SE522852C2 - Metoder för klassificering av somatiska embryon - Google Patents

Description

uu.. -., u o noo- u 10 15 20 25 30 35 522 852 2 speciellt önskad klon. Slutligen placerades de outveck- lade embryona pà ett utvecklings- eller mognadsmedium där de växer till somatiska analoger till utvecklade frö- embryon. Dessa embryon väljs därefter individuellt och placeras pà ett groningsmedium för vidare utveckling.

Alternativt kan embryona användas för framställning av fröer.

Den allmänna, tekniska litteraturen är nu stor och patentlitteraturen avseende embryogenes för plantor växer stadigt. Exempel pà förfaranden för barrträdvävnadsodling finns i US-A-5 036 007 och US-A-5 236 841, innehavare Gupta et al; US-A-5 183 757, innehavare Roberts; US-A-5 464 769, innehavare Attree et al.; och US-A-5 563 061, innehavare Gupta.

Ett av de mera arbetsintensiva och subjektiva stegen i embryogenesförfarandet är att från utvecklingsmediet välja individuella embryon, som är lämpliga för groning.

Embryon kan föreligga i ett antal steg av mognad och utveckling. De som mest sannolikt gror framgångsrikt till normala plantor väljs företrädesvis med användning av ett antal visuellt utvärderade sorteringskriterier. Morfo- logiska särdrag, såsom axiell symmetri, hjärtblads- utveckling, ytstruktur, färg och dylikt, undersöks och appliceras som ett försök med godkänt/icke-godkänt innan embryona överförs för groning. Detta är ett svàrt, men làngtràkigt jobb, som tar tid och är dyrt. Vidare utgör det en stor flaskhals i produktionen när det slutliga, önskade resultatet är miljontals av plantor.

Det har föreslagits att man skulle använda någon form av instrumental av bildanalys för embryourval för att ersätta den visuella utvärdering, som beskrivits ovan. Vi refererar till exempel till Cheng, Z. och P.P.

Ling, Machine vision techniques for somatic coffee embryo morphological feature extraction, Trans. Amer. Soc. Agri.

Eng. 37: 1663-1669 (1994) eller Chi C.M., C. Zhang, E.J.

Staba, T.J. Cooke, och W-S. Hu, An advanced image analy- sis system for evaluation of somatic embryo development, annan 10 l5 20 25 30 35 522 852 3 (1996). Alla dessa metoder kräver avsevärda förbedömningar för vilka morfologiska Biotech. and Bioeng. 50: 65-72 särdrag är viktiga, och utveckling av matematiska metoder för att extrahera denna information från bilderna.

Relativt lite information från bilderna har verkligen använts.

Problemet med hur man på bästa sätt använder bild- analys för att automatiskt välja somatiska embryon efter att de separerats fràn restvävnad, skilts frän andra och avbildats i färg och från ett flertal positioner, har inte lösts pà ett framgångsrikt sätt. Olika metoder är kända för att ta fram information avseende storlek och form från scannade bilder. Som ett exempel beskriver Moghaddam et al. i US-A-5 710 833 ett förfarande, som är användbart för igenkänning av vilken som helst enhet med flera särdrag, såsom ett människoansikte. Sclaroff et al. beskriver i US-A-5 590 261 ett förfarande, som kan användas för avsikten att känna igen objekt.

Vad avser embryon, så skiljer sig morfologin mellan kloner inom en given art, vilket utgör ytterligare ett problem vid användning av scanningsteknologi. Skill- naderna mellan accepterade och avvisade embryon kan vara mycket subtila och variera med varje klon. Valet av selekteringskriterier för maskinanvändning tenderar således att vara subjektivt, svårt att specificera matematiskt och kan vara klonspecifikt.

Utvecklingen av snabba datorer och ny spektroskopisk hårdvara har lett till utveckling av nya instrument, som har förmågan att snabbt förvärva spektra på ett stort antal prov. Förvärvande av stora mängder spektraldata fràn ett prov nödvändiggör emellertid utveckling av likaledes kraftfulla dataanalysverktyg för att avslöja subtila förhållanden mellan de uppsamlade spektrerna och de kemiska egenskaperna hos provet. En sådan dataanalys- metodik, allmänt känd som kemometri, applicerar multi- variabla, statistiska tekniker på komplexa, kemiska system för att möjliggöra upptäckten av förhållanden a- 1 n avu- 10 15 20 25 30 35 522 852 n a | - u o | o o u. 4 mellan data fràn absorptions-, transmittans- eller reflektansspektra, som förvärvats fràn ett prov, och vissa specifika egenskaper hos provet, vilka kan mätas oberoende. Slutresultatet av multivariabelanalysen utgör utvecklingen av en förutsägande klassificeringsmodell som medger för nya prov med okända egenskaper att snabbt och korrekt klassificeras enligt en specifik egenskap, baserat pà den förvärvade spektraldatan. Multivariabla analystekniker, såsom principalkomponentanalys (PCA)och en principalkomponent-baserad metod, riktad mot latenta strukturer (PLS), har använts för att utforska den multi- variabla informationen i tidigare applikationer av nära infraröd (NIR) spektroskopi inom pappersmassa- och pappersindustrin för att utveckla klassificeringsmodeller för papperskvalitet. Se till exempel US-A-5 638 284, US-A-5 680 320, US-A-5 680 321 och US-A-5 842 150.

Sammanfattning av föreliggande uppfinning Föreliggande uppfinning är baserad pà klassificering av växtembryon genom applicering av klassificerings- algoritmer pà digitala bilder och absorptions-, transmittans- eller reflektansspektra fràn embryon.

Metoderna kan appliceras allmänt och lägger tonvikten pà betydelsen av förvärvande och användning av så många bilder och sà mycket absorptions-, transmittans- eller reflektansspektralinformation som möjligt baserat pà objektiva kriterier. Ett màl har varit automatisk klassificering och urval av embryon, vilka är lämpligast för vidare odling och förkastade av de som verkar mindre lämpliga. Tekniken kan utnyttja mer komplex bild- teknologi, till exempel bilder som tagits fràn flera hàll och bilder i färg eller fràn icke-visuella delar av det elektromagnetiska spektrumet.

I en aspekt av föreliggande uppfinning tillhanda- hàlles en metod för klassificering av växtembryon enligt embryokvalitet. Metoden utvecklar först en klassifice- ringsmodell genom förvärvande av rà, digital bilddata för 522 852 o u o n ; | n nu 5 referensprov av växtembryon av känd embryokvalitet.

Eventuellt förbehandlas den råa, digitala bilddatan med användning av en eller flera förbehandlingsalgoritmer för att reducera mängden rå bilddata, men ändå bibehålla 5 huvudsakligen all bilddata som innehåller geometri och färginformation avseende embryot eller embryoorganet. Ett exempel av en sådan valfri förbehandlingsteknik in- begriper borttagning av bilddata som inte härstammar från växtembryot eller växtembryoorganet. Ett annat, valfritt 10 förbehandlingssteg resulterar i beräkning av metrik, som lägger tonvikten vid bildsärdrag, som är speciellt viktiga vid embryokvalitetklassificering. Dataanalysen utförs på den råa, digitala bilddatan eller på den förbehandlade bilddatan beroende på vilken metod som 15 följs med användning av en eller fler klassificer- ingsalgoritmer för att utveckla en klassificeringsmodell för klassificering av växtembryon enligt embryokvalitet.

Under denna dataanalys använder en eller flera av klassificeringsalgoritmerna rå digital bilddata, som 20 representerar mer än bara embryoperimetern, eller den förbehandlade bilddatan för att utveckla klassifi- ceringsmodellen. Embryokvaliteten på referensproven bestäms med referens till sådana kvaliteter som morfologisk jämförelse med normala, zygotiska 25 växtembryon, bestämning av referensembryonas omvandlingspotential, resistens mot patogener, motstånd mot torka och liknande. Rå, digital bilddata för växt- embryon av okänd embryokvalitet förvärvas sedan med 7"É användning av samma metoder som utförts med referens- 30 proven. Den förvärvade råa, digitala, bilddatan analy- seras sedan med användning av klassificeringsalgorit- xfl, merna, som använts för att utveckla klassificerings- modellen för att klassificera kvaliteten på växtembryot av okänd kvalitet. En mera robust metod erhålls genom 35 förvärvande av rä, digital bilddata av ett flertal vyer av embryot, såsom ändvyer av embryot och/eller longitud- vyer. 10 15 20 25 30 35 522 852 6 I en annan aspekt av föreliggande uppfinning klassificeras växtkvalitet genom utveckling av en enkelmetrikklassificeringsmodell genom förvärvande av rä, digital bilddata för referensprov av hela växtembryon eller någon del därav från växtembryon av känd embryo- kvalitet. Ett metrikvärde beräknas fràn den förvärvade, råa, digitala bilddatan för varje embryo av känd kvalitet. Metrikvärdena delas sedan i två uppsättningar av metrikvärden baserat pà den kända embryokvaliteten. En Lorenz-kurva beräknas fràn varje uppsättning av metrik- värden. Ett gränsvärde bestäms från en punkt pà Lorenz- kurvan, vilket fungerar som en enkelmetrikklassifi- ceringsmodell för att klassificera växtembryon med avseende pà embryokvalitet. Rà bilddata för ett helt växtembryo eller någon del därav förvärvas fràn ett växt- embryo av okänd kvalitet. Enkelmetrikklassificerings- modellen, som utvecklats fràn embryona av känd kvalitet, appliceras pà den ràa bilddatan, som förvärvats från växtembryon av okänd kvalitet, för att klassificera kvaliteten på det okända växtembryot. Enkelmetrikklassi- ficeringsmodeller kan eventuellt kombineras med använd- ning av en eller flera klassificeringsalgoritmer för att utveckla mera kraftfulla klassificeringsmodeller för klassificering av växtembryon enligt embryokvalitet.

I en annan utföringsform av föreliggande uppfinning klassificeras växtembryokvalitet genom uppsamling av data frän absorptions-, transmittans- eller reflektansspektra fràn växtembryon eller delar därav och bearbetning av datan med användning av klassificeringsalgoritmer.

Metoden enligt uppfinningen kräver först att en klassi- ficeringsmodell utvecklas genom förvärvande av ràdata från absorptions-, transmittans- eller reflektansspektra fràn referensprov av växtembryon eller delar därav vars embryokvalitet är känd. I en alternativ utföringsform förbehandlas den spetrala ràdatan i sin helhet eller i specifika delar därav före tillverkning av klassificeringsmodellen för att bland annat reducera brus n o n u ø c n ø u o. lO 15 20 25 30 35 522 852 ø a | u ; ø ø nu 7 och justera för drift och diffus ljusspridning. Klassifi- ceringsmodellen görs sedan genom att en dataanalys utförs med användning av klassificeringsalgoritmer på den för- bearbetade spektrala rådatan. Ràdata från absorptions-, transmittans- eller reflektansspektra förvärvas sedan från ett växtembryo av okänd embryokvalitet. Den spekt- rala ràdatan, som samlats upp från embryot av okänd kvalitet, appliceras antingen direkt på embryokvalitet- klassificeringsmodellen eller förbehandlas för att reducera brus och justera för drift och diffus ljus- spridning för att därefter appliceras pà klassifice- ringsmodellen beroende på vilken metod som har tillämpats för att göra den använda klassificeringsmodellen. I vartdera fall medger applicering av den okända spektral- datan på klassificeringsmodellen klassificering av kvaliteten på växtembryot av okänd växtembryokvalitet.

Kort beskrivning av ritningarna De föregående aspekterna av och många av fördelarna med föreliggande uppfinning kommer att inses allt eftersom uppfinningen förstås bättre med hjälp av den följande detaljerade beskrivningen när den läses till- sammans med de medföljande ritningarna, vari: Fig 1 visar en schematisk bild av ett träembryo 8.

De inringade områdena representerar embryoregionerna, som skildrar de tre embryoorganen kända som hjärtblad 10, hypokotyl 12 och lillrot 14.

Fig 2A visar ett resultatdiagram, som erhållits från principalkomponentanalys av spektraldata, som samlats upp från zygotiska embryon från Douglas-barrträd i tre olika utvecklingsstadier och en uppsättning av somatiska embryon (genotyp 1) av Douglas-barrträd. Enheterna för principalkomponentaxlarna (PC-axlarna) är universal standardavvikelse för uppsättningen.

Fig 2B visar lastspektra för varje PC, som avbildats i fig 2A. Varje kurva visar det relativa bidraget som 10 l5 20 25 30 35 522 852 §ï?fi;{}É¿B" a : a 4 »n o 8 varje våglängd gör i redovisningen för variansen, som skildrats längs resultataxlarna i fig 2A.

Fig 3A visar ett resultatdiagram, som erhållits från principalkomponentanalys av spektraldata, som samlats från zygotiska embryon från loblolly tall i två olika utvecklingsstadier och två uppsättningar av somatiska embryon (genotyp 5 och 7). Enheterna på PC-axlarna är universal standardavvikelse för uppsättningen och överträdelsen av nollaxlarna är en normal betingelse hos alla embryon.

Fig 3B visar lastspektra för varje PC, som skildrats i fig 3A. Varje kurva visar det relativa bidraget som varje våglängd gör i redovisningen för variansen, som skildrats längs resultataxlarna i fig 3A.

Fig 4A visar ett resultatdiagram, som erhållits från principalkomponentanalys av spektraldata, som samlats upp från somatiska embryon (genotyp 2) från Douglas-barrträd, vilka förelåg i hjärtbladsstadiet och vilka hade ”god” eller ”dålig” embryomorfologi. Enheten pà PC-axlarna är universal standardavvikelse för uppsättningen.

Fig 4B visar lastspektra för varje PC-skildring i fig 4A. Varje kurva visar det relativa bidraget som varje våglängd gör i redovisningen för variansen, som skildrats längs resultataxlarna i fig B.

Fig 5A visar ett resultatdiagram, som erhållits från principalkomponentanalys av spektraldata, som samlats upp från somatiska embryon (genotyp 5) av arten loblolly tall i hjärtbladsstadiet, vilka har ”god” och ”dålig” embry- omorfologi. Enheterna på PC-axlarna är universal standardavvikelse för uppsättningen.

Fig 5B visar lastspektra för varje PC, som skildrats i fig 5a. Varje kurva visar det relativa bidraget som varje våglängd gör i redovisningen för variansen, som skildrats längs resultataxlarna i fig 5A.

Fig 6A visar ett resultatdiagram, som erhållits från principalkomponentanalys av spektraldata, som samlats upp från somatiska embryon (genotyp 3) av arten Douglas- n s n ø ~ n u o nu vara: 10 l5 20 25 30 35 522 352 - 9 barrträd. De scannade, somatiska embryona förelåg i två olika utvecklingsstadier, hjärtbladsstadiet och ”kupol” (dome)- eller ”enbart hjärtblad” (just cotyledon)- stadiet. Enheterna pà PC-axlarna utgör universal standardavvikelse för uppsättningen.

Fig 6B visar lastspektra för varje PC, som skildrats i fig 6A. Varje kurva visar det relativa bidraget som vardera våglängd utgör i redovisningen för variansen, som skildrats längs resultataxlarna i fig 6A.

Fig 7A visar ett resultatdiagram, som erhållits från principalkomponentanalys av spektraldata, som samlats upp från somatiska embryon (genotyp 3 och 4) av arten Douglas-barrträd. Uppsättningen av somatiska embryon från vardera genotyp utsattes antingen för en kall behandling (vilket förbättrar groningen) eller erhölls utan kall behandling (kontroll). Enheterna pà PC-axlarna var universal standardavvikelse för uppsättningen.

Fig 7B visar lastspektra för varje PC, som skildrats i fig 7A. Varje kurva visar det relativa bidraget som vardera våglängd utgör i redovisningen för variansen, som skildrats längs resultataxlarna i fig 7A.

Fig 8A visar ett resultatdiagram, som erhållits från principalkomponentanalys av spektraldata, som samlats upp från somatiska embryon (genotyp 5 och 7) av typen loblolly-tall i hjärtbladsstadiet. En uppsättning av somatiska embryon från vardera genotyp utsattes antingen för en kall behandling (vilket förbättrar groning) eller erhölls utan kall behandling (kontroll). Enheterna på PC- axlarna var universal standardavvikelse för uppsätt- ningen.

Fig 8B visar lastspektra för varje PC, som skildrats i fig 8A. Varje kurva visar det relativa bidraget som vardera våglängd utgör i redovisningen för variansen, som skildrats längs resultataxlarna i fig 8A. 10 15 20 25 30 35 ø~ 522 852 a' 2: 10 Detalfierad beskrivning av den föredragna utföringsformen Metoderna enligt föreliggande uppfinning används för att klassificera vilka som helst typer av växtembryon, sàsom zygotiska och somatiska embryon med avseende pà vilken som helst embryokvalitet, som är tillgänglig för karaktärisering. Embryokvalitet kan till exempel defi- nieras med användning av morfologiska kriterier, sàsom axial symmetri, hjärtbladsutveckling, ytstruktur och färg. Med uttrycket ”zygotisk morfologi" avses morfolo- giska kriterier, sàsom axial symmetri, hjärtblads- utveckling, ytstruktur och färg, som är karaktäristiska för ett normalt, zygotiskt växtembryo. Alternativt kan embryon klassificeras med användning av utvecklings- eller funktionskriterier, sàsom embryogroning, och efterföljande växttillväxt och utveckling, vilket ofta kollektivt betecknas i litteraturen som "omvandling". Med uttrycket ”omvandlingspotential” avses förmågan hos ett somatiskt embryo att gro och/eller överleva och växa i jord, vilket tidigare utsatts för torkning eller kallbehandling eller inget därav. Dessutom avser ”växtembryokvalitet” andra växtegenskaper, sàsom motståndskraft mot patogener, torkresistens, värme- och köldresistens, salttolerans, preferens med avseende pà ljuskvalitet, lämplighet för làng förvaring av somatiska embryon eller vilken som helst annan växtkvalitet, som är avgörande för förökningen.

Embryon fràn alla växtarter kan appliceras i metoderna enligt föreliggande uppfinning. Metoderna är speciellt användbara inom applikationen agrikulturella växtarter, där stora antal somatiska embryon används för att föröka önskvärda genotyper, sàsom med skogsträarter.

Närmare bestämt kan metoderna användas för klassificering av somatiska embryon fràn barrträdsfamiljen Pinaceae, i synnerhet från släkten: Pseudotsuga och Pinus. En schematisk ritning av ett pseudotsuga-träembryo 8 visas i fig l, i vilken de allmänna positionerna för de tre 10 15 20 25 30 35 522 852 ll embryoorganen hjärtblad 10, hypokotyl 12 och lillrot 14 är indikerade.

I en utföringsform av föreliggande uppfinning förvärvas bilder av växtembryon eller växtembryoorgan i en digital form genom att en eller flera vyer av embryot eller organen scannas från ett flertal positioner med användning av känd teknik, sàsom elektronisk kamera, som innehåller en laddningskopplad anordning (CCD) kopplad till en digital lagringsdel. En klassificeringsmodell för växtembryokvalitet utvecklas sedan genom att en data- analys utförs pà den digitala bilddatan med användning av en eller flera klassificeringsalgoritmer. Exempel pà sådana klassificeringsalgoritmer omfattar, men är inte begränsade till principalkomponentanalys (se till exempel Jackson, J.E., A User's Guide to Principal Components, John Wiley and Sons, New York (1991); Jolliffe, I.T., Principal Components Analysis, Springer-Verlag, New York (l986); Wold, S., Pattern recognition by means of disjoint principal components models, Pattern Recognition 8: 127-139 (1976) och Watanapongse, P. and H.H. Szu, Application of Principal Wavelet Component in Pattern Classification, Proceedings of SPIE, Wavelet Applications v, H.H. szu, Editor, vol 3391, sid 194-205 (1998)), artificial neural networks (Mitchell, Tom M. Machine Learning, WCB/McGraw-Hill sid 112-115, Classifiers (Mitchell at 174-176), Probably Approximately Correct (PAC) Learning (Mitchell at 203-220), Radial Basis Functions which includes the statistical technique (1997)), Bayesian of fitting mixture distribution models to data (Mitchell, sid 238-240), and Nearest-Neighbor Methods (Mitchell at 231-236). algoritmerna tillhandahàlles en ny klassificerings- Förutom de tidigare nämnda klassificierings- algoritm i föreliggande uppfinning för att klassificera växtembryon baserat pà Lorenz-kurvan. För kort introduk- tion till Lorenz-kurvan se Johnson, S. Och N.L. Kotz, Eds. Encyclopedia of Statistical Scienses, John Wiley, vol 5, sid 156-161 (1985). 10 15 20 25 30 35 - . ~ . n 522 852 ffiHfiâïÉ_{P 12 Det är också välkänt inom omrâdet för dataanalys att flera olika algoritmer förutom principalkomponentanalys (PcA) ficeringsmodeller. Närmare bestämt kan de följande kan användas för att utveckla och använda klassi- statistiska teknikerna också appliceras i föreliggande uppfinning: Partial Least Squares Regression, Principal Components Regression (PCR), Multiple Linear Regression Analysis (MLR), Correlation Analysis, Multivariate Multiple Regression, Discriminant Analysis, Canonical Classification Analysis, Regression Tree Analysis, vilken omfattar Classification Analysis by Regression Trees (CARTW , CA) , Probit Regression. Se US-A-5 842 150 och (Mitchell, Tom Salford Systems, San Diego, och Logistic and M. Machine Learning, WCB/McGraw-Hill sid 112-115, 238-240' (1997)).

Klassificeringsmodellen härleds fràn en "tränings"- datauppsättning av ett flertal bilder av plantembryon eller plantembryoorgan, som förvärvats fràn embryon med känd embryokvalitet. Embryon, uppsättningsbilder är klassificerade som acceptabla eller som ger "tränings"- oacceptabla baserat pà biologiska faktadata, sàsom morfologisk likhet med normala, zygotiska embryon eller bevisad förmåga att gro eller omvandlas till planta.

Metoderna enligt föreliggande uppfinning är allmänt applicerbara pä vilken som helst växtkvalitet som är möjlig att kvantifiera. Oklassificerade embryon klassi- ficeras som acceptabla eller ej baserat på hur nära bilderna av de oklassificerade embryona passar klassi- ficeringsmodellen, som utvecklats från "tränings"- uppsättningsgrupperna.

Med uttrycket ”klassificeringsalgoritm” avses vilken som helst sekvens av matematiska eller statistiska beräkningar, formler, funktioner, modeller eller över- föringar av bilder eller spektraldata frän embryon, som används för avsikten att klassificera embryon enligt embryokvalitet. En klassificeringsalgoritm kan ha bara ett steg eller flera. Dessutom kan klassificerings- = « n n | o u n. n u.

Q 10 l5 20 25 30 35 522 852 93 _;", 13 algoritmerna enligt föreliggande uppfinning konstrueras genom kombination av mellanliggande klassificerings- modeller eller enkelmetrikklassificeringsmodeller, genom användning av matematiska algoritmer, såsom Bayes' opti- mala klassificerare (Bayes optimal classifier), artifi- ciellt neuronnät eller Lorenz-kurvan. Förutom enkel- metrikklassificeringsmodellerna härstammar bildklassifi- ceringsmodellerna enligt föreliggande uppfinning fràn en dataanalys av mer än bara embryoperimeterbilddata, som förvärvats fràn växtembryon eller embryoorgan under träningsdelen, som leder till identifiering av en embryo- kvalitetklassificeringsmodell. Således utvecklas klassi- ficeringsmodellerna enligt föreliggande uppfinning med användning av àtminstone en klassificeringsalgoritm, som beaktar mer än den förvärvade råa, digitala bilddatan än vad som krävs för att definiera perimetern av embryot.

Detta gäller inte för de enkla, metriska klassificerings- modellerna. Klassificeringsalgoritmerna utför således en dataanalys som resulterar i utveckling av en klassifice- ringsmodell fràn bilden eller spektraldatan utan att nägra subjektiva antaganden görs avseende vilka data- särdrag som är viktiga för embryokvalitetsklassificering_ Med uttrycket ”embryoperimeter” avses bildpunkterna i rå, digital bilddata eller förbehandlad, digital bild- data, vilken definierar den yttre perimetern av ett avbildat embryo.

Valfritt kan den ràa, digitala bilddatan för- behandlas med användning av förbehandlingsalgoritmer. Med uttrycket "förbehandlingsalgoritm” avses vilken som helst sekvens av matematiska eller statistiska beräkningar, formler, funktioner, modeller eller överföring av bilder eller spektraldata från embryon, vilka används för avsikten att manipulera bild eller spektraldata för att: 1) ta bort bild- eller spektraldata som härstammar fràn icke-embryokälla, dvs ljusspridning i bakgrunden eller andra bruskällor; 2) reducera storleken pà den digitala datafilen, som används för att representera den för- 10 15 20 25 30 35 522 852 23-: 14 värvade bilden eller spektrumet av embryot, medan huvudsakligen all data, som representerar informativa särdrag, såsom geometrisk embryoform och ytstruktur, färg och ljusabsorbans, transmittans eller reflektans bibehål- les i den förvärvade bilden eller spektrumet; och 3) beräkna metrik från den förvärvade, råa bilden eller spektraldatan och från värdena, som erhållits under andra förbehandlingssteg, för att identifiera och framhäva embryodata, som är användbara vid utveckling av en embryokvalitetklassificeringsmodel1.

I US-A~5 842 150 beskrivs att NIR-spektraldata kan förbehandlas före flervärdslumpvariabelanalys med användning av Kubelka-Munk-transformation, the Multiplicative Scatter Correction (MSC), till exempel upp till fjärde ordningens derivator, Fourier-transformation eller genom användning av "Standard Normal Variate"- transformation, vilka alla kan användas för att reducera brus och justera för drift och diffus ljusspridning.

Alternativt kan mängden digital data, som krävs för att motsvara en förvärvad bild eller spektrum av ett embryo, reduceras med användning av förbehandlings- algoritmer, såsom upplösning av krusning (wavelets). Se till exempel Chui, C.K., An Introduction to Wavelets, Adademic Press, San Diego (1992); Kaiser, Gerald, A Friendly Guide to Wavelets, Birkhauser, Boston; och Strang, G. och T. Nguyen, Wavelets and Filter Banks Wellesley-Cambridge Press, Wellesley, Massachusetts.

Wavelet-upplösning har använts i stor omfattning för att reducera mängden data i en bild och för att hämta och beskriva särdrag från biologisk data. Wavelettekniker har till exempel använts för att reducera storleken på filer med fingeravtryck för att minimera lagringskraven i en dator. Ett biologiskt exempel är utvecklingen av ett förfarande för diagnostisering av obstruktiv sömnapné från waveletupplösning av hjärtslagsdata. Wavelets möjliggör omordnande av informationen i en bild av ett embryo till storlek och särdragskategorier. Data avseende 10 15 20 25 30 35 15 storlek och form kan till exempel separeras från struktur. Resultaten av en waveletupplösning eller funktioner därav används sedan som ingående information i klassificeringsalgoritmerna, som beskrivits ovan. En mängd olika andra interpoleringsmetoder kan användas för att på samma sätt reducera mängden data i en bild eller spektraldatafil, såsom beräkning av intilliggande medelvärde, Spline-metoder (se till exempel C. de Boor, A Practical Guide to Splines, Springer-Verlag (1978)).

Kriging-metoder (se till exempel Noel A.C. Cressie, Statistics for Spatial Data, John Wiley, 1993)) och andra interpoleringsmetoder, som vanligtvis är tillgängliga i mjukvarupaket som avser bild- och matrishantering.

Andra förbehandlingsalgoritmer kan användas för att behandla data, som samlats upp fràn ett embryo för att erhålla den kraftfullaste korrelationen av den förvärvade datan avseende embryokvalitet. I exempel 1 beräknades till exempel flera statistiska värden för att återskapa viss datainformation som hade gått förlorat när en waveletupplösning användes för att reducera storleken på bilden. Den àterskapade informationen, som återgavs i metriken medgav utveckling av en klassificeringsmodell som var bättre i att förutspå embryokvalitet än en modell, som utvecklats från principalkomponentanalys av bilddata, som hade förbehandlats med användning av waveletmetoder. Med uttrycket ”metrik” avses vilket som helst skalärt statistiskt värde som fångar geometri, färg eller spektrala särdrag, som innehåller information om embryona, såsom central och icke-central betydelse, funktion av spektral energi vid specifika våglängder eller vilken som helst funktion av en eller flera av dessa karakteristika. I bildbehandlingsspråk är metrikuppsättningar också kända som särdragsvektorer.

Dessutom kan metrik erhållas från externa beaktanden, såsom embryobehandlingskostnad, embryobehandlingstid och komplexitet i ett löpande band för sortering av embryon med avseende på kvalitet. 10 15 20 25 30 35 522 852 | | v ~ -q 16 I en annan utföringsform av föreliggande uppfinning scannas embryoregioner och spektraldata förvärvas avseende absorption, transmittans eller reflektans av elektromagnetisk strålning (härefter betecknad som ljus) vid flera enskilda våglängder inom intervallet 180-4000 nm. Skillnader i spektraldata, som samlats upp fràn embryon med hög kvalitet (till exempel hög omvandlings- potential eller hög morfologisk likhet med normala, zygotiska embryon) i jämförelse med de med làg kvalitet antas reflektera skillnader i kemisk sammansättning som är relaterade till embryokvalitet. Ett antal olika studier har fastställt att embryokvalitet är relaterad till grov kemisk sammansättning i embryot eller dess delar, speciellt mängden vatten och lagringsföreningar (proteiner, lipider och kolhydrater). Vissa exempel omfattar Chanprame. S., T.M. Kuo och J.M. Widholm, Soluble carbohydrate content of soybean (Gycine max (L.) Merr.) somatic and zygotic embryos during development, In Vitro Cell Dev. Biol-Plant. 34: 64-68 (l998); Dodeman, V.L., M. Le Guilloux, G. Ducreux, och D. De Vienne, Somatic and zygotic embryos of Daucus carota L. display different protein patterns until conversation to plants, Plant Cell Physiol. 39: 1104-1110 (l998); MOrCillO, F.F.

Aberlenc-Bertossi, S. Hamon och Y. Duval, Accumulation of storage protein and 7S globulins during zygotic and somatic embryo development in Elaeis guineensis, Plant Physiol. Biochem. 36: 509-514 (l998); och Obendorf, R.L., A.M. Dickerman, T.M. Pflum, M.A. Kacalanos, och M_E.

Smith, Drying rate alters soluble carbohydrates, desiccation tolerance, and subsequent seedling growth of soybean (Glucine mac L. Merrill) zygotic embryos during in vitro maturation, Plant Sci. 132: l-12 (1998).

Spektrometrisk analys av embryon kan utföras med användning av en uppsättning för datauppsamling, vilken omfattar en ljuskälla, ett mikroskop, en ljussensor och en processor. Företrädesvis genomgår varje embryoregion ett flertal ljusscanningar för att erhàlla ett repre- »»|uu 10 l5 20 25 30 35 g u uu. u n uu u ou o I u! I I u uu u » u u u nu u u uu u u u uu , u u u ,. v u o u u u p u nu u u u > -1 u u u u o u u ß I I 0 I u u u u u u o ~ I I I v uu uu nu uuu nu. 17 sentativt medelspektrum. Dessutom är det användbart att processorn innefattar ett inbyggt kalibreringsprogram, som periodvis kör igenom datauppsamlingsfasen för att rekalibrera den inre baslinjen för kompensation för mörkerström och för rekalibrering mot det vita standard- bakgrundsmaterialet på vilket embryot placerats.

Ljussensorn har företrädesvis ett mätningsintervall av högst 10 nm, företrädevis 2 nm och helst 1 nm eller midre. Ljusdetektionen utförs i vàglängdsintervallerna för ultraviolett, visuellt och nära infraröd (inkl Raman- spektroskopi) av 180-4000 nm. Detta kan åstadkommas med användning av ett scanningsinstrument, ett diodgruppe- ringsinstrument, ett Fourier-omvandlingsinstrument och vilken som helst annan liknande utrustning, som är känd för fackmannen inom området.

Klassificeringen av embryon med avseende på kvalitet (såsom definierats ovan) med hjälp av spektrometriska mätningar omfattar två huvudsteg. Det första steget är utvecklingen av en klassificeringsmodell, vilket in- begriper understegen med utveckling av träningsupp- sättningar och tvärsutvärderingsuppsättningar. Spektral- data förvärvas från embryon eller embryoregioner av känd embryokvalitet, eventuellt utförs en förbehandling av den förvärvade spektraldatan och därefter utförs en data- analys med användning av en eller flera klassificerings- algoritmer för att utveckla en klassificeringsmodell med avseende pà embryokvalitet. Det andra huvudsteget är förvärvande av spektraldata från ett embryo vars kvalitet är okänd, därefter kan valfritt den förvärvade spektral- datan förbehandlas följt av dataanalys med användning av klassificeringsmodellen, som utvecklas i det första huvudsteget.

Modellträningsuppsättningar omfattar ett stort antal absorptions-, transmittans- eller reflektansspektra, som erhållits från embryon som har en känd hög eller låg kvalitet. Träningsuppsättningarna används i klassifi- ceringsalgoritmerna för att utveckla en klassificerings- lO 15 20 25 30 35 522 852 z'=s"==.pd_.-' -= l8 modell. Sàsom tidigare noterats finns en mängd olika förbehandlingsalgoritmer tillgängliga, vilka kan användas för att reducera brus och justera för baslinjedrift. För vissa datauppsättningar är det emellertid inte nödvändigt att man förbehandlar datan för att reducera bakgrunds- brus.

Det finns många dataanalysmetoder som kan appliceras för att utveckla och använda klassificeringsmodeller som medger för plantembryon att klassificeras med avseende pà kvalitet. De ovan beskrivna, matematiska metoderna är ett prov pà några av de viktiga teknikerna. Man bör emeller- tid inse att dataanalystekniker kan sättas samman till ett näst intill obegränsat antal kombinationer för att uppnå de önskade resultaten. En metod med ”soft independent modeling of class analogy (SIMCA)” kan till exempel användas för bilder av embryon, som har färg- informationen utplattad till en enda gruppering med användning av principalkomponenter, och därefter kan resultatet krympas med användning av wavelets. SIMCA kan sedan användas för att bygga principalkomponentregres- sionsmodeller för varje klassificeringskategori. Bayes' optimala klassificerare kan sedan användas för att kombinera klassificeringsbesluten fràn sex SIMCA- modellpar. "Partial least squares regression" kan användas i stället för principalkomponentregression i SIMCA-steget. På liknande sätt kan artificiellt neuronnät användas i stället för Bayes' optimala klassificerare för att kombinera klassificeringsbesluten till en slutlig klassificeringsmodell.

Metoderna, som beskrivits för klassificering av växtembryon med användning av embryobilder eller absorptions-, transmittans- eller reflektansspektraldata kan dessutom kombineras tillsammans pà ett antal olika sätt. Datanalys av den förvärvade, råa, visuella spektraldatan kan till exempel utföras parallellt för att utveckla en enhetlig klassificeringsmodell eller sä kan analysen utföras i serier, varvid två oberoende klassi- u u.. .~«~ o 10 15 20 25 30 35 522 8 52 E; '= 19 ficeringsmodeller utvecklas med användning av bilden och spektraldatan separat. Många permutationer av för- farandena, som beskrivits häri, är möjliga för att åstadkomma klassificering av växtembryon med avseende pà embryokvalitet.

De följande, icke-begränsande exemplen illustrerar metoderna enligt föreliggande uppfinning och användningen därav för klassificering av växtembryon vilka mest sannolikt är framgångsrika i groning och att ge normala växter.

Exempel 1 Matematiska metoder Det finns tre huvudsteg vid användning av ljusbilder för att separera somatiska embryon. De är: 1) rengöring av bilderna för att ta bort rä bilddata, som inte härstammar fràn växtembryot eller embryoorganet; 2) reduktion av mängden rä bilddata, som förvärvats från embryot eller embryoorganet, medan man bibehåller så mycket embryoinformation som möjligt; och 3) applicering av en eller flera klassificeringsalgoritmer för att utveckla och använda en klassificeringsmodell för växt- embryokvalitet.

Rengöring av bilder Bildrengöring kräver att bakgrunden i en bild byts ut mot nollor eller helt svart. Anledningen till detta är att man reducerar variationen mellan bilder. Det är önskvärt att enbart skillnader mellan bilderna beror pà embryot så att jämförelserna inte förvirras av för- ändringar i bakgrund. Eftersom bilderna förstoras, förstoras små variationer i position, reflektioner, blänk fràn restmaterial från tidigare embryon och detta bidrar till skillnaderna mellan bilderna. Rengöring avser de bildbehandlingssteg, som används för att eliminera alla variationer i bakgrunden. p e n u n n a u ø | no n :nu 522 852 ' o o . . u s n u n u: 20 Det finns inget fastställt recept för rengöring av embryobilder, eftersom det förutses att allt eftersom ny bildhàrdvara och -mjukvara utvecklas kommer lämpligare bildrengöringstekniker att utvecklas. Flera tekniker är 5 emellertid allmänt användbara. Exemplen, som beskrivits nedan, är enbart avsedda för illustration och är inte avsedda att pà något sätt begränsa föreliggande upp- finning.

I exemplen som följer separeras embryobilden, dess 10 reflektion pà ställningen och kvarstående bakgrund fràn varandra med användning av enbart den röda komponenten i färgbilden. Histogrammet för de röda pixelvärdena förvrängdes positivt. En blandningsfördelning, som sammansattes av tre normala fördelningar, passades in 15 till histogrammet med hjälp av EM-algoritmen. För en kort beskrivning av EM-algoritmen (se Mitchell, Tom M. Machine Learning, WCB/McGraw-Hill, sid 191-196 (1997). Den första normalen tog upp bakgrunden, den andra normalen tog upp reflektionen och den tredje komponenten tog upp embryot. 20 Medelvärdet av den andra normalen plus tvä gånger dess standardavvikelse användes som gräns mellan reflektionen och embryot. Detta värde angavs som gränsvärde för den röda bilden. Den resulterande binära bilden hade fort- farande nägra pixlar inkluderade i sig, vilka tillhörde 25 reflektionen. Dessa togs bort genom användande av morfologiska operationer på den binära bilden. En till tre erosioner följt av samma antal dilatationer är vanligtvis lyckosamma för rengöring av bilden. Ibland U' behövdes nägra extra dilatationer för att återställa 30 embryodelen av den binära bilden till sin rätta storlek.

. Eventuella häl i embryodelen av den binära bilden fylldes u a-.. -.... ~ ; då. Den resulterande binära bilden användes sedan för att ff: beskära färgbilden och för att nollställa alla icke- embryodelar av bilden. Var och en av de tre färg- 35 matriserna i den ursprungliga bilden multiplicerades med den binära bilden och beskars sedan inom tvâ pixlar fràn 10 15 20 25 30 35 n o nun n »n n nn n nn n n v v on n - o u n nn n n vn I 'I v n on n « v n u n v n n IIIO .nn ann 1. . n n nu n n n n n o v s n n ., v n n o n n n n o n n n n - n. nu on uno nnnn n n 21 embryot. Denna metod fungerade för alla tre vyer av embryot.

En annorlunda metod för rengöring av var och en av de tre embryovyerna kan alternativt användas. I denna alternativa metod förbehandlades den longitudinella toppvyn av embryot genom att först omvandla de röd-grön- blåa värdena till färgtoner. Färgmättnad och ljusstyrka behövdes inte för denna vy. Genom att ta kotangenten av l/255-del av färgtonen gjorde, tillplattades färgtonvärdenas spännvidd, vilket gjorde det lättare att ta upp mer av embryots mörka svans. Endast de positiva färgtonvärdena användes eftersom det mesta av bakgrunden slutar med negativa värden eller nollvärden för färgton.

Ibland var enbart de positiva färgtonvärdena tillräckliga. En binär bild skapades genom att en gräns för kotangentvärdena sattes vid 100. Värden över 100 sattes till 1. En erosion följt av två dilatationer eliminerade de falska pixlarna fràn bakgrunden. Den största intilliggande gruppen av ettor behölls som embryot. Erosioner och dilatationer gjordes inte så många gånger som i den föregående metoden för att behålla lillrot- eller svansdelen av embryobilden förbunden med den huvudsakliga embryokroppen. Hålifyllning gjordes före erosionen och dilatationerna för att behålla rotpartiet av embryobilden.

Den longitudinella sidovyn av embryot (kameravinkeln roterades 90° relativt toppvyn) förbehandlades genom att en matris av maximala färgvärden skapades. De maximala färgvärdena i en pixel var de största av de röda, gröna och blå färgvärdena. De maximala färgvärdena användes för att säkerställa maximalt bevarande av embryolillrot- bilden. Embryot hade ett horisontellt läge i denna bild.

Därför beräknades radmedelvärdet för de maximala färg- värdena. Det lägsta medelvärdet mellan raderna 200 och 260 motsvarade gapet mellan embryot och kanten på den ställning på vilken det sitter. Allting under den rad som motsvarade gapet sattes till noll. För resten av bilden 10 15 20 25 30 35 o o ooo o o oo o oo o oo oo o o o oo o o o o o oo o o oo o oo oo -o o oo o v 1 1 I o 0 o o I H I o o o o oo -. , o o o oo o o o o o o o o o v o o o o o o o o o o o o o oo ooo oo ooo oooo oo 22 sattes en gräns så att värden över tio sattes till ett. Återigen urholkades den binära bilden en gång och utvidgades två gånger för att ta bort falska pixlar. En klumpmärkningsrutin märkte de kvarvarande grupperna av pixlar med värden av ett och den största behölls som embryot. Om en andra klump av ettor hade åtminstone 25% av antalet pixlar i sig jämfört med den största klumpen antogs lillroten ha blivit separerad genom de morfolo- giska operationerna och inkluderades. Hålifyllning gjordes och sedan användes den binära bilden för att nollställa bakgrundsdelarna av den ursprungliga bilden och beskära den som i fallet för toppvyn.

Topp- eller ändvyn av embryot förbehandlades på ett av två sätt. Den första metoden var att man använde samma metod som beskrivits för sidovyn med tre ändringar. Efter att ställningsdelen av bilden nollställts sattes gränsen för de kvarvarande, maximala värdena vid 20 i stället för 10. Den resulterande binära bilden urholkades tre gånger och utvidgades fem gånger. Slutligen behölls ingen näst största klump. Den andra metoden var att man skapade en binär bild från produkten av två andra binära bilder. Den första binära bilden skapades av matrisen av maximala värden genom att man satte alla värden som var större än 20 till ett och annars till noll. Den andra binära bilden gjordes genom att man skapade en matris av färgtonvärden såsom för toppvyn och sedan satte de positiva värdena till ett och alla andra till noll. Produkten av dessa två binära bilder eliminerar nästan alla bakgrundsegenskaper.

Den resulterande binära bilden urholkades och utvidgades som i den första metoden. Slutligen användes den binära bilden för att nollställa bakgrunden och beskära den ursprungliga bilden såsom i toppvyn.

Orsaken till att bilderna beskars var att koncen- trera senare analytiska ansträngningar så mycket som möjligt på embryodelen av bilderna och att minska kraven på datorminne. De tre vyerna av ett embryo representerade tre korrelerade mätningar på en enda försöksenhet. Det .am- l0 15 20 25 30 35 522 252 23 krävdes hundratusentals siffror för att beskriva mät- ningarna. Embryot täcker endast omkring 5% av en bilds totala area, så det mesta av en bild var bakgrund. Att bära med sig bakgrundsinformation i onödan använder upp minne och kan hindra senare metoder, som används för att klassificera embryona.

Bildförminskning Eftersom datamängder för embryobilder ofta är stora, utfördes ytterligare bildstorleksförminskning för att få in all data i datorminne.

Embryoklassiceringsalgoritmerna, som användes för att sortera embryona, krävde också att alla bilderna av en särskild embryovy var av samma storlek. Storlekarna för den största toppvyn, sidovyn och ändvyn hittades efter att alla bilderna hade förbehandlats och beskurits såsom beskrivs i föregående stycke. Alla toppvyer fylldes ut med nollor till storleken av den största toppvyn med hjärtbladsembryohuvudet placerat så nära ett av bildens hörn som möjligt. Med andra ord adderades de extra nollorna till lillrotänden av bilden och till en av dess sidor. Nollutfyllningen för sido- och ändvyerna var liknande. Nollutfyllningsschemat gjordes i ett försök att få alla embryohuvudena på samma plats i bilderna, medan lillrotsvansdelen av embryot, vilken varierar kraftigt i storlek och form, lämnades att ta upp det bildutrymme som den behövde.

Med bilderna av varje embryovy återställda till deras minsta gemensamma storlek, krymptes sedan bilderna medelst wavelet-beräkningsmetoder_ Det första steget i att förminska bilderna var att pixelvis beräkna principalkomponenterna för de röda, gröna och blå färgmatriserna. Varje färgmatris drogs ut i en enda lång vektor genom att foga kolumnerna till varandra. Den första kolumnen var i toppen av vektorn och den sista kolumnen var i botten. De röda, gröna och blå vektorerna formades till en matris med tre kolumner och singulär- |»u|» lO l5 20 25 30 35 . n un. n u nu | av Q nu nu ~ ~ I I I a o ll I I Il k 10 I , s o u v I v 1 I I I I lv I inn en 1 | 1 a v - n n u u n v 0 u ; in 1 1 u c 0 1 4 u n » ;r nns ua un. o no av 24 värdesuppdelningen av denna matris beräknades. De kvar- varande egenvektorerna från uppdelningen var principal- komponenter med enhetslängd. Den första egenvektorn motsvarade den principalkomponent som tog hänsyn till den största variationen i färgvärdena. I medeltal tog den första principalkomponenten (PC) hänsyn till 95% av variationen. Nämnda första PC representerar det optimala, viktade medelvärdet för de röda, gröna och blå värdena för att förklara variation och är lik ett beräknat gråskalevärde. Den första egenvektorn omformades sedan till en matris och användes i stället för färggruppen.

Detta steg förminskade kraven på datorminne med l/3 genom att tre matriser ersattes med en enda matris vars värden var lika en gràskalebild. Den enda matrisen bär all ursprunglig, geometrisk information. Det andra steget var att göra en tvådimensionell wavelet-uppdelning i två nivåer på den första PC-bilden för att förminska dess storlek. Approximationskoefficienten från den andra nivån av wavelet-uppdelningen används som den förminskade bilden. Den förminskade bilden bibehåller åtminstone 75% av föränderligheten i den ursprungliga PC-bilden.

Metrik Minskning av bilddata medelst de tidigare nämnda metoderna innebär att en del av informationen i den ursprungliga färgdatan förloras. I ett försök att behålla en del av denna information beräknades flera statistiker under det att dataminskningsprocessen utfördes. Först beräknades medelstandardavvikelsen, asymmetrikoeffi- cienten och tillplattningskoefficienten för varje färg såväl som färgton, färgmättning och ljusstyrka. Därefter sammanfattades koefficienterna hos wavelet-uppdelningen i varje skala med deras första fem obearbetade moment kring noll. I en uppdelning i två nivåer finns det sex matriser för detaljkoefficienter och en för utfiämningskoeffi- cienter. Detaljkoefficienterna innehåller information om struktur. De första fem obehandlade momenten kring noll ananas 10 15 20 25 30 35 522 852 25 uppskattades för var och en av dessa matriser såväl som för utjämningskoefficienterna. De fem momenten kring noll var medelvärdet, medelkvadratvärdet, medelkubikvärdet, medelvärdet av fjärde graden och medelvärdet av femte graden. För att erhålla centrala moment såsom variansen, asymmetri, etc subtraherar man först medelvärdet från de individuella värdena. Centrala moment var emellertid mer likartade för klassificeringsgrupper än för obehandlade moment. En tredje uppsättning av statistiker beräknades från embryots omkrets och dess wavelet-uppdelning och är avsedda att kvantifiera forminformation.

Embryots omkrets följdes i en riktning medurs och rad- och kolumnkoordinaterna för kantpixlarna erhölls.

Pixelkoordinaterna interpolerades för att skapa rad- och kolumnvektorer med 1024 element i varje. Eftersom många av embryoomkretsarna var konkava kurvor, kunde inte likvinklig interpolation användas. Linjär interpolation användes i stället för att skapa 1024 jämnt fördelade koordinater. Koordinaterna medelvärdescentrerades och sedan beräknades radier utifrån dem. När de plottades i följd bildade radierna en ojämn sinuskurva. När de plottades i polära koordinater följde de embryot. En wavelet-uppdelning i tio nivåer utfördes på radierna och de första sju obehandlade momenten kring noll beräknades för varje nivå. En liknande metod har använts av L.M Bruce (Centroid Sensitivity of Wavelet-based Shape Features, Proceedings of SPIE, Wavelet Applications V, Harold H. Szu Editor, 3391: 358-366 (1998)) för att klassificera brösttumörer som cancerogena eller godartade.

Utöver momenten för wavelet-koefficienterna från radierna beräknades den area som omslöts av omkretsen och omkretsens längd från de ursprungliga koordinatorerna.

Arean och längden av det konvexa höljet av perimetern beräknades också. Till sist beräknades kvoten mellan omkretsarean och det konvexa höljets area och kvoten mellan omkretslängden och det konvexa höljets längd. Om i|np 11: oo 10 15 20 25 30 35 522 852 n . » o » P n- o v 26 embryoomkretsen var en konvex kurva kommer de två sista kvoterna att bli ett. I annat fall kommer areakvoten att minska mot noll och omkretskvoten att öka.

Totalt beskrevs 142 metriker för embryobilderna ovan. Dessa metriker var avsedda att fånga en del av den information om färg, form och struktur, som går förlorad när bilderna av de somatiska embryona minskades i storlek. En del av informationen, såsom omkretsforms- informationen, fanns fortfarande i de förminskade bilderna. Genom att addera metrikerna framhäver klassi- ficeringsmodellen metrikinformationen. I en del analyser (se exempel 4, tabell 2 och 3) tas logaritmen av metriken för att minska föränderligheten.

Embryoklassificeringsmodeller Princigalkomponentanalys1SIMCA Den huvudsakliga klassificeringsmetoden som användes i exemplen av föreliggande uppfinning var svag, oberoende SIMCA se Jolliffe, Component Analysis, Springer-Verlag sid 161 (soft independent I.T., (1986). modellering av klassanalogi, Principal SIMCA modeling of class analogy), användes på varje uppsättning av förminskade bilder och metriker. Detta resulterade i sex mellanklassificeringar av varje embryo. Dessa sex mellanklassificeringar kombi- nerades medelst Bayes' optimala klassificerare, se Mitchell, Tom M. Machine Learning, WCB/McGraw-Hill, sid 174-176, 197, 222 (1997). en separat uppsättning av principalkomponenter för varje SIMCA arbetar genom att beräkna kategori baserat på upplärningsdata. De principal- komponenter som tar hänsyn till den största delen av variationen behålls. Sedan beräknas regressionen för data från ett nytt prov på principalkomponenterna från varje grupp. Den kvarvarande medelkvadratavvikelsen beräknas för varje kategori. Kategorin med den minsta kvarvarande medelkvadratavvikelsen är den kategori till vilken det nya provet hänförs. Sex SIMCA görs för varje embryo. 10 l5 20 25 30 35 522 852 ~ o » , .v u 27 Kombinerinq av mellanklassificerinqarna medelst Baves' optimala klassificerare Tvà till ungefär sex mellanklassificeringar kan kombineras till en enda klassificeringsregel genom att man först konverterar de resulterande strängarna av nollor och ettor till en binär kod. För tvà mellan- klassificeringar finns det fyra binära kombinationer, för tre mellanklassificeringar finns det àtta binära kombi- nationer osv. För "k" mellanklassificeringar finns det 2k binära kombinationer. Varje binär kombination tilldelas en etikett eller kod. Sannolikheten att varje kod observeras uppskattas för varje embryokvalitetsklass.

Sedan delas sannolikheterna för de av binär kod beskrivna embryokvalitetsklasserna med sannolikheten för att motsvarande kod skall förekomma i all data från båda embryokvalitetsklasserna. De resulterande sannolikheterna är villkorssannolikheten för en embryokvalitetsklass given en kod. Ett embryos binära kod beräknas och embryot hänförs till den embryokvalitetsklass för vilken vill- korssannolikheten är störst för den observerade binära koden. Oavgjorda resultat kan hänföras slumpmässigt eller hänföras till en av embryokvalitetsklasserna baserat pà andra hänsynstaganden, såsom ekonomi.

Användning av Lorenz-kurvan för klassificering av embryon Lorenz-kurvan utvecklades ursprungligen för att jämföra inkomstfördelningen bland olika människogrupper.

En Lorenz-kurva skapas genom att inkomstbràkdelen ritades mot den bråkdel av befolkningen som äger denna inkomst- bràkdel. I föreliggande uppfinning ses Lorenz-kurvan som en jämförelse av tvà parvisa, kumulativa fördelnings- funktioner, där bràkdelsvärdena för en kumulativ för- delningsfunktion ritas mot bräkdelsvärdena för en andra kumulativ fördelningsfunktion. Om de två fördelningarna är desamma kommer Lorenz-kurvan att rita den räta linjen y=x. Punkten längst bort fràn linjen y=x motsvarar balanspunkten mellan att ackumulera mer av den ena för- >|»»n lO 15 20 25 30 35 522 852 28 delningen än av den andra. Balans- eller extrempunkten är en objektiv punkt att separera de två fördelningarna vid.

Klassificeringsmetoden med Lorenz-kurvan enligt föreliggande uppfinning har fyra steg. Först beräknas Lorenz-kurvor för varje metrik i en uppsättning av metriker. Punkterna på dessa Lorenz-kurvor som är längst bort från linjen, y=x, erhålls. Som andra steg används metrikvärdena, som motsvarar extrempunkterna hos Lorenz- kurvorna, som gränsvärden för att göra enkelmetrikklassi- ficeringar på embryona: värden av en metrik mindre än metrikens gräns hänförs till en embryokvalitetsklass och värden större än gränsen hänförs till den andra embryo- kvalitetsklassen. Som ett tredje steg delas metrikupp- sättningen upp i flera uppsättningar för att minska antalet kombinationer som måste sökas igenom i det sista steget. Som ett fjärde steg kombineras par, tripplar, fyrdubblar, etc av enkelmetrikklassificeringarna till binära koder och används i Bayes optimala klassificerare för att skapa klassificeringsmodeller för att hänföra embryon till en av två kvalitetsklasser. Klassifice- ringsmodeller görs för alla möjliga par, tripplar, fyrdubblar, etc och den bästa modellen behålls i varje fall.

Beräkning av Lorenz-kurvan för en enkelmetrik Metrikvärdena för de två embryokvalitetsklassificeringarna kombineras och alla de tydliga metrikvärdena identifieras. Alternativt hittas minimi- och maximivärdena för alla metrikvärdena för de båda embryokvalitetsklassificeringarna kombinerat och ett användarspecificerat antal av jämnt fördelade steg mellan minimat och maximat används. När det finns för många tydliga värden är detta andra alternativ användbart. För varje tydligt metrikvärde registreras i båda fallen den bråkdel av metrikvärden som är mindre än eller lika med det tydliga värdet för varje embryokvalitetsklass.

Således erhålls två parvisa, kumulativa fördelnings- - n n ø ø a. 10 15 20 25 30 35 . » - | .o 522 852 zu f; -'j=;::_ 29 kurvor. Att rita dessa tvâ uppsättningar av bràkdelar mot varandra utgör Lorenz-kurvan. Om de tvà fördelningarna är likadana är Lorenz-kurvan linjen y=x.

Att hitta extrempunkterna på Lorenz-kurvan för en punkt, (xo, yo), är absolutvärdet av differensen mellan yo och xo delat Avståndet fràn linjen, y=x, med kvadratroten av tvà: [yo - xo|/V2. Absolutvärdet för differensen mellan de kumulativa fördelningsfunktionerna för de tvà embryokvalitetsklasserna för en metrik letas igenom för att hitta dess högsta punkt. Det motsvarande metrikvärdet används som gräns. Denna extrempunkt är balanspunkten mellan att den ena fördelningen ackumulerar mer sannolikhet än den andra fördelningen. Extrempunkten användes som gräns i metrikklassificeringsmodellerna, som utvecklats i exempel 4. Andra punkter på Lorenz-kurvan kan användas som gränser, baserat pà andra hänsyns- taganden, såsom behandlingskostnader. Om en annan punkt än extrempunkten används som gräns kan Lorenz-kurvan användas för att bestämma kompromissen i frekvensen av felaktiga klassificeringar.

Enkelmetrikklassificeringar Metrikvärden som är mindre än gränsen hänförs till en av embryokvalitetsklasserna och värden som är större än gränsen hänförs till den andra kvalitetsklassen. Dessa enkelmetrikklassificeringar resulterar i ett embryo- metrikvärde, som tilldelas en nolla eller en etta. Detta görs för varje använd metrik. En embryokvalitetsklass sätts till ett och den andra sätts till noll. Flera enkelmetrikklassificeringar kan sedan kombineras för att ge en slutlig klassificering, som har en lägre frekvens av felaktiga klassificeringar än någon av de individuella enkelmetrikklassificeringarna. . o I unna on 522 852 30 Kombinering av Lorenz-kurvans enkelmetrikklassificerinqar medelst Bayes' optimala klassificerare Två eller flera enkelmetrikklassificeringsmodeller kan kombineras till en enda klassificeringsregel med 5 användning av Bayes optimala klassificeringsmetod, den samma som tidigare beskrevs för att kombinera mellan- liggande SIMCA-klassificeringsmodeller. Alternativt kan enkelmetrikklassificeringsmodeller eller mellanliggande SIMCA-klassificeringsmodeller verka som indata till en 10 algoritm i neuralt nätverk för att uppnà en slutlig klassificeringsmodell för växtembryokvalitet. Såsom beskrivs nedan, uppstär emellertid speciella problem när enkelmetrikklassificeringsmodeller kombineras för att uppnå en slutlig klassificeringsregel. 15 Uppdelning av de metriker som skall kombineras till en enkelklassificeringsmodel1 Lorenz-kurvan kan användas för att hitta ett optimalt gränsvärde för en enkelmetrik. Med uttrycket 20 optimalt avses balansering av sannolikhetsackumulering_ Lorenz-kurvan kan emellertid inte hantera det fall när flera metriker beaktas tillsammans, eftersom Lorenz- kurvan endast kan jämföra två fördelningar i taget. En lösning är att mata metrikuppsättningar till ett arti- 25 ficiellt neuronnät för att hitta en optimal klassifi- ceringsregel. Med hundratals metriker skulle det emeller- tid vara nödvändigt att sätta in väldigt stora nät eller sätta in ett väldigt stort antal små nät. För ändamålet -;~§ med denna ansökning gäller att ju enklare klassifice- 30 ringsregel desto bättre. Det inses att de gränser som --: hittats för individuella metriker inte behöver vara de Ä- som är bäst att använda vid kombinering av flera metriker genom deras enkelmetrikklassificeringar. Trots detta är det möjligt att leta igenom stora antal kombinationer av 35 enkelmetrikklassificeringar genom att beräkna resultaten 1:: av tillvägagängssättet med Bayes' optimala klassifi- cerare, som skisserats ovan, och jämföra dem med avseende »anwa 10 15 20 25 30 35 I I iii I I II I I' Ü n u v v n . - o av I ' U . ~ . . - . v I u v : un nl . . » I ~ 0 ~ I I I OO I O I I 0 . o u . n v" 31 på olika kombinationer av enkelmetrikklassificeringarna.

Det finns ändå fortfarande begränsningar på antalet kombinationer som kan letas igenom. När 682 metriker är under beaktande finns det 8935 miljarder av enbart olika fyrmetrikskombinationer. Allteftersom datorer blir snabbare kommer ett sådant antal inte att utgöra ett stort problem. För begränsad datorhårdvara skulle emellertid uppdelning av metrikerna i hög grad minska arbetsmängden.

Två uppdelningskriterier framträder. För det första kan metriker vars enkelmetrikklassificeringar är över någon gräns behållas. För det andra är många av metri- kerna korrelerade med varandra. De metriker som i hög grad är korrelerade med bättre metriker kan utelämnas från beaktande, eftersom de informationsmässigt är tvillingar med de bättre metrikerna: en metrik, som är perfekt korrelerad med en annan, innehåller ingen information som inte redan finns i den andra metriken.

Metriker med mycket låga korrelationer mellan sig har större sannolikhet att skapa användbara binära koder.

Dessa uppdelningskriterier kan användas tillsammans för att minska antalet metriker.

Flera olika exempel på klassificeringstekniker demonstreras specifikt i exemplen 2-4.

Exempel 2 Sortering av somatiska embryon baserat på visuell embryokvalitet Somatiska embryon av Douglas-barrträd odlades till hjärtbladsstadiet enligt metoder framtagna av Gupta et al, US-A-5 036 007, och Gupta, US-A-5 563 061, vilka patent genom referens här införlivas i sin helhet.

Embryon togs bort individuellt från utvecklingsmediet.

Från denna punkt blev de normalt manuellt sorterade och utvalda för groning.

I det aktuella fallet förvaldes 200 embryon från samma klon av Douglas-barrträd (genotyp 5) genom 10 15 20 25 30 35 522 852 ¿¿,l: 32 morfologi medelst de vanliga zygotiska embryokriterierna av färg, axiell symmetri, avsaknad av uppenbara brister och hjärtbladsutveckling. Hälften av proven ansågs vara "bra" embryon, dvs embryon som uppfyllde visuella kriterier för vidare behandling i groningsmedium. Den andra halvan var "dåliga" embryon, som inte uppfyllde kriterierna. "Sanningskriteriet" för den följande analysen var förekomsten eller avsaknaden av normal zygotisk morfologi.

Efter att embryona blivit utvalda placerades de mot en mörk bakgrund och belystes med kallt, fiberoptiskt ljus. Varje embryo färgavbildades individuellt i snabb följd av tre kameror, som var monterade vinkelrätt mot varandra. Två longitudinella vyer med 90° vinkel mot varandra och en toppvy bakifrån av hjärtbladsregionen förvärvades. Bilder förvärvades som digitaliserad data lämpad för datoranalys. Före analysen förbehandlades bilderna för att isolera embryot och således eliminera störande bakgrundsdata.

I detta exempel användes en delmängd av topp- vybilderna av embryon för att beräkna principal- komponenterna. De första 80 komponenterna behölls, eftersom de tar hänsyn till omkring 98% av variationen i bilderna. Principalkomponenterna beräknades för de "bra" embryona, dvs de embryon som har bra, visuella kriterier, som förknippas med en hög groningshastighet, sàväl som för embryon, som saknar de bra visuella särdragen.

Principalkomponenterna beräknades medelst algoritmen för singulärvärdesuppdelning. Algoritmen för singulärvärdes- uppdelning är tillgänglig för vilken mjukvara som helst, som kan hantera matriser. De använda principalkompo- nenterna var de kvarvarande egenvektorerna fràn singulär- värdesuppdelningen, vilka var de principalkomponenter som normaliserats till att ha enhetslängd. Denna normali- seringsprocess har inte en motsatt effekt, eftersom principalkomponenterna användes i denna metod som en uppsättning ortogonala basvektorer i en multipel- u u n e o o ø u o II 522 852 o a u | o n u u u nu 33 regression. Regressionen beräknades sedan, exakt som i multipelregression, för de embryon som inte inkluderades i upplärningsdatauppsättningen pà de två uppsättningarna av principalkomponenter. För varje regression beräknades 5 den kvarvarande medelkvadratavvikelsen. Ett testembryo klassificerades att ha antingen bra eller dålig embryo- visuell kvalitet beroende pà vilken kategori som hade den minsta kvarvarande medelkvadratavvikelsen. Genom använd- ning av denna metod klassificerades testembryon baserat 10 pà den longitudinella toppvyn av ett embryo.

Precis som för de longitudinella toppvybilderna delades de longitudinella sidovy- och ändvybilderna upp i en upplärningsuppsättning och en testuppsättning av embryon. Upplärningsuppsättningen av embryon användes för 15 att beräkna principalkomponenterna, regressionen beräknades för testuppsättningen av embryon pà dem och testuppsättningen klassificerades. Metrikerna användes pá samma sätt för att beräkna principalkomponenter och klassificera embryona i testuppsättningen. I fallet med 20 nætrikerna behölls 40 principalkomponenter och de var baserade pà den naturliga logaritmen av absolutvärdet av metrikerna multiplicerat med tecknet för metriken eller Box-Cox-transformationen (Myers, R.H. och D.C.

Montgomery, Response Surface Methodology: Process and 25 Product Optimization Using Designed Experiments, Wiley, sid 260-264 (1995)) av metrikerna med användning av en udda rot, såsom 1/101, vilken approximerar den naturliga logaritmen, bevarar tecknet och fortfarande fungerar pà H". noll. Transformationen hjälper till att minska varia- ; 30 biliteten i momenten av högre ordning. Som ett resultat "YZ avlöper varje embryo i testuppsättningen med sex klassificeringar fràn var och en av nämnda SIMCA: tre klassificeringar fràn de tre bilderna och tre klassi- .2 ficeringar fràn de tre metrikuppsättningarna. 35 De sex klassificeringarna kombinerades enligt följande till en enda klassificering medelst Bayes optimala klassificerare, se Mitchell, T.M. Machine 10 15 20 25 30 35 522 852 n u o = e | ø nu 34 Learning, WCB/McGraw-Hill, sid 174-176, 197, 222 (1997).

Varje klassificering var antingen noll eller ett: ett innebar att embryot hade en bra visuell kvalitet och noll innebar att embryot inte hade bra visuella karakteris- tika. De sex binära klassificeringsresultaten omvandlades till en flervärdeskod genom att multiplicera resultatet från sidovybilden med 32 och addera det till 16 gånger resultatet för ändvybilden plus åtta gånger resultatet för toppvybilden plus fyra gånger resultatet för sido- vymetriken plus två gånger resultatet för ändvymetriken plus resultatet för toppvymetriken. Detta sammansatta resultat antar heltalsvärden, som spänner från noll till 31. För varje sammansatt resultat räknades antalet embryon med bra visuell kvalitet såväl som antalet embryon med dålig visuell kvalitet. Dividering med det totala antalet embryon i testuppsättningen ger sanno- likheterna för att observera varje resultat och en av embryokategorierna. Sannolikheten för förekomsten av varje sammansatt resultat beräknades genom att räkna hur många gånger varje resultat förekom och dela med det totala antalet embryon i testuppsättningen. Sedan delades varje sannolikhet för att observera ett sammansatt resultat och en av kategorierna med sannolikheten för förekomsten av det sammansatta resultatet. Denna beräkning gav sannolikheten för en kategori given ett sammansatt resultat. Sammansatta resultat, där sanno- likheten för att observera ett visuellt korrekt embryo var större än eller lika med 50%, utpekades att ha en bra embryokvalitet. Alla andra resultat hänfördes till kategorin för dålig embryokvalitet. På detta sätt kombinerades informationen från de sex SIMCA-klassi- ficeringarna till en enda klassificering.

Bayes' optimala klassificerare hänför huvudsakligen ett sammansatt resultat till den kategori som åstadkommer mest av just det resultatet. Om ett embryo har ett värde, som är i mitten, placerades det i kategorin för god 10 15 20 25 522 852 ,u"..“ _... H" - ~- ï É F É š 'É _š ï “F ,' ,ïï-- :d LS .'É I' ' 35 embryokvalitet. Hela processen upprepades många gånger och medelprestandan rapporterades.

Med användning av de ovanstående metoderna klassi- ficerades två ytterligare uppsättningar av somatiska embryon av två olika genotyper (genotyp 6 och 7) efter huruvida de hade bra eller dåliga morfologiska kvaliteter jämfört med normala, zygotiska embryon. Resultaten för de tre uppsättningarna ges i tabell 1.

Tabell 1 Resultat för visuell kvalitetsklassi- ficering från Bayes' optimala klassificerare för tre genotyper av somatiska embryon från Douglas-barrtrâd Genotyp av Douglas- Procentandel korrekt Procentandel korrekt barrtrâd klassificerade embryon klassificerade embryon med "bra" visuell med "dålig" visuell embryokvalitet embryokvalitet 5 (tre vyer av 200 80,0 75,0 embryon) 6 (tre vyer av 1000 88,7 ö 70,5 embryon 7 (änd~ och toppvyer 87,0 78,5 av 1000 embryon) Exempel 3 Sortering av somatiska embryon baserat pà visuell embrvokvalitet och faktisk groninq Ett prov av 400 embryon, som bedömts att vara av hög morfologisk kvalitet, såsom definierats tidigare, från genotyp 5 av Douglas-barrtrâd utvärderades på två sätt.

Efter utvärdering groddes embryona för att bestämma huru- vida groningsframgång korrelerade med förutsedd framgång baserat på åtta ytterligare morfologiska särdrag. Bas- fallet var visuellt val baserat på morfologi. Den första proceduren var en icke parametrisk, statistisk behandling baserad på fyra observerade särdrag (symmetri, ytojämn- f o | o | o. 522 852 36 het, förekomst av sammanväxta hjärtblad och förekomst av mellanrum mellan hjärtblad) och fyra uppmätta embryo- dimensioner (hypokotyllängd, lillrotlängd, hjärtblads- längd och hjärtbladsantal), varvid mätningarna gjordes pà 5 digitala färgbilder, som förvärvats under sterila för- hållanden fràn en enda synvinkel, som var vinkelrät mot embryots längdaxel. Denna statistiska procedur är känd som binär, rekursiv klassificering och utfördes medelst mjukvara, som heter CART““(stàr för Classification and 10 Regression Tree) (Salford Systems, San Diego, CA).

Pàlitligheten hos denna klassificeringsmetod utvärderades och sannolikheter för framtida liknande datauppsättningar härleddes genom att godkänna klassificeringen pà ett specificerat antal, exempelvis 20, slumpmässiga del- 15 mängder av datauppsättningen. CARIWM-klassificering är binär och alla möjliga uppdelningar testades på alla variabler. Den andra utvärderingsmetoden var principal- komponentanalys av bilderna.

Resultat visade att principalkomponentanalys var 20 överlägsen den statistiska CART“Lproceduren och var en betydande förbättring över teknikerval. En gronings- frekvens av 66,3% påträffades för baspopulationerna (utvalda för god likhet med normala, zygotiska embryon).

Detta förbättrades till 75,0% för embryon, som klassi- 25 ficerats med CART“Lproceduren som mest sannolika att gro.

En groningsframgàng av 79,7% uppnàddes i embryon, som valts med principalkomponent-/SIMCA-analysmetoden.

Exempel 4 _ 30 Embryogroningsbaserad sortering av somatiska embryon: É': En jämförelse av klassificeringsmetoder Ian » n :av PR: Metoderna i exempel 1-3 användes för att utveckla klassificeringsmodeller och klassificera 1000 somatiska 35 embryon av genotyp 6 av Douglas-barrträd efter deras förmåga att gro. Tabell 2 innehåller resultaten av att presentera olika indata till Bayes' optimala klassi- 37 ficerare vid klassificering av gronings- mot icke- groningsförmàga hos embryon av genotyp 6 av Douglas- barrträd. När indata var data för somatiska bilder, som först förbehandlats medelst metoden i exempel 1, hade upplärningsuppsättningsmodellen för klassificering av embryon efter groning rätt 59% av gångerna i att korrekt klassificera embryon som embryon som skulle gro och omkring 64% noggrannhet i att klassificera embryon som inte skulle gro. Detta är en medelnoggrannhet av 6l,7%.

När metrikbildsdata togs upp och adderades till för- behandlad bilddata enligt metoderna i exempel l, ökade däremot noggrannheten i embryoklassificering av groende- och icke-groende embryon till omkring 71% (kolumn 4 i tabell 2). noggrannhet i att klassificera potentiella groämnen Således uppnàddes, såsom i exempel 2, en ökad medelst föreliggande uppfinning.

Tabell 2 embryon av genotyp 6 av Douglas-barrträd medelst olika Groningsklassificering av somatiska indata till Bayes' optimala klassificerare jämfört med groningsresultat för manuellt val baserat pà morfologi Kombinationer av SIMCA-resulat, Procentandel korrekt klassi- Procentandel av korrekt klassi- Medelframgáng i korrekt klassi- som använts i ficerade groende ficerade icke- ficering Bayes optimala embryon groende embryon klassificerare Endast bilder 59,3 64,1 61,7 Bilder + 67,6 74,6 71,1 metriker Bilder + 68,5 74,1 71,3 log(metrik) Manuellt val 71,7 66,2 68,9 baserat på morfologi 10 15 20 25 522 852 ÉÉ?fi;ï§f¿Üí 38 Tabell 3 presenterar groningsklassificerings- resultaten för genotyp 6 av Douglas-barrträd för de individuella SIMCA-körningarna fràn varje uppsättning av bilder och metriker för de somatiska embryona. Jämförelse av resultaten som presenteras i tabell 3 med de som visas i tabell 2 demonstrerar den statiska fördelen med att kombinera de individuella SIMCA-klassificeringarna medelst Bayes' optimala klassificerare för var och en av de tre olika vyerna av somatiska embryon. Nyttan med att addera metrikerna illustreras också.

Tabell 3 embryon av genotyp 6 av Douglas-barrträd: Resultat fràn Groningsklassificering av somatiska de individuella SIMCA-körningarna Använd data Procentandel av Procentandel korrekt korrekt klassificerade klassificerade icke- groende embryon groende embryon Toppvybilder 66 54 Toppvy, log(metrik) 46 63 Ãndvybilder 70 45 Åndvy, log(metrik) 52 52 Sidovybilder - 48 59 Sidovy, log(metrik) 52 53 Ytterligare klassificeringsmetoder Två ytterligare klassificeringsmetoder utfördes med data, som samlats från somatiska embryon: artificiella neuronnät (genotyp 6 av Douglas-barrträd) och en klassi- ficeringsmetod baserad pà Lorenz-kurvan (genotyp 6 och 7 av Douglas-barrträd). Metoden, som är baserad pà SIMCA, använder hyperplan som gränser mellan kategorier. Ett tvàdimensionellt hyperplan är en linje och ett tredimen- sionellt hyperplan är ett vanligt plan eller flat yta. I korthet är hyperplan bara kusiner av högre dimension till linjer och vanliga plan. Som ett resultat är de bäst pà att separera kategorier som kan separeras linjärt, dvs de 10 15 20 25 30 35 | | a n nu 522 852 Yfiïmšïä 39 har raka gränser och kan separeras av en "linje". Naturen har ofta inte linjära gränser utan mycket krokiga gränser. Enkla artificiella neuronnät med bakàtfort- plantning, som använder icke linjära överförings- funktioner för de gömda noderna och utnoderna, kan hantera mycket icke-linjära gränser mellan kategorier, se Hagan, M.T., H.B. Demuth och M. Beale, Neural Network Design, PWS Publishing Company, kapitel ll och 12 (1996).

Dessa har använts för att skilja mellan bilder pà människor, som tittar i olika riktningar, Id. sid 112- 115.

Artificiella neuronnät Artificiella neuronnät med bakàtfortplantning användes för att klassificera embryon av genotyp 6 som groende eller icke-groende. Ãndvy- och toppvybilderna av somatiska embryon minskades i storlek med wavelets för att minska antalet innoder till nätet, vilket föreslogs av T.M. Mitchell (Machine Learning, WCB/McGraw-Hill, sid 112-115 (1997)). värden för att minska sina bilder. Här användes utjäm- Mitchell använde intilliggande medel- ningskoefficienterna fràn den tredje nivän av den tvàdimensionella wavelet-uppdelningen, eftersom de bevarar mycket mer detaljer än medelvärden. Embryosidovyn inkluderades inte för att minska mängden av beräkningar och eftersom denna vy bär med sig minst information om groning av de tre vyerna, såsom visas i tabell 3. Nätets inlager matade endast in pixelvärdena fràn de minskade bilderna från båda vyerna. Det gömda lagret hade antingen 18 eller 80 gömda noder, som använde den logistiska överföringsfunktionen, 1/(l+exp(-x)). Utlagret hade två noder, som återigen använde logistiska funktioner.

Utmàlvärdena var (0,9; 0,1) embryon och (0,l; 0,9) för groende, somatiska för icke groende embryon. Summan av de kvadrerade skillnaderna mellan màlvektorerna och deras förutsedda vektorer minimerades. Hälften av data- mängden användes för upplärning och hälften användes för v vv- 10 15 20 25 30 522 852 I v o o v v. 40 validering. Vilken upplärningsuppsättning som helst och till och med alla embryona kunde bli perfekt klassi- ficerade med modellen med l8 gömda noder. Det bästa någon av modellerna med artificiellt neuronnät kunde göra pà en validerings- eller testuppsättning var 61% korrekt klassificering av embryon i både groende och icke-groende klasser.

Användning av klassificeringsmetoden med Lorenz-kurvan för att klassificera embryon Såsom tidigare påpekats har klassificeringsmetoden med Lorenz-kurvan fyra steg. I detta exempel beräknades 625 respektive 457 olika metriker för genotyp 6 och 7 av Douglas-barrträd. Metrikvärden, som motsvarade extrem- punkterna pà Lorenz-kurvorna för varje metrik, sattes som gränsvärden för att klassificera embryokvalitet. Uppsätt- ningen av enkelmetrikklassificeringar, som genomsöktes med avseende pà robusta kombineringsklassificerings- modeller, minskades dessutom medelst uppdelningsrutinen, som beskrivits i exempel 1. Slutligen kombinerades dubbla, trippla, fyrdubbla, etc kombinationer av enkel- metrikklassificeringsmodellerna till binära koder och användes i Bayes' optimala klassificerare för att skapa klassificeringsregler för att hänföra embryon till en av de tvà embryokvalitetsklasserna. Klassificeringsmodeller gjordes för alla möjliga par, tripplar och fyrdubblar och' den bästa modellen behölls i varje fall.

Tabell 4 innehåller resultaten av klassificering av embryon enligt deras morfologiska likhet med normala zygotiska embryon genom användning av klassificerings- metoden med Lorenz-kurvan, som kombinerar en, tvâ, tre och fyra enkelmetrikklassificeringar via Bayes' optimala klassificerare. -fw ~.

Tabell 4 bästa av Bayes' optimala klassificerare, 522 852 41 Morfologiklassificeringsresultat från den som kombinerar en, tvà, tre och fyra enkelmetrikklassificeringar med Lorenz-kurva för genotyp 6 och 7 av Douglas-barrträd. a-anno 1 » -.--.

Genotyp av Antal metriker, som Procentandel Procentandel Douglas- använts för att skapa korrekt korrekt klas- barrträd klassificeringsmodell klassificerade sificerade embryon med embryon med bra morfologi dålig morfo- logi 6 1 82,30 70,44 (änd-, sido- (Asymmetrikoefficient, och Bl, för alla intensitet- toppvyer) pixelvärden från embryo- ändvyn) 6 2 72,63 83,27 (änd-, sido- (Asymmetrikoefficient, och ßl, för alla toppvyer) intensitetpixelvärden från embryo-ändvyn och spännvidd av omkretsradierna från embryoändvyn) 6 3 79,69 78,96 (änd-, sido- (Asymmetrikoefficient, och Bl, för alla z toppvyer) intensitetpixelvärden_ _, från embryo-ändvyn, 'å spännvidd av : : omkretsradierna från 3,: ändvyn och standardav- u_5 vikelse av hjärtbladens å' area från embryoändvyn) »ps |»: 1,: 522 852 42 6 4 84,72 75,75 (änd-, sido- (Asymmetrikoefficient, och ßl, för alla toppvyer) intensitetpixelvärden från embryo-ändvyn, spännvidd av omkretsradierna från ändvyn, standardav- vikelse av hjärtbladens area från embryoändvyn och medelarea av de hjärtblad som rör det gränsande konvexa höljet från embryoändvyn) 7 1 88,59 71,61 (endast änd- (Nedre kvartil av och omkretsradierna från toppvyer) embryotoppvyn) 7 2 71,33 89,74 (endast änd- (Nedre kvartil av och omkretsradierna från toppvyer) embryotoppvyn och asymmetrikoefficient, Bl, för de blå pixel- värdena från embryo- ändvyn) 7 3 85,71 84,97 (endast änd- och toppvyer) (Asymmetrikoefficient, Bl, för alla de blå pixelvärdena från ändvyn, standardav- vikelse för alla de gröna pixelvärdena från ändvyn och fjärde momentet kring noll av detaljkoefficienterna 10 15 522 852 43 för den åttonde nivån i en wavelet-uppdelning i tio nivåer av omkretsen från embryoändyn) 7 (endast änd- och toppvyer) 4 (Asymmetrikoefficient, ßl, för alla de blå pixelvärdena från ändvyn, standardav- vikelse för alla de gröna pixelvärdena från ändvyn, fjärde momentet kring noll av detalj- koefficienterna för den åttonde nivån av wavelet-uppdelningen av ändvyomkretsen och nedre kvartil av omkrets- radierna från embryo- toppvyn) 85,10 87,05 Jämförelse av resultaten i tabell 4 med de motsvarande resultaten i tabell 1 fràn kombinering av sex SIMCA- mellanklassificeringar med Bayes' optimala klassificerare antyder att metoden, fungerar lika bra som eller bättre än den SIMCA-baserade som är baserad pà Lorenz-kurvan, metoden för klassificering av embryon efter morfologi. Pá liknande sätt innehåller tabell 5 resultaten fràn klassi- ficering av embryon efter groningsklasser enligt metoden med Lorenz-kurvan. Jämförelse av tabell 5 med tabell 2 visar att metoden med Lorenz-kurvan inte fungerar lika Tabell 4 och tabell 5 visar också att kombinering av informationen i multipla bra som den SIMCA-baserade metoden. metriker minskar frekvensen av felklassificering. k. 522 852 44 Tabell 5 Groningsklassificeringsresultatat från den bästa av Bayes' optimala klassificerare, som kombinerar en, tvà, tre och fyra enkelmetrikklassificeringar med Lorenz-kurvan för genotyp 6 av Douglas-barrträd.

Genotyp av Antal metriker, som Procentandel Procentandel Douglas- användes för att skapa korrekt klass- korrekt klassi- barrträd klassificeringsmodell ficerade ficerade icke- med groende embryon groende embryon användning av (änd-, sido- och toppvyer) 6 1 70,51 60,12 (Asymmetrikoefficient, Bl, för alla de blå pixelvärdena fràn embryoändvyn) 6 2 66,51 65,45 (Asymmetrikoefficient, Bl, för alla de blå pixelvärdena från embryoändvyn och tionde niváns detalj- koefficient fràn en wavelet-uppdelning i tio nivåer av omkret- sen från embryosidovyn) 522 852 45 3 (Asymmetrikoefficient, ßl, för alla de blå pixelvärdena från embryoändvyn, till- plattningskoefficient, ßz, för omkretsradierna från embryotoppvyn och medelvärde av detalj- koefficienterna i nivå 9 från en wave1et~ uppdelning i tio nivåer av omkretsen från embryosidovyn) 71,56 62,40 4 (Asymmetrikoefficient, ßl, för alla de blå pixelvärdena från embryoändvyn, till- plattningskoefficient, ßz, för omkrets- radierna från embryo- toppvyn, medelvärde av detaljkoefficienterna i nivå 9 från en wavelet-uppdelning i tio nivåer av om- kretsen från embryosido-vyn och tillplatt- ningskoefficient, ßz, för alla de gröna pixelvärdena från embryosidovyn) 65,33 70,70 10 15 20 25 30 522 852 annan' n n- oooovu n n u o,_. on-o ~ . u n no.- 46 Klassificeringsträd baserade på Lorenz-kurvan I en alternativ metod för klassificering av embryon används Lorenz-kurvan som metod för uppdelning av noder i klassificeringsträd. För att konstruera ett klassifice- ringsträd söks metrikerna vanligtvis igenom för att hitta en variabel, som separerar kvalitetsklasserna mest baserat på ett mått av avstånd eller spridning. Fler- variabelsstatistik kan också användas för att undersöka uppsättningar av metriker, men beräkningarna som krävs ökar emellertid snabbt med antalet metriker i en upp- sättning. Metoden med Lorenz-kurvan, som skisseras ovan, kan också användas som ett noduppdelningskriterium.

Metoden med Lorenz-kurvan, som skisseras ovan, användes för att söka efter en enda bästa metrik för att dela upp embryokvalitetsklasserna. De två delmängderna, som således skapades, utsattes var och en för Lorenz-metoden för att hitta en metrik, som bäst delade upp dem. Denna process kan upprepas så länge som antalet metrikvärden från varje embryokvalitetsklass är tillräckligt stort för att tillhandahålla en god uppskattning av fördelnings- funktionerna. Hela metrikuppsättningen söks igenom varje gång, eftersom åtgärden att dela fördelningarna förändrar fördelningarna och metriker, som till att börja med tillhandahöll dålig uppdelning, kan tillhandahålla god uppdelning vid senare skeden. Denna metod med att man skapar ett klassificeringsträd är mycket beräknings- intensiv. Som ett resultat kan metrikerna delas upp i delmängder för att få beräkningarna gjorda pà en kortare tid. Ett klassificeringsträd i två nivåer baserat på Lorenz-kurvan skapades för Douglas-barrträd av genotyp 7.

Resultaten finns i tabell 6. 10 Tabell 6 522 852 47 Morfologiklassificeringsresultat fràn ett klassificerings- och regressionstràd i tvà nivåer med användning av Lorenz-kurvor för att dela upp noder för Douglas-barrträd av genotyp 7.

Douglas- barrträd av Antal metriker, som användes för Procentandel korrekt klas- Procentandel korrekt klas- genotyp 7 med att skapa klassi- sificerade sificerade användning av ficeringsmodell embryon med embryon med (enbart änd- bra morfologi dålig mor- och toppvyer) fologi 2 81,22 82,25 (Standardavvikelse för alla de röda pixelvärdena från embryoändvyn och andra momentent kring noll av alla pixelvärdena i den första principal- komponentbilden (den vy som skapats genom att komprimera de röda, gröna och blå färgmatriserna till en enda matris medelst principalkomponent er) från ändvyn) De tekniker som beskrivs i exempel 1-4 kan med lätthet anpassas till kontinuerlig undersökning av somatiska embryon, vilket kan krävas i en anordning för storskalig produktion. Dessa metoder kan dessutom kombineras i serie med varandra eller med de spektro- skopimetoder som beskrivs i exempel 5 för att skapa en >w.a- acc 10 15 20 25 30 35 522 852 48 effektiv och lönsam sorteringsmetodologi för klassifi- cering av somatiska embryon med avseende pà deras groningspotential.

Exempel 5 Spektrofotometriska och flervariabla metoder för klassificering av somatiska embrvon Spektraldata insamlades och analyserades fràn zygotiska och somatiska embryopopulationer, som av erfarenhet är kända att skilja sig avsevärt i groningskraft.

Zygotiska embryon Färska zygotiska embryon insamlades vid två intervall med omkring tre veckors mellanrum fràn ett trädgàrdsodlat Douglas-barrträd (Pseudotsuga menziesii).

Graden av embryoutveckling motsvarade stadierna 7 och 8a i klassificeringen, som publicerades av Pullman et al (Pullman, G.S och D.T. Webb, An embryo staging system for comparison of zygotic and somatic embryo development, Proc. TAPPI [Technical Association of the Pulp and Paper Industry] Biological Sciences Symposium, Minneapolis, MN, 3-6 oktober 1994, sid 31-33. TAPPI Press, Atlanta, GA (1994)) för insamlingarna som gjordes den 23 juli respektive den 13 augusti. Dessa stadier kan beskrivas som “enbart hjärtbladsstadie" och "omoget hjärtbladss- tadie". Fullmogna zygotiska embryon erhölls dessutom fràn mogna frön, som erhållits fràn ett frölager, som insam- lats fràn en blandning av olika träd, vilka odlats i samma trädgård. Omogna zygotiska embryon fràn loblolly- tall (Pinus taeda) samlades in fràn ett träd den 10 augusti, vid vilket datum de var i stadie 7 i klassifi- ceringssystemet enligt Pullman et al som citerats ovan.

Mogna fröembryon av loblolly~tall erhölls från fryshus och de avtäckta fröna tilläts uppsuga vatten under 14 h före utvinning av embryona för analys. Kottar och frön :u.-> 10 15 20 25 30 35 522 852 49 lagrades vid 4-6°C efter insamling tills spektralanalys utfördes.

Somatiska embryon Somatiska embryon av Douglas-barrträd av fyra olika genotyper, benämnda 1, 2, 3 och 4, analyserades i denna studie. De somatiska embryona av Douglas-barrträd odlades enligt beskrivningen i exempel 2. Där en kylbehandling är nämnd, mottog de somatiska embryona av Douglas-barrträd kylbehandling vid 4-6°C under fyra veckor före spektral- analys. Tvà genotyper, benämnda genotyp 5 och 7, av somatiska embryon av loblolly-tall användes i studien.

Efter fullbordande av sin utveckling till hjärtblads- embryostadiet pá petriplattor, mottog hälften av de somatiska loblolly-tallembryona från varje genotyp en partiell torkbehandling under tio dagar vid omkring 97% relativ luftfuktighet, medan de fortfarande befann sig pà odlingsmediet, följt av kylbehandling vid 4-6°C under fyra veckor. Den andra hälften av de somatiska loblolly- embryona mottog inte denna behandling. De somatiska loblolly-embryona producerades med användning av standar- dmetoder för utstrykning av somatiska embryon pà plattor, vilka metroder beskrivs av Gupta et al, US-A-5 036 007, och Gupta, US-A-5 563 061.

För varje population utfördes spektralanalys pà omkring tio embryon, förutom för nägra somatiska embryon, där spektraldata insamlades fràn omkring 15-40 embryon.

Spektra togs vanligtvis fràn hjärtbladsregionen av ett embryo (fig l). Det skall emellertid förstås att metoden enligt uppfinningen kan utövas genom insamling av spektraldata fràn hela embryot eller fràn hypokotyl-(12) eller lillrot-(l4)delarna av embryot, som schematiskt visas i fig 1. I nâgra fall förbättrades klassificeringen genom att man använde bàde hjärtblads-(10) och lillrot- (l4)data i följd. ~ up. oo.- v ca' 10 15 20 25 30 35 522 852 50 Insamling av spektraldata Experimentuppställningen bestod av en ljuskälla, ett binokulärt mikroskop, en NIR-sensor och en bärbar NIR- processor med dator. En FieldSpec FR (350-2500 nm) spektrometer (Analytical Spetral Devices, Inc., Boulder CO) utrustad med en fiberoptisk prob, som uppsamlar ljus, som reflekterats från vilken som helst yta, användes för att samla in embryospektraldata. Spektrometerns fiber- optiska prob iordningsställdes med en 5° för-optik och infördes i hjälpobservations-(kamera)öppningen i ett binokulärt mikroskop.

Spektra togs upp i följd fràn grupper om tio soma- tiska embryon omedelbart efter handöverföring från en odlingsplatta och fràn zygotiska embryon ett-och-ett omedelbart efter bortskärning fràn avtäckta frön medelst apparaten och procedurerna som beskrivs nedan. Halogen- lampan ställdes i 40° vinkel fràn vertikalen pà ett avstånd av 17 cm från embryona. Prov placerades pà en vit teflonyta för att minimera bakgrundsabsorption, medan de betraktades med mikroskopobjektiven med 6,5 X-, 10 x- eller 40 x-förstoring. Ett program för "vit balans", som är en del av spektrometern, kördes periodiskt under hela mätningarna för att omkalibrera instrumentet mot den vita bakgrunden när inga embryon var närvarande.

Spektra mättes i regionen fràn synligt ljus till omrâdet för mycket nära IR (350-2500nm). Spektrala intensiteter mättes vid steg om lnm. Spektrometern var programmerad för att slutföra 30 spektralsvep av varje embryo för att erhålla ett representativt medelspektrum - en process, som tog totalt 30 s per embryo för olika hjärtblads- och lillrotprovtagningar, inklusive tiden för àterställning för nästa embryo.

Databehandling och informationsutvinning Analys av spektraldata utfördes medelst ett mjukvarupaket för principalkomponentanalys ("The Unscrambler" av Camo ASA, Oslo, Norge). Resultat- och un. vvn» u n. . nu 10 15 20 25 30 35 522 852 51 lastmatriserna omvandlades till de "poängresultatdiagram" och "lastspektra" som visas i figurerna. Algoritmen för principalkomponentanalys tog ut den bästa uppsättningen av axlar, som beskrev datauppsättningen. Poängresultat- diagrammen visar sambanden bland embryona och embryo- klasser, medan lastspektra visar vilka spektrala särdrag, som var ansvariga för klassuppdelningarna.

Principalkomponentanalys av spektra fràn zygotiska och somatiska embryon En jämförelse av zygotiska embryon av Douglas- barrträd i tre olika utvecklingsstadier och somatiska embryon av genotyp 1 utfördes. De tre zygotiska stadierna bestod av tvà omogna hjärtbladsstadier, som var identi- fierbara som stadierna 7 och 8 i Pullman et al (Pullman, G.S. och D.T. Webb, An embryo staging system for comparison of zygotic and somatic embryo development, Proc. TAPPI [Technical Association of the Pulp and Paper Industry] Biological Sciences Symposium, Minneapolis, MN, 3-6 oktober 1994, sid 31-33. TAPPI Press, Atlanta, GA (1994)) och som insamlades fràn fältet i Rochester, Washington den 23 juli respektive den 14 augusti, och mogna, torra frön från ett frölager. Tidigare data visade att medan 90-95% av embryona av mogna frön normalt skulle gro in vitro, skulle endast omkring 75% respektive 43% av embryona i stadie 8 och stadie 7 gro pà det sättet.

Graden av skott- och rotförlängning, som utgör mätt pà groningskraft, hade ännu större inverkan på utvecklings- stadiet och dessa frekvenser minskades till 80% och 20% för de tvà omogna stadierna. Groning minskade till omkring 15% respektive O för de tvà omogna stadierna efter torkning av embryona till 10% fukthalt. Detta visar den stora kontrasten i embryokvalitet mellan embryon av Douglas-barrträd i dessa stadier av utveckling, vilket är välkänd för fackmän inom växtembryoutveckling. Som en ytterligare kontrast, kännetecknades kvaliteten hos de somatiska embryona, som var närmast, men inte riktigt 10 l5 20 25 30 35 522 852 52 ekvivalenta med, det zygotiska utvecklingsstadiet 8, av betydligt lägre groningsnormaltillstànd och groningskraft än de zygotiska embryona i stadie 7. Den genotyp som testades var representativ för många genotyper av somatiska embryon.

Undersökning av resultatdiagrammet i fig 2A visar att dessa fyra populationer av kontrasterande embryo- kvalitet delar upp sig i fyra klart skilda grupper, när de ritas in med avseende pà de första tre principal- komponenterna. Embryogrupperna är: mogna, torra zygotiska embryon (svarta cirklar), zygotiska embryon som insamlats den 14 augusti (upp-och-ned-vända vita trianglar), zygotiska embryon som insamlats den 23 juli (svarta kvadrater) och somatiska embryon av genotyp 1 ("+"- symbol). Masscentrum för gruppen med somatiska embryon var flyttad 8-10 standardavvikelser àt höger längs PC1- axeln jämfört med alla stadierna för zygotiska embryon, vilka huvudsakligen separerades längs axlarna för PC2 och 3. Föränderligheten bland de somatiska embryona var mycket större än inom någon av grupperna med zygotiska embryon.

Lastspektret för PC1 (fig 2B, kurva 20) innehöll i huvudsak tvà toppar, vid 1450 och 1920 nm, som kan tillskrivas vatten och som indikerar att den stora uppdelningen och föränderligheten berodde pà en större mängd och föränderlighet hos vattnet i somatiska embryon.

Uppdelningen bland de zygotiska grupperna var däremot i huvudsak längs PC2 (kurva 22) och 3 (kurva 24), vars lastspektra antyder en bas i större lipidinnehàll (den dubbla toppen vid 1720-1750 nm och toppen vid 2300 nm) för mer mogna embryon. Det finns också negativa toppar kring 1400 och 1900 nm, som kan ha att göra med väte- bundet vatten. De somatiska embryona separerades också fràn de tvâ mer mogna zygotiska grupperna längs PC2- axeln, delvis beroende pà deras förmodade lägre lipid- koncentration, sàväl som absorptionsskillnader i det synliga området. Den procent av total, spektral variation o u c o uu 10 H.H 15 n u n ~ u. f - n. v . n . .. , ,, u : z: z. . . . H n » u . . 3 ' Ü Û Ü 0 I l b 'f - I I a . fl - . ,. - . - . , = u I n. 53 som tas hänsyn till av varje PC var 84% för PCl, 8% för PC2 och 4% för PC3. Tabell 7 summerar den separerations- kvalitet som erhölls bland de fyra embryogrupperna efter principalkomponentanalyser av spektraldatan. Summerings- datatabellerna för de olika somatiska embryoklassifi- ceringarna visar de kemiska särdrag som antyds vara förknippade med specifika våglängder baserat pà de kemiska klassernas kända spektrofotometriska beteende.

Tabell 7 tre utvecklingsstadier jämfört med ett annat och med Zygotiska embryon av Douglas-barrträd i somatiska embryon Omogna zygotiska Mogna Soma- Fordrade Våglängd/kemiska embryon frö- tiska principal- särdrag som embryon embryon komponenter antyds vara inblandade Embryon i Embryon stadie 7 i stadie 8 15/15* 14/14* 8/9* 9/10* Första Vatten (1450nm+1920nm) (1oo%) (1oo%) (89%) (90%) Andra Lipid (1700- 1750nm) Tredje Lipid+särdrag vid l890nm Lipid (2300nm)+särdrag vid l870nm * Antal korrekt klassificerade/antal testade Resultaten med somatiska och zygotiska embryon av loblolly-tall visas i fig 3A och tabell 8. I detta fall jämförs zygotiska embryon i stadie 8 (svarta kvadrater) och vattenindränkta, mogna, zygotiska embryon (svarta n n v | n ~ nu 10 15 20 522 852 n Q Q n va v v o ~ o u» 54 trianglar) med två genotyper av somatiska embryon (genotyp 5 betecknad som "+" och genotyp 7 betecknad som "o"), vilka förbehandlats med partiell torkning och sedan kyla. Somatiska embryon separerades fràn zygotiska embryon huvudsakligen med PCl, vilket, som i fallet med embryon av Douglas-barrträd, troligtvis berodde pà de somatiska embryonas högre vattenhalt relativt lipider (kurva 26). Många somatiska embryon av loblolly-tall separerades också fràn zygotiska embryon längs PC2, vilken uppvisade en dominerande, bred topp omkring 1800 nm av okänt ursprung (kurva 28). PC3 särskilde ytterligare gruppen av mogna, indränkta zygotiska embryon från gruppen av somatiska embryon baserat på en kombi- nation av särdrag, som inkluderar en (negativ) lipidtopp, pigmentering i det synliga området och en liten negativ topp omkring 1210 nm (vilket ungefär är det omràdet där den andra övertonen av C-H-utsträckningar i protein ligger), vilka visas i kurva 30. Dessa tre PC tog tillsammans hänsyn till 97% av variationen i spektrat (fig 3B). Procentandelen av total spektral variation som togs hänsyn till av varje PC var 92% för PC1 (kurva 26), 4% för PC2 (kurva 28) och 1% för PC3 (kurva 30). v-u vara a. n n. 10 15 20 Tabell 8 522 852 55 Zygotiska embryon av loblolly-tall i tvà utvecklingsstadier och somatiska embryon av loblolly-tall Omogna Mogna Somatiska Fordrade Vàglängd/kemiska (stadie 8) zygotiska embryon principal- särdrag som antyds zygotiska embryon komponenter vara inblandade embryon (okt) (10 aug) 10/10* 13/13* 28/29* Första Vatten (l450+l920nm) (100%) (100%) (97%) Andra Lipid (1700-1750nm) Tredje Bred topp vid 1800nm Lipid (negativ 2300nm) Protein (1210nm) Lipid (1700-l750nm) Pigment (400-500nm) * Antal korrekt klassificerade/antal testade Sammantaget visar dessa uppgifter att embryon kan separeras noggrant av deras NIR-spektrala karaktäristika i grupper med skiljande groningspotential.

Principalkomponentanalys av spektra från somatiska embrvon med hög- och låg-kvalitativt utseende Tio somatiska embryon i hjärtbladsstadie med hög- och làg-kvalitativt utseende utvaldes fràn en enda platta var för embryon av Douglas~barrtràd (genotyp 2) och loblolly-tall (genotyp 5) baserat pà traditionella morfologiska indikationer om embryokvalitet, dvs morfologier som har största sannolikhet att resultera i en hög eller làg frekvens av_groning.

En summering av den erhållna separationen presen- teras i tabell 9. För Douglas-barrträd var det möjligt att dra en rät linje pà resultatdiagrammet av PC3 mot PCl (fig 4A), vilken helt separerade grupperna med hög kvalitet ("+") och làg kvalitet (svarta cirklar). Mesta- 10 15 20 522 852 56 delen av denna uppdelning förkom längs den tredje PC (fig 4B, kurva 32), vilken representerade omkring 2% av den totala variationen. PC3 särskildes delvis av absorptions- band från pigment i det synliga omrâdet, PCl (kurva 34) fyll. totala spektrala variationen.

Tabell 9 inklusive kloro- representerade omkring 96% av den Somatiska embryon i hjärtbladsstadie med "hög"- mot "låg"-kvalitativ morfologi Hög- Låg- Fordrade Vàglängd/slutledda kemiska kvalitativ kvalitativ PC särdrag morfologi morfologi Douglas- 10/10* 9/9* 1 Vatten (1450, l920nm) barrtrâd (100%) (100%) 3 Spràngsärdrag för pigment i synligt område (1850- l920nm) LOblOlly- 9/10* 9/10* l Vatten (1450, l920nm) tall (90%) (90%) Okänt (1400-1500nm) Lipid (1710, zaoonm) Bundet vatten (1870nm) * Antal korrekt klassificerade/antal testade Fig 5A visar resultatdiagrammet, som erhållits frän somatiska embryon av loblolly-tall, kvalitativ morfologi làg-kvalitativ morfologi (n+||), jämfört med embryon, (svarta cirklar). som har hög- som har Nästan full- ständig (90%) uppdelning uppnàddes med de första och tredje PC kombinerade.

I lastspektret för PC3 (fig 5B, kurva 40) fanns det särdrag av en stark, svagt tvàtoppig, negativ topp kring 1450 nm (inte vatten), plus förmodad lipid (1700 och 2300 nm) och bundet vatten (1870 nm), såväl som absorptionstoppar i det synliga området (380- 600 nm). spektrala variationen. PC1 PC3 svarade för omkring 1% av den totala (kurva 36) representerade ||\»; lO 15 20 25 30 35 522 852 57 omkring 95% av den totala spektrala variationen och var mest vatten. En kombination av PCl och 2 tillhandahöll också god separation, varvid lastspektret för PC2 (kurva 39) dominerades av spràngsärdraget mellan 1760 och 1900 nm. PC2 svarade för omkring 3% av den totala spektrala variationen. Dessa resultat demonstrerar att principalkomponentanalys av spektraldata från somatiska embryon, som har hög- och làg-kvalitativt morfologiskt utseende tillhandahåller en bas för utveckling av en klassificeringsmodell, som kommer att tillåta att somatiska embryon snabbt kategoriseras med avseende pà groningspotential.

Principalkomponentanalys av spektra fràn somatiska embr on i h ärtblads- stadie 8 och "ku ol"- stadie 5 eller "enbart h ärtblads"- JC stadie 6 stadierna Somatiska embryon av Douglas-barrträd i tvá tydliga utvecklingsstadier valdes fràn plattor med genotyp 3.

Somatiska embryon i hjärtbladsstadiet är kända för att ha en mycket högre frekvens av groning än somatiska embryon, som föreligger i de mindre mogna "kupol"- eller "enbart hjärtblads"-(JC)utvecklingsstadierna.

Kupol-/JC-embryon (svarta cirklar i fig 6A) och hjärtblads-(stadie 8)embryon ("+"), samma platta, bildade tvà tydliga grupper på ett 3D- som plockades från resultatdiagram, som bildats fràn PC1-3, så att endast ett embryo av de 19 precis föll inom fel grupp (fig 6A).

De starkaste bidragsgivarna till uppdelning var PCl (kurva 42) och 2 (kurva 44), vilka var förknippade med (1) vatten respektive (2) lipid, möjligen protein N-H- regioner plus "språng"-särdraget vid 1800 nm (fig 6B).

PCl och 2 svarar för 82% respektive 9% av den totala spektrala variationen, medan PC3 (kurva 46) svarar för 4% av den totala spektrala variationen. Tabell 10 presen~ terar en summering av noggrannheten hos de spektrala uppdelningarna, som erhållits medelst somatiska embryon i 522 852 n u I o I c u ø n en 58 hjärtbladsstadiet och "kupol"- eller "enbart hjärtblads"- stadierna.

Tabell 10 Hjàrtbladsstadiet- mot tidigare utveck- 5 lingsstadier av somatiska embryon av Douglas-barrträd (genotyp 3).

Hjärtbladsstadie "Kupol"- Fordrade Vàglängd/slutledda eller "enbart PC kemiska särdrag hjärtblads"- stadie 10/10* 8/9* 1 Vatten (1oo%) (89%) 2 Lipid (1700-isoonm) Okänt (l420nm) * Antal korrekt klassificerade/antal testade 10 Dessa resultat demonstrerar att NIR-spektraldata felfritt kan skilja mellan tidiga utvecklingsstadier av somatiska embryon, vilka är groningsinkompetenta, och det slutliga stadiet av utveckling pà petriplattor (ungefär motsvarande zygotiska embryon i stadie 8), av vilka många 15 är kapabla att gro och producera fröplantor.

Principalkomponentanalys av spektra frán köldbehandlade somatiska embryon och från somatiska embryon för kontroll Att utsätta embryon för en köldbehandling vid 4-7°C 20 på låg-osmolalitetsmedium i mörker under 1-5 veckor, kan ü"f öka frekvensen av efterföljande embryogroning med 20 till § 200%.

»QQ Principalkomponentanalys av spektraldata, som insamlats från köldbehandlade, somatiska embryon och -Äg 25 somatiska embryon för kontroll, vilka embryon var av Å: Douglas-barrträd av tvà genotyper (3 och 4), presenteras kf i fig 7A och 7B. I fig 7A identifierar fyllda svarta :jj cirklar eller trianglar köldbehandlade embryon av genotyp 3 respektive 4 och de motsvarande öppna symbolerna 10 15 522 852 gig gi; - 59 identifierar icke-köldbehandlade embryon av desamma två genotyperna. För varje genotyp kan en rät linje dras, som i stor utsträckning skulle separera de tvà populationerna med den grad av framgång (fràn 79-100%) som visas i tabell axeln, 11. Uppdelningen bestämdes i huvudsak av PC2- vars lastspektrum (fig 7B, kurva 50) både har lipid- och pigmentkomponenter och svarar för omkring 4% av den totala spektrala variationen. PCI (kurva 48) svarar för omkring 91% av den spektrala variationen.

Tabell 11 som har eller inte har mottagit köldbehandling.

Somatiska embryon, Art och Kontroll Köld- Fordrade Specifik våglängd/ gentyp behandlad PC slutledda kemiska särdrag Douglas- barrträd 9/10* 10/10* 2 Lipider (1700-17sonm) Genotyp 3 (90%) (lO0%) Språngregion (l800-l900nm) 26/33* 9/10* 1 Genotyp 4 (79%) (90%) Vatten Loblolly- tall Genotyp 5 19/20* 10/10* 1 Vatten (95%) (100%) Genotyp 7 28/40* 17/20* 3 Lipid (1700-1750nm) (70%) (85%) 2 Språngregion (1800-1900nm) * Antal korrekt klassificerade/antal testade Resultaten av principalkomponentanalys för den ekvivalenta kontrasten medelst somatiska embryon av loblolly-tall framgår av fig 8A och 8B. Somatiska embryon ,..., 10 15 20 25 522 852 U=H===w--J u. u. ., , _ , ,; - g U . . . . 60 av loblolly-tall (genotyp 5) (cirklar) uppvisar en klar uppdelning av köldbehandlade grupper (fyllda cirklar) och kontrollgrupper (öppna cirklar) i fig 8A. Genotyp 7 av loblolly-tall (trianglar) uppvisar en liknande tendens med avseende på dessa tvà behandlingsgrupper. Generellt visar embryon, som partiellt torkades och sedan köld- behandlades, högre och större variation i vatteninnehàll än de som inte behandlades. Uppdelningarna för varje genotyp gjordes med en kombination av PCI och 2, vilka innehåller särdragen med vatten och lipid samt spräng- särdraget vid 1800-1900 nm, vilka noterades för Douglas- barrträd. PC1 (kurva 52) och PC2 (kurva 54) svarar för 92% respektive 4% av den totala spektrala variationen.

Dessa resultat demonstrerar att NIR-spektraldata kan särskilja mellan utvecklingsmässigt likadana (ungefär stadie 8) somatiska embryon, som har högre gronings- potential (med anledning av tidigare köld- eller köld- och partiell torkbehandling) fràn de embryon som har lägre groningspotential (som inte mottagit sådana behandlingar). Även om den föredragna utföringsformen av upp- finningen har illustrerats och beskrivits, torde det inses att olika ändringar kan göras däri utan att fràngà andemeningen med och omfattningen av föreliggande upp- finning.

Claims (40)

i-»nn 10 15 20 25 30 35 522 852 61 PATENTKRAV

1. Metod för klassificering av växtembryo- kvalitet, vilken metod innefattar: (a) att en klassificeringsmodell utvecklas genom (i) förvärvande av rå, digital bilddata av referensprov av hela växtembryon eller av embryoorgan fràn växtembryon av känd embryokvalitet; (ii) utförande av en dataanalys genom tillämp- ning av en eller flera klassificeringsalgoritmer pà nämnda förvärvade, råa, digitala bilddata, varvid àtmins- tone en av klassificeringsalgoritmerna använder mer än en gmbryoomkrets fràn nämnda förvärvade, ràa, digitala bild- data, varvid dataanalysen resulterar i utveckling av en klassificeringsmodell för klassificering av växtembryon efter embryokvalitet; (b) att rà, digital bilddata av ett växtembryo eller ett växtembryoorgan förvärvas fràn ett växtembryo av okänd embryokvalitet; och (c) att den utvecklade klassificeringsmodellen tillämpas pà nämnda ràa, digitala bilddata från steg (b) för att klassificera kvaliteten hos växtembryot av okänd embryokvalitet.

2. Metod enligt krav 1, varvid nämnda råa, digitala bilddata, som förvärvas i steg (a)(i), förbehandlas medelst en eller flera förbehandlingsalgoritmer före steg (a)(ii); varvid nämnda ràa, digitala bilddata, som för- värvas i steg (b), förbehandlas medelst en eller flera förbehandlingsalgoritmer; och varvid steg (c) utförs medelst nämnda förbehandlade, ràa, digitala bilddata.

3. Metod enligt krav 2, varvid förbehandlings- algoritmen avlägsnar rå bilddata, som inte härstammar från växtembryot eller växtembryoorganet.

4. Metod enligt krav 2, varvid förbehandlings- algoritmen minskar mängden rà bilddata och ändà bibehåller väsentligen all geometrisk information om embryot eller embryoorganet. 522 852 62

5. Metod enligt krav 2, varvid förbehandlings- algoritmen beräknar metriker.

6. Metod enligt krav 1, varvid nämnda räa, digitala bilddata förvärvas från mer än en vy av växtembryot eller 5 växtembryoorganet.

7. Metod enligt krav 1, varvid växtembryokvaliteten är morfologi.

8. Metod enligt krav 1, varvid växtembryokvaliteten är embryoomvandlingspotential. 10

9. Metod enligt krav 1, varvid växtembryot är ett somatiskt växtembryo.

10. Metod enligt krav 1, varvid växten är ett träd.

11. Metod enligt krav 10, varvid trädet är en medlem av ordningen Coniferales. 15

12. Metod enligt krav 10, varvid trädet är en medlem av familjen Pinaceae.

13. Metod enligt krav 10, varvid trädet är valt fràn den grupp som bestàr av släktena Pseudotsuga och Pinus.

14. Metod för klassificering av växtembryokvalitet, 20 vilken metod innefattar: (a) att en enkelmetrikklassificeringsmodell ut- vecklas genom (i) förvärvande av rà, digital bilddata av referensprov av hela växtembryon eller någon del därav 25 fràn växtembryon av känd embryokvalitet; (ii) beräkning av ett metrikvärde från nämnda förvärvade, ràa, digitala bilddata för varje embryo av känd embryokvalitet; 'int (iii) uppdelning av de metrikvärden som erhålls 30 i steg (a)(ii) i tvá uppsättningar av metrikvärden i enlighet med deras kända embryokvalitet; (iv) beräkning av en Qorenz-kurva från de tvà uppsättningarna av metrikvärden; yê M X (v) användning av någon punkt pà den Lorenz- 35 kurva som beräknas i steg (a)(iv) som ett gränsvärde för att uppnå en enkelmetrikklassificeringsmodell för klassi- ficering av växtembryon efter embryokvalitet; 10 15 20 25 30 35 522 852 n | o - n u o oo 63 (b) att rà, digital bilddata av ett helt växtembryo eller nàgon del därav förvärvas fràn ett växtembryo av okänd embryokvalitet; och (c) att den utvecklade enkelmetrikklassificerings- modellen tillämpas pà nämnda råa, digitala bilddata från steg (b) för att klassificera kvaliteten hos växtembryot av okänd embryokvalitet.

15. Metod enligt krav 14, varvid tvà eller flera enkelmetrikklassificeringsmodeller, som härletts fràn olika metriker, kombineras medelst en eller flera klassi- ficeringsalgoritmer för att utveckla en klassificerings- modell för klassificering av växtembryon efter embryo- kvalitet.

16. Metod enligt krav 14, varvid nämnda råa, digitala bilddata, som förvärvas i steg (a)(i), för- behandlas medelst en eller flera förbehandlingsalgoritmer före steg (a)(ii); varvid nämnda ràa, digitala bilddata, som förvärvas i steg (b), förbehandlas medelst en eller flera förbehandlingsalgoritmer; och varvid steg (c) utförs medelst nämnda förbehandlade, ràa, digitala bild- data.

17. Metod enligt krav 16, varvid förbehandlings- algoritmen avlägsnar rà bilddata, som inte härstammar från växtembryot eller växtembryoorganet.

18. Metod enligt krav 16, varvid förbehandlings- algoritmen minskar mängden av rà bilddata.

19. Metod enligt krav 14, varvid nämnda ràa, digitala bilddata förvärvas fràn mer än en vy av växtembryot eller växtembryoorganet.

20. Metod enligt krav 14, varvid växtembryokvali- teten är morfologi.

21. Metod enligt krav 14, varvid växtembryo- kvaliteten är embryoomvandlingspotential.

22. Metod enligt krav 14, varvid växtembryot är ett somatiskt växtembryo.

23. Metod enligt krav 14, varvid växten är ett träd. o.. 10 15 20 25 30 35 : ø | | a» n u 64

24. Metod enligt krav 23, varvid trädet är en medlem av ordningen Coniferales.

25. Metod enligt krav 23, varvid trädet är en medlem av familjen Pinaceae.

26. Metod enligt krav 23, varvid trädet är utvalt fràn den grupp som består av släktena Pseudotsuga och Pinus.

27. Metod för klassificering av växtembryokvalitet, vilken metod innefattar: (a) att en klassificeringsmodell utvecklas genom (i) förvärvande av rádata från absorptions-, transmittans- eller reflektansspektra för referensprover av växtembryon eller någon del därav fràn växtembryon av känd embryokvalitet; (ii) utförande av en dataanalys genom tillämp- ning av en eller flera klassificeringsalgoritmer pà nämnda spektrala rádata, varvid dataanalysen resulterar i utveckling av en klassificeringsmodell för klassificering av växtembryon efter embryokvalitet, (b) att rádata fràn absorptions-, transmittans- eller reflektansspektra för ett växtembryo eller någon del därav förvärvas fràn ett växtembryo av okänd embryo- kvalitet; och (c) att den utvecklade klassificeringsmodellen tillämpas pà nämnda spektrala rádata fràn steg (b) för att klassificera kvaliteten hos växtembryot av okänd embryokvalitet.

28. Metod enligt krav 27, varvid nämnda rádata från absorptions-, transmittans- eller reflektansspektra, som förvärvas i steg (a)(i), förbehandlas medelst en eller flera förbehandlingsalgoritmer före steg (a)(ii); varvid nämnda rádata från absorptions-, transmittans- eller reflektansspektra, som förvärvas i steg (b), förbehandlas medelst en eller flera förbehandlingsalgoritmer; och varvid steg (c) utförs med användning av nämnda för- behandlade rádata från absorptions-, transmittans- eller reflektansspektra. o n n Q n o u e c av - 10 15 20 25 30 v a so: n s nu n u. o nu va n ro uu n o u nu u ~ :I a co o n u v v n u u o n v u I nu | n o | .o o. . ß . ,. , . , ~ I n n: n u o I I w oo un: 65

29. Metod enligt krav 28, varvid förbehandlings- algoritmen förminskar brus och justerar för drift och diffus ljusspridning.

30. Metod enligt krav 28, varvid förbehandlings- algoritmen minskar mängden ràdata fràn absorptions-, transmittans- eller reflektansspektra och ändå bibehåller väsentligen all spektral information.

31. Metod enligt krav 28, varvid förbehandlings- algoritmen beräknar metriker.

32. Metod enligt krav 27, varvid nämnda ràdata från absorptions-, transmittans- eller reflektansspektra förvärvas från mer än en vy av växtembryot eller del därav.

33. Metod enligt krav 27, varvid nämnda ràdata från absorptions-, transmittans- eller reflektansspektra förvärvas fràn ett eller flera embryoomràden, som väljs ur gruppen som bestàr av hjärtblad, hypokotyl och lill- rot.

34. Metod enligt krav 27, varvid växtembryo- kvaliteten är morfologi.

35. Metod enligt krav 27, varvid växtembryo- kvaliteten är embryoomvandlingspotential.

36. Metod enligt krav 27, varvid växtembryot är ett somatiskt växtembryo.

37. Metod enligt krav 27, varvid växten är ett träd.

38. Metod enligt krav 37, varvid trädet är en medlem av ordningen Coniferales.

39. Metod enligt krav 37, varvid trädet är en medlem av familjen Pinaceae.

40. Metod enligt krav 37, varvid trädet är utvalt frán den grupp som bestär av släktena Pseudotsuga och Pinus.