SE525617C2 - Anordning och förfarande för avbildning och 3D-rekonstruktion av mikroskopiska objekt - Google Patents

Description

25 r-nr- far-r 2 10.1007/s0OlO90000lOl, publicerat online 28 april 2000 diskuteras förfarandenför i kryomikroskopi för att bestämma .strukturen hos proteinmolekyler, proteinkomplex och cellorganeller. Tabell 1 i denna artikel nämner medicinskt relevanta protein- strukturer som bestäms med elektronmikroskopi och ebildrekonsuuktion. Upplös- ningen varierar från 3,7Å för tubulin till 30A för actin-myosin-komplex. I det sista kapitlet, ”The future prospects of electron rnicroscopy”, förklarar Auer att strukturer hos en enskild partikel med inre symmetri och nämner att det firms en önskan bland cellbiologer om att uppnå 3D-rekonstruktioner med hög upplösning av partiklar utan inre symmetri. Han beskriver också en framtida möjlighet att studera 3D-strukturen hos stora grupper av makromolekyl, utan att förklara hus detta kan uppnås, utom att I förbättrad datorkapacitet kommer att krävas.

Mellwig och Böttcher: ”Dealing with Particles in Different Conforrnational States by Electron Microscopy and Image Processing”, J oumal of Structural Biology 133, 214-220 (2001), beskriver användning av elektronmikroskopi och bildbehandling för att utforska olika konformationstillstánd hos enzymer. Molekyler som har en molekylär massa av ungefär 550kDa undersöktes, dvs. relativt stora molekyler. Med användning av genoinsnittsberälcningar (faveraging) uppnåddes en upplösning mel- lan 3,3nm och 4,8nm. ' Det finns en önskan i dag om ett förfarande som möjliggör studium av objekt av- storlek ned till enskilda molekyler. Till exempel vid utveckling av nya mediciner är kunskap om bindnings- och interaktionsställen hos molekyler ofta till hjälp. Detta förutsätter en högre upplösning vad som vanligtvis finns tillgängligt i dag och även en teknik som möjliggör att preparera ett prov utan att förstöra objektet.

Uppfinningens syfte ».

Det är således ett syfte med uppfinningen att möjliggöra identifikation av individu- - ella 3D-strukturer eller nyckelkomponenter i en kropp, cell eller molekyl med högre lO 15' 20 25 ' Û r* f~ r* .f »i rv i ':š":'°.:° :":"É= '- 'g _; 'oo va: oo 0 O OI C I I IC I II I 3 upplösning och flera bevarade detalj er än vad som har varit möjligt i den kända tek- niken. 'i Sammanfattning av uppfinningen _ _ Detta syfte uppnås enligt uppfinningen genom ett förfarande för avbildning av åt+ rninstone ett objekt, innefattandeföljande steg: ' ' 'i - bildinformation om ett prov insamlas med hjälp av ett mikroskop, - en del av provet väljs för avbildning (som en volym) - den insamlade bildinformationen för volymen återskapas med användning av en iterativ rekonstruktionsmetod i vilken en uppskattad sannolikhetsfórdelning för- finas i åtminstone ett steg utgående från en järnförelse med den insamlade bildin- i fonnationen.

Syftet uppnås också genom en anordning för avbildning av åtminstone ett objekt, innefattande följande: - _ medel för att mottaga bildinfonnation som samlats in med hjälp av ett mikro- skop, _ I - medel för att välja en del av provet för avbildning (som en volyml - medel för att återskapa den insamlade bildinformationen för nämnda volym med användning av en iterativ rekonstruktionsmetod i vilken en uppskattad sarinolikÉ ' hetsfördelning förfinas i åtminstone ett steg utgående från en j ämförelse med den insamlade bildinformationen.

Förfarandet och anordningen enligt uppfinningen möjliggör studium av små objekt såsom nyckelkomponenter i en kropp, cell eller molekyl med en upplösning ned till i storleksordningen “0i,5nm. I vissa fall, i' synnerhet i kombination med andra förfaran- den, kan upplösningen ökas till i storleksordningen O,_2-0,3nm. Individuella mole- - kyler ned till under 20kDa kan studeras. 10 15 20 25 _. 30 .«~- f «. w . ="=":= - Anordningen och förfarandet enligt uppfinningen möjliggör studium av, exempel-_ vis, följande i 2, 3 eller upp till N dimensioner, där N är ett stort positivt heltal. s polymerer och suprainolekylära komplex - nyckelkomponenter i signalöverföringen - nyckelkomponenter i metabolismen i - nyckelkomponenter i neurobiologi och utvecklingsbiologi - nyckelkomponenter i apoptos-sekvensen - nyckelkomponenter i patologiska cellförändrixigar (dvs. onkologi) - nyckelkomponenter avseende effekter av droger Med förfarandet och anordningen enligt uppfinningen kan sådana nyckelkompo- nenter, inklusive receptorer och ionkanaler, studeras individuellt i nästan vilket som helst medium.

Förfarandet och. anordningen enligt uppfinningen möjliggör även jämförelse av så- dana strukturer eller nyckelkomponenter under olika förhållanden, exempelvis jäm- förelse av hälso- och sjukdomstillstånd under påverkan av en drog eller undersök- ning av konformationsutrymmet för en makromolekyl i ett givet medium.

F örfarandet innefattar företrädesvis de ytterligare stegen att - åtminstone ett objektinom volymen väljs '- en del av bildinformationen avseende det åtminstone ena objektet analyseras. “ I detta fall innefattar anordningen även - medel för att välja åtminstone ett objekt inom volymen V - medel för att analysera en del av bildinforrnationen avseende det åtminstone ena objektet.

Ett eller flera objekt kan väljas i beroende av objektets form och/eller storlek. I detta fall innefattar anordningen medel för att välja det åtminstone ena objektet i beroende. av dess form och /eller storlek. - små molekyler och makrornolekyler, såsom proteiner, glykoproteiner, generella g lO 15 20 25 30 Förfarandetkan också innefatta steg för att preparera provet, t.ex. att exponera det för markörer innan bildinformationen insarnlas, att preparera provet medelst kryo- mikrotomi ooh/eller att preparera det medelst snabbkylning. i Förfarandet kan också innefatta steget att mäta inforrnationsinnehållet i den återska- pade bildinformationen. I detta fall innefattar anordningen databehandlingsmedel för att mäta informationsinnehållet i den återskapade bilden som alstrats av det fór- sta datorprogrammet.

Steget att samla in bildínforrnation innefattar företrädesvis insamlande av flera 2D- bilder och justering av dessa 2D-bilder relativt varandra. ' Den återskapade bilden kan visas på en datorskärm. Återskapningsmedlet för att återskapa den insamlade bildinformationen kan vara anordnat att återskapa 3D-data från de nämnda 2D-bildema utan avfaltning av punktspridningsfirrllctionen. Åltemativt kan áterskapningsmedlet vara anordnat att återskapa 3D-data från 2D-bilderna innefattande avfaltrling av punktspridnings- funktionen. En tredje möjlighet är att återskapningsmedlet är anordnat att först av- falta punktspridningsfunktionen för 2D-bildema och sedan återskapa 3D-data utan att avfalta punktspridnings funktionen. ' .Ånordningen kan innefatta andra behandlings- och eller minnesorgan, såsom - extra minnesorgan för att spara andra data avseende provet - strukturminnesorgan för att 'spara data om en initial struktur _ _ v - databehandlingsorgan för att kombinera återskapade eller uppmätta utgående i data från det första datorprogrammet med tidigare strukturdata som firms i » strukturdatabasen för att förfina den återskapade bilden. 10 15 20 25 30 for' ref? 0 o , , n f n _. .... x.) v* l 1 g ' :'.o : :c o o 0 ° u o u a oo nn cec en 6 F örfarandet och anordningen enligt uppfinningen kan användas för studier av bind-__ » _ nings- och interaktionsställen hos molekyler eller nyckelkomponenter såsom protei- ner. Sådana studier, och även den ovan nämnda jämförelsen, kan följas av, föregås av eller kombineras med studier och analyser med hjälp av andra förfaranden för att - i upptäcka droger, för att öka upplösningen t.ex. vid förfaranden för att upptäcka dro- ger eller andra fysiska eller kemiska förfaranden.

Upplösningen beror bland annat på provets temperatur. Ju lägre provets temperatur är, desto högre upplösning kan uppnås. Ett vanligt kylämne í dag är flytande kväve.

Flytande helium är dyrare och därför mindre vanligt, men möjliggör en högre upp- lösning eftersom det har lägre temperatur.

En annan faktor som begränsar upplösningen är egenskaperna hos detektorema som används. Med de detektorer som finns tillgängliga i dag kan en högre upplösning uppnås för objekt som inte är strålningskänsliga. Vanligtvis kan objektet endast ut- sättas tör en viss mängd strålning, vilket begränsar antalet bilder som kan tas av ob- jektet. Om det inte finns någon sådan begränsning kan förfarandet och anordningen enligt uppfmningen uppnå en upplösning ned till mindre än 0,lnm med detektorer enligt känd teknik. i ' ' Företrädesvis används Comet-tekniken, som beskrivs i den intemationella patentan- sökan WO97/33255, vilken inkluderas här genom referens (motsvarande europeisk patentansökan EP885 430 och svensk patentansökan 9601229-9), för att återskapa bilden. “ Comet-tekniken baseras på följande steg: .

En första uppskattad fördelning av provet tillhandahålls En suddig (blurred) uppskattad sannolikhetsfördelning (prior prej udice distribution) lnnnnndenålis beeefed på den nppsknnede fördelningen i Observerade data av provet tillhandahålls 10k 15 20 '25 _30 a o n I 0 00 0 I_I II .

Ffï." får! $2°2°.-':-- -, .- s.) ä..- 11 7 I en iterativ process beräknar ett beräkningsorgan, för varje iteration, en ny upp- _ skattad fördelninjgav provet med användning av järnförelse mellan den uppskattade fördelningen och observerade data i provet. En ny uppskattad sarmolikhetsfördel- ning som är mindre suddig än den förra beräknas också.

Iterationema fortsätts tills skillnaden mellan den nya uppskattade fördelningen och den närmast föregående uppskattade fördelningen är mindre än ett förbestämt vill- kor.

Användningen av Comet-tekniken möjliggör att ett objekt studeras i olika medier i det tillstånd i vilket det normalt finns i respektive medium. Därför kan miljön väljas för att tillhandahålla objektet i det önskade tillståndet genom att välja lämpligt me- dium eller lämplig miljö. Alternativt kan flera olika medier användas för att erhålla data om objektet i flera olika tillstånd. Comet kan användas för molekyler både in situ och i lösningar. Därför kan, vid användning av Comet, en 3D-modell av objek- ' tet i dess naturliga tillstånd uppnås. Till skillnad från detta kan, om kristallografi an- vänds, et objekt endast studeras i en miljö där det kristalliseras. Strukturen som er- hålls på detta sätt kanske inte ens finns i ett naturligt tillstånd. Data som erhålls från ett kristalliserat objekt är därför mindre användbara än data avseende ett objekt i dess naturliga tillstånd. I I i Med användning av Comet-tekniken kan högdosförfaranden med färgat material i uppnå en upplösning av 2-3nm, dvs. samma storleksordning som i dag. Lågdosför- faranden kan uppnå en' upplösning av 2-3nm. Comet möjliggör därför studier av molekyler in situ i detta fall. Med ofärgat material möjliggör Comet en upplösning i i buffertlösningar ned till ungefär 2nm, vilket är en stor förbättring jämfört med den _ kända tekniken.

Alternativt kan ett förfarande baserat på de grundläggande principerna i Comet- förfaradetanvändas. Till exempel kan vissa komponenter i vissa subrutiner ersättas 10 15 20 25 för att utvidga antalet sökvillkor för. att innefatta andra eller fler kriterier än endast. entropin. Effekten varje operator har på sökvillkoren kan modifieras.

I alla dessa fall kan upplösningen förbättras ytterligare med användning av genom- snittsberäkningar. Med anordningen och förfarandet enligt uppfinningen kan emel- _ lertid individuella delar av ett prov analyseras med den ovan beskrivna förbättrade upplösningen. Uttrycket ”individuella” innebär att analysen hänför sig till ett indivi- 'i ' duellt objekt, i motsättning till förfarandensom innefattar beräkning av genomsnitt mellan observationer av flera objekt av sarmna typ. Det uppfinningsenliga törfaran- . i ' det möjliggör således analys eller avbildning av data baserat på ett individuellt ob- jekt med upplösning såsom diskuterat ovan.

Uttrycket ”enskilt” (”singular”) á andra sidan, utesluter inte användning av beräk- ningar av genomsnitt mellan observationer av flera objekt.

Förfarandet enligt uppfinningen optimerar provets och behandlingens integritet. i Kortfattad beskrivning av ritningarna Föreliggande uppfinning kommer att beskrivas mer i detalj i det följande, med hän- , visning till de bifogade ritningama, på vilka: _ Figur l visar ett flödesschema över steg som utförs enligt uppfinningen, och Figur 2 visar en anordning enligt uppfinningen för att utföra det i. figur l beskrivna förfarandet..

Detaljerad beskrivning av uüringsformer Figur l visar ett flödesschema över steg som utförs enligt uppfmningen. Vissa av stegen är valfieia. 1_0 15 20 25 30 Prwfl får? 9.

Steg S1: Tag ett prov. Detta görs enligt någon känd metod som möjliggör skon- sam hantering av provet, motsvarande den önskade upplösningen. Exempel på me- toder är biopsi eller att ett makromolekyl läggs i en buffert. I i Steg S2: skiva av provet. Kryoultramikrotomi eller snabbkylning kan användas.

Steg S3: kas; Om detta gör att provet måste tinas kan det frysas in igen vid behov. Altemativt Preparera provet för mikroskopi, t.ex. genom att tillhandahålla en tunn (valfritt) Exponera provet för markörer (t.ex. antikroppar) om så öns- - kan markörerna läggas till före steg S2.

Steg S4: data i ett mikroskop för att möjliggöra molekyläranalys. Se nedan för detaljer.

Steg S5: som kan vara relaterade eller icke-relaterade till rnikroskopistegen.

Steg S6: enligt Comet-metoden, eller en modifierad metod såsom förklarat ovan. Se nedan Samla in bildinformation och, om så önskas, annan infonnation eller (valfritt) Mät andra data eller annan information i andra processteg, Återskapa bildinforrnationen som samlades in i steg S4. Detta kan göras för mer detaljer.

Steg S7: (valfritt) Mät informationsínnehållet i den i steg S6 erhållna återskapa- de bilden. i I i Steg S8: Analysera det återskapade och mätta datat. Detta kan göras enligt kända tekniker. _ _ Steg S9: (valfritt) Kombinera det àterskapade eller uppmätta datat med uppskat- tade strukturdata eller med data som erhållits med användning av NMR eller kris- tallografi. k ' Steg S10: Proteinmodellering baserad på uppskattade data, dvs. med användning i av en proteinmodell tillsammans med den 3D-återskapade bilden som erhållits ge- nom stegenS 1-S6.

I steg S1 kan provtagningen även innefatta följande aktiviteter rörande behandling av provet: fixering, lcryoskydd, färgning, infrysning, kryosnittning eller infrysning g under hög: tryck. 0 Q Q Q on 0 10 15 20 25 30 man., k; i. 10 I stegen S4 och S6 ovankan Comet-tekniken, såsom definierad i europeiska patent- ansökan EP 885 430 användas, såsom kommer att diskuteras i det följande.

Ordningsfóljden av stegen S4 och S5 kan bytas om fór att automatisera proeessen.

Möjliga ytterligare' steg i S4 innefattar: detektoregenskaper avseende flat fielding osv. provets dimensioner att hitta det relevanta området av provet vid låg fórstoringsgrad kalibrering av forstoringen i bestämning av elektrondos preliminär bestärrming av fokus innan bilddata samlas in Möjliga ytterligare steg i steg S5 innefattar: elektronenergifiirlustspektroskopi bestämning av fokus fór varje bild bestänming av en punktspridningsfunktion som motsvarar både provets och mik- v roskopets egenskaper .I steg S6 återskapas 'bildinformationen antingen genom fórfining av informationen p ' enligt Comet innefattande avfaltning baserad på alla data eller bilder, eller med an- v vändning av Comet för att avfalta data för varje 2D-bild och efterföljande fiårfining.

Tre huvudfórfaranden kan användas: 3D-data kan återskapas från 2D-bildema utan att avfalta punktspridningsfunk- tionen I “ _ _ 3D-data kan återskapas från 2D-bildema innefattande avfaltning av punktsprid- ningsfunktionen i 2D-bildema kan behandlas, innefattande avfaltning av punktspridningsfunktio- _ ~ nen, innan 3D-datat återskapas. Avfaltriing används inte i återskapningen av 3D; data i detta fall. oc aina I - ooouonc_v i* , F^~'f ”'57 ::::-._:§g.j_'§'§_§§_- 10 15 20 zs '30 FÛF' f/lf7.

' , III III Û I Û . f . O I O I I “J "' “J ' l ' 2 = 2 ä' s. in n ø o A u! ll Det andra förfarandet ger bäst resultat. Det tredje förfarandet, dvs. att tillämpa Co- i met pà 2D-bilder, har fördelen att det är enklare att använda tillsammans med ' i analys- och avbildningsprogram. Alternativt, om 2D-bildema behandlas behöver inte 3D-datat âterskapas om det är tillfredsställande att arbeta endast med 2D- ' ' i proj ektionerna.

När 2D-bilderna kombineras till 3D måste de justeras in mot varandra. Detta* kan göras enligt vilket som helst känt förfarande, t._ex. med användning av guldmarkörer i provet.

I steg S7 kan mätningarna innefatta exempelvis signal/brus-förhållandet. Dataupp- sättningen kan segrnenteras utifrån kvalitet för att numeriskt karalcterisera data med användning av statistik eller liknande metoder. Så kallad data mining kan användas genom att välja ut för vidare studier alla delar av bilden som uppfyller ett visst krite- riurn, t.ex. - delar som upptar åtminstone ett visst antal sammanhängande pixlar, - delar som har åtminstone en viss volym I i - delar som kan projiceras i en viss form - strukturer som har en vissjntensitetsfórdelning i I steg S8 kan de återskapade och uppmätta datana_analyseras manuellt eller med hjälp av en dator. Baserat på data :mining-undersökningen som utfördes i steg S7 i kan objekt eller delar av objekt väljas och analyseras och/eller visualiseras. Flera V program firms för sådan analys och visualisering.

I steg S9, t.ex. kan pseudoatomär upplösning uppnås om form-/strukturdata bestäm- _ da iett eller flera steg ovan kombineras med strukturdata som bestämts med kris-_ p' tallografiska metoder för korrelation och genomsnittsberäkningar av strukturen. i , Flexibel dockning kan tillämpas, dvs.. modifiering av objekten innan data kombine- 10 15 20 25 30' 'I F, cølclø 0 . . . .. .. . ._ . for", ::::~._:.,.__-;_;;,- 12 ras. Alternativt kan form-/strukttirdata som bestämts med ett eller flera steg ovan kombineras med strukturdata som bestämts med struktur- eller proteinmodelle- ringsmetoder.

- Objektet kan klassificeras utifrån topologisk jämförelse. Modellen för jämförelse kan tillhandahållas på flera olika sätt, t.ex. från en datorstödd utformning av struktu- i ren hos ett protein.

En mer detaljerad beskrivning av det matematiska grundlaget för Comet-tekniken finns i europeisk patentansökan EP 885 430, i synnerhet på s. 14, rad 25 ~ s. 28. H Figur 2 visar en anordning enligt uppfinningen för att utföra den i figur 1 beskrivna metoden. i i Ett mikroskop l används för insamling av bildinformation om ett prov. Mikroskopet måste antingen kunna samla in tomograñsk infonnation om objektet eller, om av- bildningen inte följer tomografiska principer, måste den fysiska deformeringen som sker i avbildningsprocessen inte omöjliggöra tolkning av bilderna. Deforrneringen kan kompenseras för i Comet, om den kan beskrivas.

Provet har tagits och preparerats såsom kortfattat beskrivits i stegen S l--_S3 i figur I. .

En dator 3 används för att lagra och behandla bildinformationen. Bildinformationen som samlats in av mikroskopet 1 sparas i ett bildminne 5. Andra data eller arman in- formation, t.ex. som diskuterats i anslutning till stegen S4 och S5 ovan, kan matas in till datorn och sparas i ett extra minnesorgan 7. Ett minnesorgan 8 för strukturdata kan finnas, vilket innefattar uppskattade strukturdata, exempelvis erhållet med NMR_ eller kristallografi, vilka kan användas för att förfina resultaten. - i Ett första datorprogram 9 i datom 3 bearbetar datat i bildminnet .5 för att återskapa bildinfonnationen som samlats in av rnikroskopet 1. Det första datorprogrammet 9 'i I ' fungerar exempelvis enligt Comet-metoden som beskrivits översiktligt ovan. Ett 10 15 20 113 andra datorprogram 11 kan finnas, vilket mäter inforrnationsinnehållet i den åter- _ skapade bilden som alstrats av det första datorprogrammet. Ett tredje datorprogram 13 analyserar det återskapade och uppmätta datat, vilken kan göras enligt känd tek- i nik. Exempelvis kan det tredje programmet 13 identifiera objekt som har en viss form eller storlek. Det tredje programmet kan också utföra virtuell omorientering av objekt, t.ex. så att alla objekt med likartad struktur visas med samrna orientering. _ Eventuellt kan ett fiärde datorprogram 15 finnas för att kombinera de återskapade p eller uppmätta utdatana från det första datorprogrammet 6 med uppskattade struk- - turdata som finns i strukturdatabasen 8. Utdata från vart och ett av programmen 9, . 11, 13, 15 kan sparas i en resultatdatabas 17.

Datorn kan pâverkas genom operatörsinmatningsorgan 21. Figur 2 visar ett tangent- bord, men vilket som helst ínmatningsorgan kangivetvis användas. Datorn har ock- så en datorskärm 23 för kommunikation med operatören. Den återskapade bilden som alstrats av det första datorprogrammet kan visas på datorskärmen 23.

I Givetvis behöver inte datorprograrmnen 9, 11, 13, 15 skrivas som individuella pro- gram utan kan realiseras som ett eller flera program i en programstruktur som anses lämplig. Minnesorganen 5, 7, 8, 17 kan också vara kombinerade eller uppdelade en- ligt vad som anses lämpligt. Vidare minnesorgan kan behövas, exempelvis för att lagra resultatdata från ett eller flera av datorprogramrnen 9, 11, 13, 15.

Claims (26)

10 15 20 25 ff'\f' .Ill-P -ll O: n n I 9 ou Patentkrav

1. Förfarande för avbildning av åtminstone ett objekt, innefattande följande steg: - bildinfonnation om ett prov insamlas med hjälp av ett mikroskop, - en del av provet väljs för avbildning, som en volym - den insamlade bildinformationen för volymen återskapas med användning av en iterativ rekonstruktionsmetod i vilken en uppskattad sarmolikhetsfördelning tör- finas i åtminstone ett steg utgående från en jämförelse med den insamlade bildin- fonnationen.

2. Förfarande enligt krav 1, vidare innefattande stegen att åtminstone ett objekt inom volymen väljs en del av bildinformationen avseende det åtminstone ena objektet analyseras.

3. Förfarande enligt något av föregående krav, varvid återskapningsmetoden är ba- serad på Comet-tekniken.

4. Förfarande enligt något av föregående krav, vidare innefattande steget att ett eller flera objekt väljs i beroende av objektets form och/eller storlek.

5. Förfarande enligt något av föregående krav, vidare innefattande steget att provet exponeras för markörer innan bildinforrnationen insamlas

6. Förfarande enligt något av föregående krav, vidare innefattande steget att mäta informationsinnehållet i den återskapade bildiriforrnationen. 10 15 20 25 !'“f\"' 'ÄV 15

7. Förfarande enligt något av föregående krav, varvid steget att samla in bildinfor- mation innefattar insamlande av flera 2D-bilder och vidare innefattande steget att justera dessa 2D-bilder relativt varandra.

8. Förfarande enligt något av föregående krav, varvid steget att återskapa den insam- lade bildinfonnationen innefattar att återskapa 3D-data från nänmda ZD-bilder utan att avfalta punktspridningsfurrktionen.

9. Förfarande enligt något av kraven l-7, varvid steget att återskapa den insamlade bildinformationen innefattar att återskapa 3D-data fiån nämnda 2D-bilder innefat- tande avfaltning av punktspridningsfunktionen.

10. Förfarande enligt något av kraven 1-7, varvid steget att återskapa den insamlade bildinforrnationen innefattar att först avfalta punktspridningsfiinktionen för 2D- bilderna och sedan återskapa 3D-data utan att avfalta av punktspridningsfimktionen.

11. ll. Förfarande enligt något av föregående krav, vidare innefattande steget att prepa- rera provet, t.ex. medelst kryomikrotomi.

12. Förfarande enligt något av föregående krav, vidare innefattande steget att prepa- rera provet medelst snabbkylning.

13. Förfarande enligt något av föregående krav, vidare innefattande steget att den återskapade bilden visas på en datorskärm.

14. Anordning för avbildning av åtminstone ett objekt, innefattande följande: - medel för att mottaga bildinfonnation som samlats in med hjälp av ett mikro- skop, - medel för att välja en del av provet för avbildning, som en volym 10 15 20 25 30 var' .f f, 5-7 en: acc s o av O c nu I 0 II no nu to 0 0 0 0 0 Q vi Q 0 c I I 0 0 O I . . ; g 9 o 0 I a 00 16 - medel för att återskapa den insamlade bildinforrnationen för nämnda volym med användning av en iterativ rekonstruktionsmetod i vilken en uppskattad sannolik- hetsfördelning förfinas i åtminstone ett steg utgående från en jämförelse med den insamlade bildinforrnationen.

15. Anordning enligt krav 14, vidare innefattande - medel för att välja åtminstone ett objekt inom volymen - medel för att analysera en del av bildinfonnationen avseende det åtminstone ena objektet.

16. Anordning enligt något av kraven 14-15, varvid medlet för att återskapa den in- samlade bildinforrnationen är anordnat att tillämpa en återskapningsmetod baserad på Comet-tekniken.

17. Anordning enligt något av kraven 14-16, vidare innefattande medel för att välja det åtminstone ena objektet i beroende av dess form och /eller storlek.

18. Anordning enligt något av kraven 14-17, vidare innefattande mätningsmedel (11) för att mäta informationsinnehållet i den återskapade bilden.

19. Anordning enligt något av kraven 14-18, vidare innefattande justeringsmedel för att justera flera 2D-bilder avseende ett prov relativt varandra.

20. Anordning enligt något av kraven 14-19, varvid återskapningsmedlet (9) för att återskapa den insanilade bildinforrnationen är anordnat att återskapa 3D-data från de nämnda 2D-bilderna utan avfaltning av punktspridningsflirilctionen.

21. Anordning enligt något av kraven 14-20, varvid återskapningsmedlet är anordnat att återskapa 3D-data från ZD-bilderna innefattande avfaltning av punktspridnings- funktionen. 10 15 20 ffïr' får! ooo ooooooo oo oo oo o o oo o oo o oo o o o . ;/ o oo oo oo ooo o oo o o o ' ooo o o oo ooooooo o 17

22. Anordning enligt något av kraven 14-21, varvid återskapningsmedlet är anordnat att först avfalta punktspridriingsftirildionen för 2D-bildema och sedan återskapa 3D- data utan att avfalta punktspridningsfunktionen

23. Anordning enligt något av kraven 14-22, vidare innefattande databehandlings- medel (1 l) för att mäta inforrnationsinnehållet i den återskapade bilden som skapats av det första datorprogrammet (9).

24. Anordning enligt något av kraven 14-22, vidare innefattande extra minnesorgan (7) för att spara andra data avseende provet

25. Anordning enligt något av kraven 14-22, vidare innefattande strukturminnesor- gan (8) för att spara data om en tidigare struktur.

26. Anordning enligt något av kraven 14-22, vidare innefattande databehandlingsor- gan (15) för att kombinera det återskapade eller uppmätta utgående datat från det första datorprogrammet (6) med det tidigare strukturdatat som finns i strukturdata- basen (8) för att förfina den återskapade bilden.