktionerna, när de väl laddats på en dator, i allmänhet två steg: a) mottagning av uppsättningar av mätstandarder beräknade på basis av uppsättningar av bild- och/eller spektraldata från växt- embryon med känd kvalitet, varvid varje uppsättning av mätstandarder är associerad med en av ett flertal klass- markörer alltefter den kända kvaliteten för embryot från vilket uppsättningen av mätstandarder erhålls; och b) tillämpning av en analys i form av straffad logistisk regression (PLR) på de erhållna uppsättningarna av mät- standarder och deras motsvarande klassmarkörer för ut- veckling av en PLR-baserad klassificeringsmodell. Vid en ytterligare utföringsform utför instruktionerna de ytter- ligare stegen av c) mottagning av en uppsättning av mät- standarder beräknade med basis på inhämtade bild- eller ¿. .. å.:fatimnëzezrfíaölnatxructex 'IÛDE-ül- 10 15 20 25 30 35 528 118 8 spektraldata från ett växtembryo med okänd kvalitet; och d) tillämpning av den PLR-baserade klassificeringsmodell- en på erhållna mätstandarder från växtembryot med okänd kvalitet för klassificering av detsamma.

Kort beskrivning av ritningarna Ovannämnda aspekter och många av de åtföljande för- delarna med föreliggande uppfinning framgàr tydligare eftersom desamma lättare inses, vid en hänvisning till följande detaljerade beskrivning beaktad i samband med de efterföljande ritningarna.

I Figur 1 visas ett flödesschema över hela förfar- andet enligt föreliggande uppfinning för klassificering av embryon genom användning av straffad logistisk re- gression (PLR).

I Figurerna 2A, 2B och 2C visas kurvor över olika klassificeringsstatistikresultat för klassning av embryon genom användning av PLR, erhållna vid ett exempel på implementering av föreliggande förfarande.

Detaljerad beskrivning av den föredragna utföringsformen Förfarandena enligt föreliggande uppfinning kan användas för klassificering av vilken typ av växtembryon som helst, inkluderande både zygotiska och somatiska embryon, alltefter deras embryokvalitet. Embryokvaliteten kan bestämmas med basis på vilka kriterier som helst som kan karakteriseras eller kvantifieras. Embryokvaliteten kan t ex bestämmas med basis på ett eller flera krite- rier, såsom embryots omvandlingspotential (d v s poten- tial för groning och efterföljande planttillväxt och -utveckling), resistens mot patogener, torkresistens, värme- och köldresistens, salttolerans, preferens för (eller okänslighet för) ljuskvalitet, lämplighet för långtidsförvaring och liknande. Ju mer information som är känd om växtembryon och deras önskvärdhet, desto fler kriterier kan utvecklas för att ytterligare förfina selektionsprocessen för identifiering av endast verkliga "högkvalitets"-embryon med olika önskvärda egenskaper. I olika exempel på utföringsformer av föreliggande uppfin- i:zati.-az~_tezt'ï'nlânfi=trurzto: fïE-K '_“.L1Üt=-f'í- 10 15 20 25 30 35 528 :118 9 ning ska växtembryon klassificeras i två eller fler kvalitetsklasser genom användning av vilket som helst av ett eller flera av dessa klassificeringskriterier. Växt- embryon kan t ex klassificeras i två klasser, nämligen en klass av acceptabla embryon med relativt hög kvalitet och en annan klass av ej acceptabla embryon med relativt låg kvalitet. Alternativt kan växtembryon klassificeras i tre eller flera klasser.

Embryon från samtliga växtarter kan klassificeras genom användning av förfarandena enligt föreliggande upp- finning. Förfarandena kan emellertid särskilt tillämpas på agrikulturella växtarter där stora antal av somatiska embryon används för förökning av önskvärda genotyper, så- som skogsträdarter. Närmare bestämt kan förfarandena an- vändas för klassificering av somatiska embryon från barr- trädsfamiljen Pinaceae, särskilt från släktena Pseudot- suga och Pimus.

I Figur l illustreras allmänna steg som är involver- ade vid ett förfarande enligt föreliggande uppfinning. I ruta 10 erhålls vid ett preliminärt steg av förfarandet bild- och/eller spektraldata från växtembryon (eller eventuella delar därav) genom användning av en eller flera vyer (toppvy, sidovy, ändvy etc) genom användning av vilken känd teknik som helst eller vilken känd teknik som helst som kommer att utvecklas, kamera innehållande en laddningskopplad anordning (CCD) bunden till en digital lagringsanordning. Spektrometrisk såsom en elektronisk bildinhämtning och -analys av embryon kan utföras genom användning av ett datainsamlingsarrangemang som t ex inkluderar en ljuskälla (t ex en NIR-källa), ett mikro- skop, en ljussensor och en dataprocessor. Genom använd- ning av ett sådan arrangemang scannas embryon eller em- bryoregioner, och spektraldata inhämtas avseende absorp- tion, transmittans, reflektans eller excitation av elek- tromagnetisk strålning vid en eller flera olika våglängd- er eller vàglängdsband. Dessutom kan bilder inhämtas av kemiska markörer i form av radiografiskt eller fluor- "i-'iv V:*=___I~šøOr-ganisationkšššïíïšïflfiš: ' Ii ,E '»__Z:1t~?a:nilMSELÉÉOZlëëaïåïüälšâs App-mationseztïioínstructør CE? NOS-Ci- 10 15 20 25 30 35 528 118 10 escerande protein eller kvantfläckar (”quantum-dot”).

Skillnader i spektraldata som uppsamlats från embryon av hög kvalitet jämfört med de av låg kvalitet förmodas reflektera skillnader i kemisk sammansättning som är relaterade till embryokvalitet. Eventuella lämpliga data- inhämtningsprotokoll kan användas för specificering av embryoprovtagningsmetoder, mängden erforderliga data eller erforderlig upprepad mätning för erhållande av data av tillräcklig kvalitet, för àstadkommande av tillfreds- ställande klassificeringar av embryona.

Eventuellt kan ovannämnda inhämtade digitala bild- eller spektralrådata förbearbetas genom användning av lämpliga förbearbetningsalgoritmer. Vilka som helst av sådana algoritmer som är familjära för fackmannen på området kan t ex användas för avlägsnande av bakgrunds- information (d v s eventuella data erhållna från icke- embryokällor, såsom bakgrundsljusspridning eller annat brus) eller för reduktion av storleken av digital- eller spektraldatafilen. I USA-patentskriften nr 5 842 150 beskrivs t ex att NIR-spektraldata kan förbearbetas före multivariat analys genom användning av transformation enligt Kubelka-Munk, multiplikativ spridningskorrektion ("Multiplicative Scatter Correction") (MSC), transformation eller standardmässig normal variattrans- formation ("Standard Normal Variate transformation"), av vilka samtliga kan användas för reduktion av brus och Fourier- justering med avseende på drift och diffus ljusspridning.

Som ett annat exempel kan mängden av digitala data som krävs för att representera en inhämtad bild eller ett inhämtat spektrum av ett embryo reduceras genom använd- ning av interpolationsalgoritmer, såsom nedbrytning av smàvàgor ("wavelets“) C.K., An Introduction to Wavelets, Academic Press, San Diego, 1992; Kaiser, Gerald, A Friendly Guide to Wavelets, Birkhauser, Boston; och Sträng, G och T. Nguyen, Wavelets and Filter Banks, Wellesley-Cambridge Press, Wellesley, Massachusetts. Nedbrytning av småvàgor har använts i stor (se t ex Chui, l .ßvpplicatiozætezrttoïïne-trnctnz (JE-K iüfil-ê-Ul- 10 15 20 25 30 35 528 118 ll omfattning för reduktion av mängden data i en bild och för extraktion och beskrivning av särdrag från biologiska data. Ett flertal andra interpolationsmetoder kan användas för att på liknande sätt reducera mängden data i en bild- eller spektraldatafil, såsom beräkning av an- gränsande medelvärden, metoderna enligt Spline (Se t ex C. de Boor, A Practical Guide to Splines, Springer- Verlag, 1978), metoderna enligt Kriging (se t ex Noel A.

C. Cressie, Statistics for Spatial Data, John Wiley, 1993) och andra interpolationsmetoder som är allmänt tillgängliga i programvaruförpackningar för bearbetning av bilder och matriser. Resultaten från en interpola- tionsalgoritm eller funktioner därav används därefter som indata för beräkning av "mätstandarder", som beskrivs nedan.

I Figur 1, ruta ll, associeras varje uppsättning av bild- och/eller spektraldata som erhållits från ett embryo av känd kvalitet med en av ett flertal klass- markörer alltefter embryots kända kvalitet. Varje embryo (och således bild- och/eller spektraldata som erhållits fràn detta) kan t ex märkas som att tillhöra en av två klasser, nämligen hög kvalitet och låg kvalitet, eller till en av tre eller flera klasser, såsom hög kvalitet, medelmàttig kvalitet och låg kvalitet.

I Figur 1, ruta 12, beräknas uppsättningar av mät- standarder baserade på uppsättningarna av bilddata och/- eller spektraldata erhållna från referensembryona med känd kvalitet. Uttrycket "mätstandard" hänför sig till vilket statistiskt skalvärde som helst som beräknats med utgångspunkt från bild- och/eller spektraldata som in- samlar information. Med andra ord är en mätstandard vilket egenskapsvärde som helst som innehåller viss kvan- tifierbar information om ett embryo. På bildalstrings- språk är uppsättningar av mätstandarder också kända som egenskapsvektorer. Som icke-begränsande exempel kan mät- standarder inkludera centrala och icke-centrala moment, funktioner av spektralenergi vid specifika våglängder och IRIIER ê App;ícrstianztextftwInstxïlzcftfu; fïššš 'liïiït-Ll- 10 15 20 25 30 35 528 118 12 vilken annan funktion som helst av en eller flera av dessa statistiska uppgifter. Som ytterligare exempel kan mätstandarder t ex inkludera vilket värde som helst som är relaterat till storlek (längd, höjd, area etc), form, färg (RGB, nyans etc), textur etc hos ett embryo. Som ett specifikt exempel kan nämnas att mätstandarder relaterade till färgen av ett embryo kan inkludera den genomsnitt- liga standardavvikelsen, assymetrikoefficienten och kur- tosiskoefficienten för varje färg, liksom nyans, mättnad och intensitet. Mätstandarder relaterade till texturen för ett embryo kan inkludera detaljkoefficienter och jämnhetskoefficienter. Som ett ytterligare specifikt exempel kan nämnas att en uppsättning av statistiska värden kan beräknas med utgångspunkt från omkretsen av ett embryo och dess smàvågsnedbrytning för àstadkommande av mätstandarder som kvantifierar forminformationen från ett embryo. Dessutom kan mätstandarder härledas från externa överväganden, såsom embryobearbetningskostnader, embryobearbetningstid och komplexiciteten för ett löpande band som krävs för sortering av embryon med avseende på kvalitet. Vid en utföringsform kan en huvudkomponent- analys (PCA), som är välkänd inom teknikomrádet, användas för beräkning av mätstandarder. För en given datauppsätt- ning konstruerar PCA en uppsättning av ortogonala vektor- er (huvudkomponenter) som motsvarar riktningarna av maxi- mal varians i dessa data. Vanligtvis kan 100 till 1000 mätstandarder beräknas med utgångspunkt från varje em- bryos bild- eller spektraldata, men naturligtvis kan fler eller färre mätstandarder beräknas beroende pá varje tillämpning. Uttrycket ”mätstandarder” kan inkludera ovannämnda bild- eller spektralràdata.

När väl ovannämnda bild- eller spektraldata erhålls och olika mätstandarder beräknats från dessa, varje uppsättning av mätstandarder beräknade från upp- sättningen av bild- och/eller spektraldata erhållna från ett embryo med en viss klassmarkör enligt embryots kända kvalitet. I Figur 1, ruta 14, tillämpas en analys i form associeras ,;;- :ca-L i-:r;f.e2.t1'~nIns!:1. .Ara-tu BBK 2005-11:- 10 15 20 25 30 35 528 118 13 av straffad logistisk regression (PLR) pà uppsättningarna av mätstandarder och deras motsvarande klassmarkörer för utveckling av en PLR-baserad klassificeringsmodell (eller klassificerare) för klassificering av embryon alltefter deras förmodade kvalitet. I allmänhet härleds en klassi- ficeringsmodell från en ”övnings”-datauppsättning av. växtembryon eller portioner därav med känd embryokvali- tet. De embryon som tillhandahåller ovannämnda övnings- datauppsättningar klassificeras närmare bestämt i en av ett flertal (två eller flera) alltefter antingen morfologisk jämförelse med normala zygotiska embryon eller verklig plantering och en uppföljnings- studie av embryona. kvalitetsklasser, Logistisk regression används för en modellering av sannolikheter av K-klasser i-efterhand med linjära funk- tioner av X-indata, där K är ett begränsat antal klasser.

Den vanligaste tillämpningen av logistisk regression ut- förs för två klasser, även om den allmänna formen av logistisk regression kan specificeras för ett godtyckligt antal klasser.

Modeller för logistisk regression anpassas vanligt- vis genom maximal sannolikhet, vilket är välkänt inom teknikomràdet. Om Lflü betecknar den vanliga logaritmiska sannolikheten eller någon funktion som är proportionell mot logaritmen av sannolikheten för den logistiska regressionsmodellen, anpassas då en PLR-modell genom att man finner det värde på b som maximerar den straffade logaritmiska sannolikheten, som i allmänhet anges genom LQÛ-gffiñ (ekvation 1) där b representerar en vektor eller matris av modellpara- metrar och fflü är en realvärdesfunktibn av b. I praktiken hittas vanligtvis inte det verkliga maximumet för ekva- tion l, och i stället anges en ungefärlig numerisk lösning.

Zflfië-01-23 06:39 V:\_No0rganisation\HEïERHAEUSER šQMïAfiY\PATENT\_fløFami1y\SE&21021524\2102l524 App!icationtextToInstructor CSK 2005-ül- i:- .tOc 10 15 20 25 30 35 528 118 14 Ickeëbegränsande exempel på f inkluderar det kvad- ratiska straffet: Å Ä~ ~ . =ïbrb (ekvation 2) och det generaliserade kvadratiska straffet: Ä» Ä* ~ šiíbfilbflgj = ïbrnb (ekvation 3) ei ps där §h¿ är värdet i den ize och jze kolonnen i en (pxp)- matris S2, Ä är en skalär kvantitet och p är antalet modellparametrar. Formen av f vid klassificering i två klasser eller vilken annan klassificering i flera klasser som helst med PLR är inte begränsad till ekvationerna 2 eller 3 och kan vara vilken realvärdesfunktion som helst av modellparametrarna.

PLR har en fördel jämfört med de distansbaserade klassificeringsmetoderna, såsom principalkomponentanalys (PCA) eller linjär diskriminantanalys (LDA), genom att dessutom tillhandahålla en uppskattning av de underligg- ande klasssannolikheterna. Dessa sannolikheter kan också användas till att svara för ojämna kostnader relaterade till felaktig klassificering (t ex kan en "falskt posi- tiv” klassificering av ett oacceptabelt embryo såsom acceptabelt vara mer kostsamt än en "falskt negativ” klassificering av ett acceptabelt embryo såsom ej acceptabelt).' I Såsom diskuterats ovan kan ett förfarande enligt föreliggande uppfinning vid en utföringsform användas för klassificering av embryon i generellt två klasser med relativt hög kvalitet, acceptabla embryon och oacceptabla .embryon av relativt låg kvalitet. Vid denna utföringsform anges en uppsättning av övningsdata som 2006-91-20 13:40 V:\__No0rganiSatíOnVIEYERRAEIßER ïötiïhgï\PATEI»IT\_I~JøFamily\SE\2102152-“21021524 ApplicationtextToInstructor BBK 2005-01- n . GC 10 15 20 25 30 35 528 318 15 (å, c1),(5e°2, eg), (in) en), där 55] -indatanpär en p-vektor i., = (xfi,_x¿2,»... xipff", där xn, xü, xç, är mätstandarder beräknade från varje embryo, och C1-utdata antar ett av två klassvärden, till exempel {l,2}, vilket representerar acceptabla respektive oacceptabla klasser.

Den villkorliga sannolikheten för att ett prov be- finner sig i klass 1 (P1) eller klass 2 (P¿) för å betecknas som: 'H l -gÛÜ==ï:;;E5 (ekvation 4) gas) =1__Pl(5¿) (ekvation 5) där (ekvation 6) mn =è Ébux. = 1352 hd därïbv är koifficienterna ra Med utgångspunkt från övningsuppsättningen (551- 01), (ïmcz), (ïpvcn), är- den loga-ritmiska sannolikheten L(b).=:{y¿å',f;, _1n(1+eb7' (ekvation 7) ._ r där y, är en indikator som är variabel för klass 1, och Ä är en vektor av parametrar vars ize element är báh Den straffade logaritmiska sannolikheten för detta exempel erhålls genom ersättning av ekvation 7 och en straffunktion i ekvation 1. Genom användning av det gene- raliserade kvadratiska straffet i ekvation 3 ger detta å: 571-712! _1414' eârå )}""É51TQÃ (ekvation 8) 2Û0ê-01-23 09206 V:\_NoOrgani5ati0n\WEYERHAEU$ER /ÉOMPANNPATEHTXJ-Jolfamily\-SE\2102152«1\21Q21524 Applicationteztfolnstructoi *IBK 2005-01- 6 1.d0b 10 15 20 25 30 35 528 118 16 Modellen för straffad logistisk regression anpassas genom att finna , som maximerar ekvation 8. Ett lämp- ligt värde på Ä kan väljas genom korsvalidering, och ett lämpligt värde på (2 kan väljas från kunskap om befintligt material, även om andra metoder är tillgängliga, vilket inses av fackmannen på området.

Ovan beskrivs ett allmänt koncept för PLR, liksom ett specifikt fall av PLR som ett exempel, och det fram- gár för fackmannen på området att olika specifika straff- funktioner och algoritmer för implementering av en PLR- analys pà ovannämnda bild- och/eller spektraldata erhåll- na fràn embryon är möjlig.

Med hänvisning igen till Figur l visas i ruta 16 att när väl den PLR-baserade klassificeraren är utvecklad, tillämpas den därefter på bilder och/eller spektraldata erhållna från embryon av okänd kvalitet för klassificer- ing av desamma. Närmare bestämt kan förutsagd sannolikhet för groning för varje embryo erhållas genom tillämpning av den PLR-baserade klassificeraren på bild- och spek- traldata som erhållits från embryot, eller, mer speci- fikt, på mätstandarder som beräknats med utgångspunkt från ovannämnda bild- och/eller spektraldata. I olika exempel pà utföringsformer av föreliggande förfarande skulle då embryon med en viss minimal sannolikhet för groning då bevaras som acceptabla.

Såsom är välkänt inom teknikområdet måste vilken klassificerare (eller klassificeringsmodell) som helst testas för verifiering av dess funktion. Vanligtvis ut- förs detta genom exklusion av vissa av värdena från öv- ningsuppsättningen av klassificeringsmodellen och genom användning av modellen för klassificering av nämnda exkluderade data och beräkning hur väl modellen fungerar. Åtskilliga metoder beskrivs i litteraturen för utförande av sådana tester, vilket är välkänt inom teknikomràdet.

Vid en metod uppdelas på ett upprepat och slumpmässigt sätt t ex ursprungliga data i en övningsuppsättning och ' ffiäí-lšxEtl-*FEE 31524 šapplicaticsntexfzifnLnsdzrazcta: 'frå-K Qüírß-írl- 10 15 20 528118 17 en testuppsättning för upprepning av testprocessen.

Alternativt kan all data användas för att öva modellen, och nya data uppsamlas och klassificeras med hjälp av modellen. Resultaten undersöks därefter för kontroll av hur väl modellen fungerade.

Exempel Tre genotyper (56,68 och 75) av somatiska embryon användes för utveckling och test av PLR-baserade klassi- ficerare. NIR-reflektansdata erhölls från somatiska embryon av känd kvalitet (således associerade med vissa klassmarkörer), och PLR-analys utfördes pà NIR-dataupp- sättningarna. Förutsägande modeller för embryons gro- ningstendens byggdes upp med basis på PLR-analys, och deras förutsägbara exakthet bedömdes genom användning av korsvalidering. En reducerad sammanfattning av vissa av resultaten visas i tabellerna nedan.

Tabell 1 (genotyp 56) Straff = 0,01 Straff = 0,1 Straff = 1 Pont OCR PPV PPF OCR PPV PPF OCR PPV PPF 0,5 0,64 0,62 0,49 0,64 0,63 0,49 0,64 0,63 0,47 0,75 0,64 0,73 0,14 0,60 0,79 0,13 0,55 0,91 0,03 0,85 0,60 0,80 0,13 0,56 0,92 0,05 NA NA NA Tabell 2 (genotyp 68) Straff = 0,01 Straff = 0,1 Straff = l Paul OCR PPV PPF OCR PPV PPF OCR PPV PPF 0,5 0,71 0,71 0,51 0,75 0,73 0,63 0,75 0,72 0,55 0,75 0,70 0,79 0,35 0,66 0,79 0,28 0,62 0,88 0,14 0,85 0,67 0,82 0,27 0,62 0,83 0,16 0,53 1,00 0,03 Tabell 3 (genotyp 75) Straff = 0,01 Straff = 0,1 Straff = 1 Puri: OCR PPV PPF OCR PPV PPF OCR PPV PPF 0,5 0,68 0,68 0,54 0,70 0,69 0,56 0,70 0,68 0,59 0,75 0,64 0,73 0,31 0,60 0,75 0,23 0,55 0,76 0,14 0,85 0,57 0,74 0,19 0,53 0,80 0,09 0,50 0,86 0,02 »-= :ü m _>~. 'w App-lirfationteztïelnsLructau CBK '2aï1':-::--~(;3_- 10 15 20 25 30 35 528 11.48 18 I tabellerna ovan står ”OCR” för total klassificer- ingsgrad, som är en fraktion av embryon som är korrekt klassificerade. ”PPV” står för positivt förutsägbart värde, som är en fraktion av embryon som förutsagts gro och som faktiskt grodde, vilket verifierades genom en uppföljningsstudie. ”PPF” står för positiv förutsagd fraktion, som är en fraktion av embryon som förutsagts gro. Således kan ”PPV” betraktas som den fraktion av embryon som bevarats för införlivning i tillverkade frön, och ”PPV” kan betraktas som groningsgraden för dessa bevarade embryon. Två ”avstämmande” parametrar för PLR användes, nämligen ”straff” (Ä) och ”kritisk sannolikhet” (Pcfit). Pcfix är en minimal tröskelsannolikhet för framgång (t ex sannolikhet för groning). Tabellerna ovan visar klassificeringsresultat för flera värden på ”straff” respektive ”kritisk sannolikhet”. Det bör noteras att andra avstämmande parametrar, såsom Q, är inbäddade i PLR. Variationer av dessa parametrar undersöktes, men be- fanns ge liknande resultat som de som visas ovan. De upp- skattade groningsgraderna på populationsnivä (dvs totala groningshastigheterna utan klassificering) för genotyper- na 56, 68 och 75 är 0,477, 0,481 respektive 0,523.

De viktiga statistiska värdena i dessa tabeller är PPV (groningsgraden för de bevarade embryona) och PPF (fraktionen av bevarade embryon). I Figur 2A, 2B och 2C visas kurvor motsvarande Tabell 1 för genotyp 56 med ett straffvärde av 0,01, 0,1 respektive 1. I Figurerna 2A, 2B och 2C representerar raderna 20a, 20b och 20c OCR (totala klassificeringsgraden), medan raderna 22a, 22b och 22c representerar PPV, varvid siffrorna som visas på PPV-rad- erna representerar PPF.

För belysning av klassificeringsförmågan för PLR be- traktar vi resultaten för genotyp 56, såsom de är samman- fattade i Tabell 1 och Figurerna 2A-2C. Groningsgraden på populationsnivà för genotyp 56 uppskattas vara 47,7% (dvs PPV = 0,477 när PPF = 1,0), såsom noterats ovan. För ett straffvärde av 0,1 indikerar resultaten i Tabell 1 att icat1.~::'.teï1:1“f:|ins-truckar CER SÜYJE-tl- 10 l5 20 25 30 35 528 118 19 groningsgraden för somatiska embryon ökar från popula- tionsgraden 0,477 till 0,63 genom användning av PLR med PCI-it = Û,5.

Groningsgraden (PPV) kan förbättras ytterligare genom ökning av den kritiska sannolikheten, dvs Pcfi¿. En ökning av Pcfim resulterar emellertid i en reduktion av fraktionen av bevarade embryon (PPF). Vid ett straffvärde av 0,1 kan t ex groningsgraden för genotyp 56 ökas till 0,92 genom ökning av Pcfii till 0,85, men detta reducerar PPF till 0,05. I syfte att uppnå en groningsgrad av 0,92, måste med andra ord så mycket som 95% av embryona sort- eras ut, eftersom endast 5% av embryona har en sannolik- het för groning som är lika med eller högre än 0,85 (Pcrit) - Resultaten av PLR-analys genom användning av NIR- data för klassificering av somatiska embryon enligt deras groningstendens indikerar att PLR tillhandahåller för- bättrad klasificering jämfört med PCA, LDA, straffad diskriminantanalys och ”boosting”. Förbättringen är huvudsakligen ett resultat av beaktande av kostnader för oenhetlig felaktig klassificering. Tidigare korsvalidera- de resultat för embryoklassificering uttryckt som PPV (positivt förutsägande värde) var t ex 70% för genotyp- erna 68 och 75 och ca 60% för genotypen 56. Däremot ökade PLR-baserade korsvaliderade resultat för embryoklassifi- cering uttryckt som PPV till ca 80% för genotyperna 68, 75 och 56.

Föreliggande förfarande implementeras företrädesvis genom användning av programvara (datorprogram) körd pà en dator för utförande av förfarandestegen. Ett lämpligt val av dator och kodning av programmet för utförande av för- farandestegen är uppenbara för fackmannen pà området.

Vilket datorspråk eller vilken programvara som helst som kan utföra numerisk linjär algebra kan användas för im- plementering av PLR-algoritmen enligt föreliggande upp- finning. Vid en utföringsform kan algoritmen implementer- as i S-språket.

H m A. -,_.,_«.Zlatan.nëiteztfšfoïiïnstrix-tär »LEK iüíšfi-ul- 528 118 20 Även om den föredragna utföringsformen av uppfin- ningen har belysts och beskrivits, inses det att olika förändringar kan göras av denna utan att man frångår upp- finningens innebörd och skyddsomfáng. 3 03:42? '«2:\__k1c'3rg. nnxwggg _ ..TEï~1^l^'~.__tIø2'a~tniWESE:MOMW QIO- -r _ 'f v: eztTnínssizrxxctcfx 'IBK 'lCfl'5-f:';-

Claims (10)

5 10 15 20 25 30 35 528 118 JU PATENTKRAV

1. Förfarande för klassificering av växtembryon med avseende på deras kvalitet, varvid det inbegriper stegen aVZ (a) (b) (c) inhämtning av uppsättningar av bild- och/eller spektraldata från växtembryon av känd kvalitet; association av var och en av de inhämtade upp- sättningarna av bild- och/eller spektraldata in- hämtade från ett växtembryo med en av ett flertal klassmarkörer motsvarande embryots kända kvalitet; beräkning av en uppsättning mätstandarder basera- de på var och en av de inhämtade uppsättningarna av bild- och/eller spektraldata, varvid varje uppsättning av mätstandarder är associerad med en klassmarkör motsvarande kvaliteten av embryot på vilket uppsättningen av mätstandarder är beräknad; tillämpning av en analys i form av straffad logistisk regression (PLR) på uppsättningarna av mätstandarder och deras motsvarande klassmarkörer för utveckling av en PLR-baserad klassificeríngs- modell; inhämtning av bild- och/eller spektraldata från ett växtembryo av okänd kvalitet och beräkning av mätstandarder baserade på nämnda inhämtade bild- och/eller spektraldata för växtembryot av okänd kvalitet; tillämpning av den PLR-baserade klassificerings- modellen på nämnda mätstandarder beräknade med avseende på växtembryot av okänd kvalitet för och klassificering av detsamma.

2. Förfarande för utveckling av en klassificerings- modell för klassificering av växtembryon med avseende på deras kvalitet, varvid det inbegriper stegen av: 10 15 20 25 30 35 528 133 22 a) mottagning av uppsättningar av bild- och/eller spektraldata från växtembryon av känd kvalitet, varvid varje uppsättning av bild- och/eller spektraldata är associerad med en av ett flertal klassmarkörer motsvarande den kända kvaliteten för motsvarande embryo från vilket uppsättningen av bild- och/eller spektraldata erhålls; b) beräkning av uppsättningar av mätstandarder basera- de pà de mottagna uppsättningarna av bild- och/- eller spektraldata, varvid varje uppsättning av mätstandarder är associerad med en klassmarkör mot- svarande kvaliteten av embryot från vilket uppsätt- ningen av mätstandarder beräknas; och c) tillämpning av en analys i form av straffad logist- isk regression (PLR) på uppsättningarna av mät- standarder och deras motsvarande klassmarkörer för utveckling av en PLR-baserad klassificeringsmodell.

3. Förfarande enligt kravet 1 eller 2, varvid ovan- nämnda bild- och/eller spektraldata är digitaliserade.

4. Artikel inbegripande ett datorläsbart signal- bärande medium inkluderande datorexekuterbara instruk- tioner, varvid instruktionerna efter laddning pá en dator utför steg som inbegriper a) mottagning av uppsättningar av mätstandarder 7 beräknade med basis pà inhämtade bild- och/eller ¿ spektraldata från växtembryon med känd kvalitet, L varvid varje uppsättning av mätstandarder äri associerad med en av ett flertal klassmarkörer enligt motsvarande embryos kända kvalitet; och b) tillämpning av en analys i form av straffad logist- isk regression (PLR) på de erhållna uppsättningarna av mätstandarder och deras motsvarande klassmarkör- er för utveckling av en PLR-baserad klassificer- ingsmodell.

5. Artikel enligt kravet 4, varvid instruktionerna dessutom utför steg som inbegriper: ."_-“'.--'.í=§<í -';'.3-.L1ï«.¿s SEC LILEÉIÉ--flå-líï 'š..d.c'-«:' 10 15 528 118 23 c) mottagning av mätstandarder beräknade med basis på inhämtade bild- och/eller spektraldata från ett växtembryo med okänd kvalitet; och d) tillämpning av den PLR-baserade klassificerings- modellen på erhållna nämnda mätstandarder för växt- embryot med okänd kvalitet för klassificering av detsamma.

6. Artikel enligt kravet 4, somatiska växtembryon.

7. Artikel enligt kravet 4, är ett träd.

8. Artikel enligt kravet 4, medlem av ordningen Coniferales.

9. Artikel enligt kravet 4, medlem av familjen Pinaceae.

10. Artikel enligt kravet 9, varvid trädet är valt från den grupp som består av släktena Pseudotsuga och Pinus. varvid växtembryona är varvid växten varvid trädet är en varvid trädet är en nl-:hínas »JL-L-i- li*-^Jf.~~:;=è-lí Lala-c;