JP2005538344A - 画像化装置および方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
【解決手段】 少なくとも一つの対象物の画像化のための方法および装置で、本方法は以下のステップからなる：顕微鏡によって試料についての画像情報を収集する、前述試料の画像化する部分を選択する（体積として）、少なくとも1 回は収集画像情報との比較に基づき先の偏見分布が改良される反復再構成法を用いて前述体積に対し収集された画像情報を望ましくはＣＯＭＥＴ方法で再構成する。少なくとも一つの対象に関する画像情報の分析のために前述体積内で一つまたはそれ以上の対象物が選択され得る。

Description

本発明は請求項１の前文に記載の画像化装置に関する発明である。本発明はまた画像化方法に関する発明でもある。

小さな対象物の画像と三次元再構成にはいくつかの先行技術がある。
染色物質は高照射線量でも低照射線量でも使用できる。高照射線量の場合には、一般に画像化試料の約３０％の質量損失がある。このような技術ではおよそ３ｎｍまでの分解能が得られる。この方法には系統的誤差があるので、これ以上の分解能が得られるのは偶然による場合のみと思われる。対象物のある部分、たとえば線維部が破壊される。従って、これらの方法は実際には一般的な細胞成分辺りまでに使用され、分子量１００−２００ｋＤａ未満の個別分子のような小さい対象物の画像化には使用できない。

低放射線量染色物質で得られる分解能は約５ｎｍ迄である。質量損失はない。すなわち、試料はもとのままである。画像のノイズレベルがかなり高いので、画像の読み取りがむずかしい。 個別分子は確認できない。

無染色物は、試料の識別と調製の問題により、通常その部位では検査できない。画像化可能な試料の薄いバッファーフィルムを作り溶液中でなら検査できる。最高分解能は６−８ｎｍ、すなわち、非常に大きな分子錯体なら３次元で検査できる。

Journal of Molecular Medicineに２０００年４月２８日オンライン発行されたAuer, Manfredによる「分子医学の強力な構造解析手段としての 三次元電子クライオ顕微鏡検査」, DOI 10.1007/ｓ001090000101では、蛋白質分子、蛋白質錯体、細胞小器官の構造決定のためのクライオ電子顕微鏡の手法が検討されている。
この記事の第１表に電子顕微鏡検査法と画像再構成によって決定された医学関連の蛋白質構造が載っている。
分解能はチューブリンの０．３７ｎｍからアクチンミオシン複合体の３ｎｍの範囲である。最終章の「電子顕微鏡検査法の将来像」で、Auerは内部対称性を有する単一粒子対象物の構造を説明し、内部対称性の無い粒子の高解像度三次元再構成を得るという細胞生物学者の願望を表明した。また彼は大きな高分子アセンブリーの三次元構造研究の将来的可能性を概説しているが、これがどのように達成されるかについては、計算能力の向上が必要ということ以外述べていない。

MellwigとBottcher： Journal of Structural Biology 133,214−220(2001)の「電子顕微鏡検査法及び画像処理による異なる立体配座状態の粒子の扱い」で酵素の異なる立体配座状態を調査するために電子顕微鏡検査法と画像処理の使用について述べている。ここでは分子量が約５５０ｋＤａの分子、すなわち比較的大きな分子が調査された。平均値としては分解能は３．３ｎｍから４．８ｎｍの範囲である。

今日求められていることは、対象物の単一分子サイズまでの研究を可能にする方法である。例えば、新薬の開発では、分子の結合と相互作用のサイトの知識がしばしば有益である。これには今日一般に得られるものより高い分解能が必要であるし、また対象物を破壊せずに試料の調製ができる技術が必要である。

発明の目的
従って、本発明の目的は人体、細胞あるいは分子の個別三次元構造や主要素をより高い分解能での確認を可能にすることであり、また先行技術でなしえたより更に詳細に保持することにある。

この発明の目的は以下のステップによりなる少なくとも一つの対象物の画像化方法による発明に従って達成される。
顕微鏡を用いて試料についての画像情報を収集する
前記試料の画像化すべき部分を選択する（体積として）
少なくとも１回は収集画像情報との比較に基づきが先の偏見分布が改良される反復再構成方法を用いて前記体積に対し収集された画像情報を再構成する。

本目的はまた以下のステップからなる少なくとも一つの対象物の画像化装置により達成される。
顕微鏡を用いて収集された画像情報を受け取る手段
前記試料の画像化すべき部分を選択する手段（体積として）
少なくとも1 回は収集画像情報との比較に基づき先行偏見分布が改良される反復再構成方法を用いて前記体積に対して収集された画像情報を再構成する手段。

本発明による方法及び装置は人体、細胞あるいは分子の主要要素などの小さな対象物の検査を０．５ｎｍオーダーの分解能で可能にする。いくつかのケースでは、特に他の方法との組み合わせた場合、分解能は０．２−０．３ｎｍのオーダーまで高めることができる。個体分子は２０ｋＤａｌｔｏｎ以下まで検査できる。

本発明による装置及び方法では、例えば、以下の研究が２、３あるいはＮ次元まで可能となる、ただし、Ｎは大きな正の整数である。
蛋白質、糖蛋白、一般的なポリマー、超分子の錯体のような小さな分子、高分子
信号伝達経路の主要要素
代謝経路の主要要素
神経生物学及び発生生物学分野での主要要素
アポトーシスシーケンスの主要要素。
細胞の病理学的変化 (すなわち腫瘍学) の主要要素
薬効に関する主要要素
本発明による方法及び装置で、受容体やイオンチャネル等の前出の主要要素が固体別にほとんどの媒体で検査可能である。

また、本発明の方法及び装置では健康と病態への薬の影響の比較やある特定の媒体での高分子の立体配座空間の探求など異なる条件下での構造あるいは主要要素の比較が可能となる。

前記方法には、更にステップを含むのが望ましい。
少なくとも一つの対象物を前記体積中に選択する。
少なくとも前述の一対象物に関する画像情報の一部を分析する。
この場合の装置は更に次のものを有する。
少なくとも一つの対象物を前記体積中に選択する手段
少なくとも前述の一対象物に関する画像情報の一部を分析する手段

対象物として形および／または大きさにより一つ以上の対象物を選択でき、その場合装置は形および／または大きさにより少なくとも一つ以上の対象物を選択できる手段を有する。

該方法は、また、試料の調製ステップ、例えば、試料を画像情報の収集前にマーカーに暴露する、クライオ顕微鏡切片作製方法により試料を調製する、および/または急速冷凍により試料を調製する等のステップからなる。

該方法は、また、再構成された画像情報の情報内容を測定するステップからなる。この場合、該装置は第一コンピュータ・プログラムにより生成された再構成の情報内容を測定するデータ処理手段からなる。

画像情報を収集するステップは望ましくは数種類の二次元画像の収集と該二次元画像のアラインメント処理からなる。
再構成はコンピュータ・スクリーン上に表示される。

収集画像情報を再構成する再構成手段は、ポイントスプレッド関数の逆重畳無しに前述二次元画像から三次元データを再構成するように配置できる。あるいは、再構成手段は、ポイントスプレッド関数の逆重畳を含めて前述二次元画像から三次元データを再構成するように配置できる。第三番目のオプションとしては、再構成手段はまず二次元画像のポイントスプレッド関数を逆重畳し、その後、ポイントスプレッド関数の逆重畳せずに三次元データを再構成するように配置できる。

該装置は、次のようなその他のプロセッシング及び／又はメモリー手段を有することができる。
試料に関するその他のデータを保存する予備メモリー手段
先行構造データを保存する構造メモリー手段（８）
第一コンピュータ・プログラム(６)からの再構成あるいは測定データ出力を構造データベース(８)中で構成された先行構造データと結合させ再構成画像を改良するデータ処理手段（１５）

本発明による方法と装置は蛋白質のような分子や主要要素の結合および相互作用サイトの研究に使用され得る。このような研究や上述の比較は、分解能を増大させるために、他の薬の発見方法や他の研究や分析に引き継がれたり、先行されたり、組み合わせされたりできる。例えば、薬の発見方法とその他の物理的あるいは化学的方法などである。

分解能は他の事象とともに試料の温度に左右される。試料の温度が低ければ低いほどより高い分解能が得られる。今日の一般的な冷却剤は液体窒素である。液体ヘリウムはより高価なのでそれほど一般的ではないが、低温なのでより高い分解能が可能となる。

分解能を制限しているもう一つの要素は使用している検出器の特性である。今日利用可能な検出器では、放射線に敏感でない対象物に対して、より高い分解能が得られる。通常、対象物にはある限られた一定量の放射線を照射できるが、これが対象物から得られる画像数を制限する。もしこのような制限が無ければ、本発明の方法と装置は先行技術による検知器で対象物を分解能０．１ｎｍ以下まで可能である。

画像再構成には望ましくは、国際特許出願 WO97/33255 で述べ、ここでは参照しているＣｏｍｅｔ技術が使用できる。（対応ヨーロッパ特許出願 EP885430 およびスウェーデン特許出願 9601229−9）

Ｃｏｍｅｔ技術は以下のステップに基づいている：
試料の初期予測分布が提供される
該予測分布に基づき不明瞭な先行偏見分布が提供される
試料の観察値が提供される
反復プロセスで、計算手段が試料の予測分布と観察値間の比較をなし、試料の新規予測分布を各反復ごとに計算する。一段階前より明瞭度の上がった新しい先行偏向分布も計算される。このような反復処理は、新規予測分布と次の先行予測分布との差が予め規定された条件以下になるまで継続される。

Ｃｏｍｅｔ技術を使用すれば、対象物を異なる媒体で、該対象物が夫々の媒体中で自然に存在する状態で検査可能となる。従って、環境は、適切な媒体すなわち環境を選ぶことによって所望の状態の対象物を提供するように選択できる。あるいは、異なる状態の対象物データを得るために幾つかの異なる媒体が使用できる。Ｃｏｍｅｔは分子に対しては、本来の場所でも溶液中でも使用できる。 従って、Ｃｏｍｅｔを使用すれば、対象物の三次元モデルが該対象物の自然な状態で得られる。対照的に結晶学では、対象物が結晶する環境でのみ研究可能である。この方法で得られた構造は、自然状態では存在することさえできないものもある。従って、結晶した対象物から得られたデータは、自然状態の対象物から得られたデータより有益性において劣る。

Ｃｏｍｅｔ技術を高照射量法で染色物質に用いると、分解能２−３ｎｍ、すなわち今日的水準が達成できる。低照射量法では分解能２−３ｎｍが達成できる。従って、この場合Ｃｏｍｅｔでは本来の場所での分子研究ができる。非染色物に対しＣｏｍｅｔはバッファー溶液中で約２ｎｍまで可能であり、先行技術と比較し大きな進歩である。

あるいは、Ｃｏｍｅｔ法の基本原理に基づいた方法も使用できる。例えば、何個かのサブルーチンのある特定要素を置き換えて、探索方向の数を増やし単なるエントロピー以外の他の基準あるいはより多くの基準を含めることができる。探索方向に関する各々のオペレーターの効果が修正できる。

これらの全ての場合において、分解能は平均法でさらに改良され得る。しかし 本発明の装置と方法では試料の個々の部分が上述の改良された分解能で分析され得る。ここでいう「個々の」という言葉は、同じ種類の数個の対象物の観察値の平均による方法ではなくて、分析が一つの単一対象物に参照されるという意味である。従って、本発明の方法では一つの単一対象物に基づくデータの分析あるいは画像が上述の分解能で可能である。

一方、「単―の」という言葉は、同じ種類の数個の対象物の観察値の平均による方法を除外しない。
本発明による方法は、試料と処理の完全体を最大限活用している。

本発明について、以下に添付図を参照して詳細に説明をする。
図１は本発明に従ってなされるステップのフローチャートである。いくつかの ステップは任意である。

ステップＳ１：試料を採取する。これには、所望分解能の程度に適切で、穏やかな試料の扱いが可能な既知の方法による。方法の例としては、生検や高分子のバッファー処理があげられる。
ステップＳ２：試料を薄いスライスにするなど顕微鏡検査用に調製する。クライオ超薄切片法や急速冷凍法が使用可能である。
ステップＳ３：（任意）必要であれば、試料をマーカー（例えば抗体）に暴露する。この際、試料を解凍する必要があれば、必要に応じて再冷凍する。あるいは試料はステップ２の前でマーカーに暴露してもよい。
ステップＳ４：画像情報、もし必要であれば他の情報やデータを顕微鏡内に集め分子分析を可能にする。詳細は下記参照。
ステップＳ５：（任意）顕微鏡ステップに関連のあるもの、無いもので、他のプロセスのステップ中の他のデータおよび情報の測定。
ステップＳ６：ステップＳ４で収集された画像情報を再構成する。本処理は上記に概説したＣｏｍｅｔ方法か修正方法に従って実行できる。詳細は下記参照。
ステップＳ７：（任意）ステップＳ６で得た再構成の情報内容を測定。
ステップＳ８：再構成および測定データを分析する。これは先行技術によって実施可能である。
ステップＳ９：（任意）再構成又は測定データを先行構造データまたはＮＭＲや結晶学で得られたデータと組み合わせる。
ステップＳ１０：先行データに基づく蛋白質モデル作成、すなわち蛋白質モデルをステップＳ１−Ｓ６を介して得た三次元再構成と共に使用。

ステップＳ１での試料採取では試料の処理に関する次の操作、すなわち、固化、凍結保護、染色、凍結、クライオセクショニング、高圧凍結を行うこともできる。
上記ステップＳ４およびＳ６ではヨーロッパの特許出願ＥＰ８８５４３０で定義されるＣｏｍｅｔ技術が下記で述べるように使用可能である。
上記ステップＳ４とＳ５ の順序は、プロセスを自動化するには逆にしても良い。

ステップＳ４では、以下のステップを追加できる。
フラットフィールド等に関する検知器特性
試料の寸法
低い倍率での試料の関連エリアの発見
倍率目盛較正
電子照射量
画像化データ収集前のフォーカスの一次決定

ステップＳ５では、以下のステップを追加できる。
電子エネルギー損失分光検査法
各画像のフォーカスの決定
試料と顕微鏡双方の特性を反映するポイントスプレッド関数の決定。

ステップＳ６では画像情報は、全データや画像に基づき逆重畳したＣｏｍｅｔに従って情報の改良により再構成するか、Ｃｏｍｅｔを用いて各二次元画像データを逆重畳し、次に改良して再構成する。

主につぎの３方法が使われる。
三次元データはポイントスプレッド関数を逆重畳していない前述二次元画像から再構成される。
三次元データはポイントスプレッド関数を逆重畳した前述二次元画像から再構成される。
三次元データが再構成される前にポイントスプレッド関数の逆重畳を含めた二次元画像の処理がなされる。この場合、三次元データの再構成には逆重畳はされない。

２番目の方法が最も良い結果をもたらす。３番目の方法すなわちＣｏｍｅｔを二次元画像に使用する場合、先行技術による分析および画像化プログラムと一緒に使うのに容易であるという利点がある。あるいはもし二次元画像を処理し、二次元プロジェクションだけで充分用が足りれば、三次元データを再構成しなくてもよい。二次元画像を三次元に結合する場合は、芯合わせが必要である。この処理はどのような既知の方法でもよい。例えば、試料中に金マーカーを配置する技術などである。

ステップＳ７測定では例えば信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比などが含まれる。データセットは統計か類似の方法により、質に基づいて数値データに分けられる。更なる研究には、ある基準を満たす画像のすべての部分を選択し、データマイニングを適用する。例えば、
少なくともある特定数の連続的な画素を有する部分
少なくともある体積をもつ部分
ある形に投影され得る部分
特定の強度分布がある構造

ステップＳ８では、再構成および測定データは手作業又はコンピュータで分析される。ステップＳ７で実施されたデータマイニングに基づいて、対象物又は対象物の一部が選択され、分析され、あるいは映像化される。そのような分析と映像化のためのプログラムが数個存在する。

ステップＳ９では、例えば、上述の一つ以上のステップで得られた形状／構造データを結晶学的方法によって得られた構造データと組合せて構造の校正、平均化すれば、偽似原子像が得られる。フレキシブルドッキング、すなわちデータの組み合せ前に対象物を修正するという手法を用いてもよい。あるいは、上述の一つ以上のステップで得られた形状／構造データを構造又は蛋白質モデリング法によって得られた構造データと組合せてもよい。対象物はトポロジー比較により分類される。比較用のモデルは、例えば、蛋白質構造についてのコンピュータ援用設計からいくつかの異なる方法で提供される。

Ｃｏｍｅｔ技術に対する数学的根拠の詳細説明は、ヨーロッパ特許出願ＥＰ ８８５４３０、特に第１４ページ，第２５行−ページ２８に記載されている。

図２は、本発明による図１で述べた方法を実行する装置を示す。
顕微鏡１は試料の画像化情報の収集に使われる。顕微鏡は対象物について断層撮影情報を収集できること、あるいは画像が断層撮影原理によらない場合は、画像化プロセスでの物理的変形が画像の解釈を障害しないこと。もし変形が表示されれば、Ｃｏｍｅｔで変形を補うことができる。

試料は図１のＳ１−Ｓ３ステップで概説されたように採取され調製される。コンピュータ３は画像情報の保存、処理に使用される。顕微鏡１によって集められた画像情報は画像記憶手段５に保存される。他のデータや情報、例えば、上述ステップＳ４およびＳ５に関連して述べたものはコンピュータへ入力し予備記憶手段７に保存され得る。構造データ記憶手段８があり、先行構造データ、例えば、ＮＭＲや結晶学で得られたものからなり、結果の改良に使用される。

コンピュータ３中の第一コンピュータ・プログラム９は、画像記憶手段５のデータに基づいて働き、顕微鏡１により収集された画像情報を再構成する。第一コンピュータ・プログラム９は、例えば、上記に概説したＣｏｍｅｔ法に従って働く。第二のコンピュータ・プログラム１１が存在し、第一コンピュータ・プログラム９により生成された再構成の情報内容を測定する。第三のコンピュータ・プログラム１３は、再構成され測定されたデータを分析するが、これは先行技術に従ってなされ得る。例えば、第三プログラム１３は、ある特定の形やサイズを持っている対象物を認識することができる。第三プログラム１３は、又、類似した構造のすべての対象物を同一オリエンテーションで表示するなど、対象物のバーチャル・リオリエンテーションが出来る。任意に、第一コンピュータ・プログラム６からの再構成あるいは測定データ出力を、構造データベース８に構成された先行構成データと組み合わせる第四のコンピュータ・プログラム１５があってもよい。プログラム９,１１,１３,１５のそれぞれからの出力は、結果データベース１７に保存できる。

コンピュータはオペレーター入力手段２１を通して操作できる。図２にはキーボードが表示されているが、勿論どんなオペレーター入力手段も使用できる。コンピュータにはまたオペレーターとの交信用にコンピュータスクリーン２３がついている。第一コンピュータ・プログラムによって作られた再構成はコンピュータ・スクリーン２３に表示できる。

もちろん、コンピュータ・プログラム９，１１，１３，１５は個別プログラムとして書かれる必要は無く、適切と思われるプログラム構造の中に１つあるいはそれ以上のプログラムとして実行できる。記憶手段５，７，８，１７も、また状況に合わせて、組み合わせても分割してもよい。また、コンピュータ・プログラム９，１１，１３，１５の一つもしくはそれ以上からの結果のデータを保存するのに、追加記憶手段が必要となる場合もある。

図１は本発明に従ってなされるステップのフローチャートである。いくつかの ステップは任意である。 図２は図１に述べた方法を実行するための本発明に従った装置を示す。

Claims (26)

1. 少なくとも一つの対象物の画像化方法において、
   顕微鏡を用いて試料についての画像情報を収集する、
   前記試料の画像化すべき部分を選択する（一つの体積として）、
   少なくとも1 回は収集画像情報との比較に基づき先の偏見分布が改良される反復再構成方法を用いて前述体積に対して収集された画像情報を再構成する、
   ステップからなる画像化方法。
2. さらに次の
   該体積中に少なくとも一つの対象物を選択する、
   該少なくとも一つの対象物に関する画像情報の一部を分析する、
   ステップを有する前記請求項記載の画像化方法。
3. 前記構成方法がＣＯＭＥＴ技術に基づく前記請求項のいずれか１項に記載の画像化方法。
4. さらに対象物の形状および／またはサイズに応じて、少なくとも一つの対象物を選択するステップを有している前記請求項のいずれか１項に記載の画像化方法。
5. さらに画像情報を収集する前に試料をマーカーに暴露するステップを有している前記請求項のいずれか１項に記載の画像化方法。
6. さらに再構成画像情報の情報内容を測定するステップを有している前記請求項のいずれか１項に記載の画像化方法。
7. 画像情報を収集するステップが数種の二次元画像の収集からなり、さらに二次元画像の芯合わせステップを有している前記請求項のいずれか１項に記載の画像化方法。
8. 収集画像情報を再構成するステップがポイントスプレッド関数を逆重畳せずに該二次元画像から三次元データを再構成する前記請求項のいずれか１項に記載の画像化方法。
9. 収集画像情報を再構成するステップがポイントスプレッド関数を逆重畳し該二次元画像から三次元データを再構成する請求項１ないし７のいずれか１項に記載の画像化方法。
10. 収集画像情報を再構成するステップがまず二次元画像のポイントスプレッド関数を逆重畳し、その後、ポイント・スプレッド関数を逆重畳せずに三次元データを再構成する請求項１から７のいずれか１項に記載の画像化方法。
11. さらにクライオ顕微鏡切片作製方法による試料の調製ステップを有する前記請求項のいずれか１項に記載の画像化方法。
12. さらに急速冷凍法による試料の調製ステップを有する前記請求項のいずれか１項に記載の画像化方法。
13. さらに再構成をコンピュータスクリーンに表示するステップからなる前記請求項のいずれか１項に記載の画像化方法。
14. 少なくとも一つの対象物の画像化装置で、
    顕微鏡を用いて収集された画像情報を受け取る手段、
    当該試料の画像化すべき部分を選択する手段（一つの体積として）、
    少なくとも１回は収集画像情報との比較に基づき先の偏見分布が改良される反復再構成方法を用いて収集された画像情報を前記体積に対し再構成する手段、
    のステップからなる画像化装置。
15. さらに次の、
    少なくとも一つの対象物を前述体積中に選択する手段、
    前記の少なくとも一対象物に関する画像情報の一部を分析する手段を有する請求項１４記載の画像化装置。
16. 収集画像情報を再構成する前記の手段がＣＯＭＥＴ技術に基づいた再構成方法を適用するように配置されている請求項１４から１５のいずれか１項に記載の画像化装置。
17. さらに少なくとも一つの対象物を対象物の形状および／またはサイズにより選択する手段を有する請求項１４から１６のいずれか１項に記載の画像化装置。
18. さらに再構成画像情報の情報内容を測定する測定手段(１１)を有する請求項１４から１７のいずれか１項に記載の画像化装置。
19. さらに試料に関する数個の二次元画像を調整するための芯合わせ手段を有する請求項１４から１８のいずれか１項に記載の画像化装置。
20. 収集画像情報の再構成（９）手段が、ポイントスプレッド関数を逆重畳せずに前記二次元画像から三次元データを再構成するよう配置されている請求項１４から１９のいずれか１項に記載の画像化装置。
21. 収集画像情報の再構成手段が、ポイントスプレッド関数を逆重畳し前記二次元画像から三次元データを再構成するよう配置されている請求項１４から２０のいずれか１項に記載の画像化装置。
22. 前記の収集画像情報の再構成手段が、まず前記二次元画像のポイントスプレッド関数を逆重畳し、つぎにポイントスプレッド関数を逆重畳せずに三次元データを再構成するよう配置されている請求項１４から２１のいずれか１項に記載の画像化装置。
23. さらに第一コンピュータ・プログラム（９）により生成された再構成の情報内容を測定するデータ処理手段（１１）を有する請求項１４から２２のいずれか１項に記載の画像化装置。
24. さらに試料に関するその他のデータを保存する予備メモリー手段（７）を有する請求項１４から２２のいずれか１項に記載の画像化装置。
25. さらに先行構造データを保存する構造メモリー手段（８）を有する請求項１４から１５のいずれか１項に記載の画像化装置。
26. 第一コンピュータ・プログラム（６）からの再構成あるいは測定データ出力を構造データベース（８）中で構成された先行構造データと結合させ再構成画像を改良するデータ処理手段（１５）を有する請求項１４から２２のいずれか１項に記載の画像化装置。

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