SE513208C2

SE513208C2 - Isolated potato starch branching enzyme II

Info

Publication number: SE513208C2
Application number: SE9504272A
Authority: SE
Inventors: Bo Ek; Jamshid Khoshnoodi; Clas-Tomas Larsson; Haakan Larsson; Lars Rask
Original assignee: Lars Rask; Bo Ek; Jamshid Khoshnoodi; Larsson Clas Tomas; Haakan Larsson
Priority date: 1995-11-29
Filing date: 1995-11-29
Publication date: 2000-07-31
Also published as: SE9504272D0; SE9504272L

Abstract

Amino acid sequence of starch branching enzyme II (SBE II), comprises the 830 residue amino acid sequence. Also claimed are: (1) SBE II fragment, preferably the 464 residue amino acid sequence; (2) isolated DNA sequence encoding potato SBE II comprising the 3074 bp nucleic acid sequence, or a degenerate variant; (3) SBE II DNA sequence fragment, preferably the 1393 bp nucleic acid sequence; (4) vector comprising the whole or a functional active part of the isolated DNA sequences, and regulatory elements active in potato; (5) producing transgenic potatoes with an increased or a decreased degree of branching of amylopectin starch, comprising: (a) transfer and incorporation of the vector into the genome of a potato cell; and (b) regeneration of intact, whole plants from the transformed cells; and (6) transgenic potato obtainable by the process. (sequences given in the specification)

Description

15 20 25 30 35 513 208 2 av förgrening av amylopektin i transgena växter, t ex potatis. Branching of amylopectin in transgenic plants, eg potatoes.

I WO95/14827 beskrivs plasmider som har DNA-sekven- ser som efter insättning i genomet i växterna förorsakar förändringar av kolhydratkoncentrationen och kolhydrat- sammansättningen i regenererade växter. Dessa föränd- ringar kan erhållas från en sekvens av ett förgrenings- enzym som är beläget på dessa plasmider. Detta förgre- ningsenzym föreslås förändra amylos/amylopektinförhål- landet i stärkelse hos växter, särskilt i kommersiellt använda växter.WO95 / 14827 describes plasmids having DNA sequences which, after insertion into the genome of the plants, cause changes in the carbohydrate concentration and carbohydrate composition of regenerated plants. These changes can be obtained from a sequence of a branching enzyme located on these plasmids. This branching enzyme is proposed to alter the amylose / amylopectin ratio in starch in plants, especially in commercially used plants.

WO92/14827 beskriver det hittills enda kända stärk- elseförgreningsenzymet i potatis och inom tekniken är det inte känt om andra stärkelseförgreningsenzym är inbegrip- na i syntesen av förgrenad stärkelse i potatis.WO92 / 14827 describes the hitherto only known starch branching enzyme in potatoes and it is not known in the art whether other starch branching enzymes are involved in the synthesis of branched starch in potatoes.

I Mol Gen Genet (1991) 225:289-296, Visser et al, beskrivs inhibering av expression av genen för granul- bundet stärkelsesyntas i potatis med antisenskonstruktio- ner. Inhibering av enzymet i potatisknölstärkelse var upp till 100%, Emellertid har de tidigare kända metoderna för inhi- i vilket fall amylosfri stärkelse erhölls. bering av amylopektin inte varit framgångsrika och därför är alternativa metoder för inhibering av amylopektin fortfarande i hög grad önskvärda (Müller-Röber och Koßmann, 1994; 1995). Ändamålet med föreliggande uppfinning är att möjlig- Martin och Smith, göra förändring av graden av amylopektinförgrening och amylopektin/amylosförhàllandet i potatisstärkelse.Mol Gen The gene (1991) 225: 289-296, Visser et al., Describes inhibition of expression of the granule-bound starch synthase gene in potatoes with antisense constructs. Inhibition of the enzyme in potato tuber starch was up to 100%. However, the previously known methods for inhibition in which case amylose-free starch was obtained. amylopectin have not been successful and therefore alternative methods of inhibiting amylopectin are still highly desirable (Müller-Röber and Koßmann, 1994; 1995). The object of the present invention is to enable Martin and Smith to change the degree of amylopectin branching and the amylopectin / amylose ratio in potato starch.

Enligt föreliggande uppfinning uppnås detta ändamål genom att använda en DNA-sekvens som kodar för ett andra stärkelseförgreningsenzym, SBE II, vilket efter insättning i växternas genom förorsakar förändringar av nämnda förgreningsgrad och förhållande i regenererade växter.According to the present invention, this object is achieved by using a DNA sequence encoding a second starch branching enzyme, SBE II, which after insertion into the plants' genome causes changes in said degree of branching and ratio in regenerated plants.

Inom föreliggande uppfinnings omfång beskrivs också aminosyrasekvensen av SBE II och varianter av ovanstående 10 15 20 25 30 35 513 208 DNA-sekvens som är resultatet av den genetiska kodens degeneration.The scope of the present invention also describes the amino acid sequence of SBE II and variants of the above DNA sequence resulting from the degeneration of the genetic code.

Vidare beskrivs en vektor som omfattar nämnda DNA-sekvens och reglerelemept som är aktiva i potatis.Further described is a vector comprising said DNA sequence and regulatory elements that are active in potatoes.

Enligt uppfinningen àsïadkommes ett förfarande för framställning av transgena potatisar med en reducerad grad av förgrening av amylopektinstärkelse, omfattande följande steg: É a) överföring och införlivande av en vektor enligt uppfinningen i genomet i en potatiscell och b) regenerering av intakta, hela plantor från de transformerade cellerna.According to the invention there is provided a process for the production of transgenic potatoes with a reduced degree of branching of amylopectin starch, comprising the following steps: A) transferring and incorporating a vector according to the invention into the genome of a potato cell and b) regenerating intact, whole plants from the transformed the cells.

Slutligen åstadkommer hppfinningen användning av nämnda transgena potatisar för produktion av stärkelse.Finally, the invention provides the use of said transgenic potatoes for the production of starch.

Uppfinningen kommer att beskrivas mer i detalj nedan i förbindelse med en experimentell del och åtföljande ritningar, vari J Fig 1 visar SDS-polyakrylamidelektrofores av pro- teiner extraherade från stärkelse fràn normal potatis (spår A) och transgen potatis (spàr B). Utskurna protein- band är markerade med pilari Spàr M: molekylviktsmarkör- proteiner (kDa). f Fig 2 visar fyra peptidsekvenser härledda från spjälkade proteiner fràn potatisknölstärkelse.The invention will be described in more detail below in connection with an experimental part and accompanying drawings, in which Fig. 1 shows SDS-polyacrylamide electrophoresis of proteins extracted from starch from normal potatoes (lane A) and transgenic potatoes (lane B). Cut protein bands are marked with pillar Track M: molecular weight marker proteins (kDa). Figure 2 shows four peptide sequences derived from digested proteins from potato tuber starch.

Fig 3 visar en cDNA-sekvens sàväl som aminosyrasek- vensen i enbokstavskod av det nya stärkelseförgreningsen- zymet II enligt föreliggande uppfinning, omfattande 1393 nukleotider respektive 464 aminosyror.Figure 3 shows a cDNA sequence as well as the amino acid sequence in a single letter code of the novel starch branching enzyme II of the present invention, comprising 1393 nucleotides and 464 amino acids, respectively.

EXPERIMENTELL DEL Å Isolering av stärkelse frånfpotatisknölar Potatisplantor (Solanum tuberosum) odlades pà fält.EXPERIMENTAL PART Å Isolation of starch from potato tubers Potato plants (Solanum tuberosum) were grown in the field.

Skalade knölar fràn antingen cv. Early Puritan eller fràn en transgen potatislinje som i huvudsak saknar granulbun- det stärkelsesyntas I (Svalöf Weibull AB, internationella patentansökan PCT/SE9l/OO89å), homogeniserades vid 4°C i en fruktpress. Till "saftfraktionen", som innehöll en stor fraktion av stärkelsen, sattes omedelbart Tris-HCl, lll) i H. l 10 15 20 25 30 35 513 208 pH 7,5, till 50 mM, Na-ditionat till 30 mM och etylendi- nitrilotetraättiksyra (EDTA) till 10 mM. Stärkelsegranu- lerna fick sedimentera i 30 min och tvättades 4x med 10 bäddvolymer tvättbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA). Stårkelsen som lämnades på bänken vid +4°C i 30 min för att sedimentera mellan varje tvättning, tvät- tades slutligen med 3 X 3 bäddvolymer aceton, lufttorka- des över natten och lagrades vid -20°C.Peeled tubers from either cv. Early Puritan or from a transgenic potato line that mainly lacks the granule-bound starch synthase I (Svalöf Weibull AB, international patent application PCT / SE91 / OO89å), was homogenized at 4 ° C in a fruit press. To the "juice fraction", which contained a large fraction of the starch, was immediately added Tris-HCl, III) in H, pH 7.5, to 50 mM, Na-dithionate to 30 mM and ethylenedi nitrilotetraacetic acid (EDTA) to 10 mM. The starch granules were allowed to settle for 30 minutes and washed 4x with 10 bed volumes of wash buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM EDTA). The starch left on the bench at + 4 ° C for 30 minutes to settle between each wash was finally washed with 3 X 3 bed volumes of acetone, air dried overnight and stored at -20 ° C.

Extraktion av proteiner från knölstärkelse Lagrad stärkelse (20 g) landades kontinuerligt med 200 ml extraktionsbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2% (vikt/vol) natriumdodecylsulfat (SDS), 5 mM EDTA) genom aspiration med en pipett vid 85°C tills stärkelsen var gelatiniserad. Proverna frystes därefter vid -70°C i l h.Extraction of proteins from tuber starch Stored starch (20 g) was landed continuously with 200 ml extraction buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2% (w / v) sodium dodecyl sulphate (SDS), 5 mM EDTA) by aspiration with a pipette at 85 ° C until the starch was gelatinized. The samples were then frozen at -70 ° C for 1 hour.

Efter upptining vid 50°C centrifugerades proverna i 20 min vid 12000xg vid 10°C. Supernatanterna uppsamlades och àtercentrifugerades vid 3000xg i 15 min. De slutliga supernatanterna filtrerades genom 0,45 pm filter och 2,25 volymer iskall aceton tillsattes. Efter 30 min inkubation vid 4°C uppsamlades proteinfällningarna genom centrifuge- ring (3000xg i 30 min vid 4°C) och löstes i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. En alikvot av varje beredning analyse- rades med SDS-polyakrylamidgelelektrofores enligt Laemmli (1970) (fig 1). Proteinerna i de återstående delarna av beredningarna koncentrerades genom utfällning med tri- kloràttiksyra (10%) och proteinerna separerades på en 8% SDS-polyakrylamidgel Laemmli (1970). Proteinerna i gelen färgades med Coomassie Brilliant Blue R-250 (0,2% i 20% metanol, 0,5% ättiksyra, 79,5% Hfﬁ.After thawing at 50 ° C, the samples were centrifuged for 20 minutes at 12000xg at 10 ° C. The supernatants were collected and centrifuged at 3000xg for 15 minutes. The final supernatants were filtered through a 0.45 μm filter and 2.25 volumes of ice-cold acetone were added. After 30 minutes of incubation at 4 ° C, the protein precipitates were collected by centrifugation (3000xg for 30 minutes at 4 ° C) and dissolved in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5. An aliquot of each preparation was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis according to Laemmli (1970) (Fig. 1). The proteins in the remaining portions of the formulations were concentrated by precipitation with trichloroacetic acid (10%) and the proteins were separated on an 8% SDS-polyacrylamide gel Laemmli (1970). The proteins in the gel were stained with Coomassie Brilliant Blue R-250 (0.2% in 20% methanol, 0.5% acetic acid, 79.5% Hf ﬁ.

Spjälkning i gel och sekvenering av peptider De färgade banden som markerats med pilar i fig 1, motsvarande en skenbar molekylvikt av 100 kDa, skars ut och tvättades två gånger med 0,2 M NHJﬁXg i 50% aceto- nitril under kontinuerlig omröring vid 35°C i 20 min.Cleavage in gel and sequencing of peptides The colored bands marked with arrows in Fig. 1, corresponding to an apparent molecular weight of 100 kDa, were excised and washed twice with 0.2 M NH 4 ﬁ Xg in 50% acetonitrile with continuous stirring at 35 °. C for 20 min.

Efter varje tvättning avlägsnades vätskan och gelbitarna fick torka genom indunstning i ett dragskåp. De fullstän- digt torkade gelbitarna placerades därefter separat på 10 15 20 25 30 35 513 208 parafilm och 2 pl 0,2 M NHÅI5, 0,02% Tween-20 tillsattes.After each wash, the liquid was removed and the gel pieces were allowed to dry by evaporation in a fume hood. The completely dried gel pieces were then placed separately on 10 15 20 25 30 35 513 208 parafilm and 2 μl of 0.2 M NH 4 +, 0.02% Tween-20 was added.

Modifierat trypsin (Promega) Madison, WI, USA) (0,25 pg i 2 ul) sögs in i gelbitarna, varefter 0,2 M NH;CO3tillsat- tes i 5 pl portioner tills de hade ätertagit sina ur- sprungliga storlekar. Gelbitarna delades ytterligare i tre bitar och överfördes till ett Eppendorf-rör. 0,2 M NELCO3 (200 pl) tillsattes och proteinerna i gelbitarna spjälkades över natten vid B7°C (Rosenfeld et al 1992).Modified trypsin (Promega) Madison, WI, USA) (0.25 pg in 2 μl) was sucked into the gel pieces, after which 0.2 M NH 4 CO 3 was added in 5 μl portions until they had regained their original sizes. The gel pieces were further divided into three pieces and transferred to an Eppendorf tube. 0.2 M NELCO 3 (200 μl) was added and the proteins in the gel pieces were digested overnight at B7 ° C (Rosenfeld et al 1992).

Efter avslutad spjälkning tillsattes trifluorättiksyra till 1% och supernatanterna avlägsnades och sparades.After digestion was complete, trifluoroacetic acid was added to 1% and the supernatants were removed and saved.

Gelbitarna extraherades vidare två gånger med 60% aceto- nitril, 0,l% trifluorättiksyra (200 ul) under kontinuer- lig skakning vid 37°C i 20 min. De tvà supernatanterna fràn dessa extraktioner kombinerades med den första supernatanten. Gelbitarna tvättades slutligen med 60% acetonitril, 0,l% trifluoràttiksyra, 0,02% Tween-20 (200 ul). Även dessa supernatanter kombinerades med de andra supernatanterna och volymen reducerades till 50 ul genom indunstning. De extraherade peptiderna separerades pà ett SMART® kromatografisystem (Pharmacia, Uppsala, Sverige) försett med en uRPC C2/C18 SC2.l/10 kolonn. Pep- tider eluerades med en gradient av 0-60% acetonitril i vatten/0,1% trifluorättiksyfa över 60 min med en flödes- hastighet av 100 ul/min. Peptiderna sekvenerades antingen pà en Applied Biosystems 470A gasfassekvenator med en on line PTH-aminosyraanalysapparat (l20A) eller pà en modell 476A enligt instruktionerna fràn tillverkaren (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).The gel pieces were further extracted twice with 60% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid (200 μl) with continuous shaking at 37 ° C for 20 minutes. The two supernatants from these extractions were combined with the first supernatant. The gel pieces were finally washed with 60% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid, 0.02% Tween-20 (200 μl). These supernatants were also combined with the other supernatants and the volume was reduced to 50 μl by evaporation. The extracted peptides were separated on a SMART® chromatography system (Pharmacia, Uppsala, Sweden) equipped with a uRPC C2 / C18 SC2.1 / 10 column. Pep times were eluted with a gradient of 0-60% acetonitrile in water / 0.1% trifluoroacetic acid over 60 minutes at a flow rate of 100 μl / min. The peptides were sequenced either on an Applied Biosystems 470A gas phase sequencer with an on-line PTH amino acid analyzer (120A) or on a Model 476A according to the manufacturer's instructions (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Fyra av de sekvenerade peptiderna gav lätt tolkbara sekvenser (fig 2). En databässökning avslöjade att dessa fyra peptider uppvisade likﬁet med stärkelseförgrenings- enzymer och det var intressant att notera att peptiderna var mer besläktade med stärkelseförgreningsenzym II från andra växtarter än med stäráelseförgreningsenzym I fràn potatis. I 10 l5 20 25 30 35 513 208 Konstruktion av oligonukleotider som kodar för peptiderna 1 och 2 Degenererade oligonukleotider som kodar för peptid 1 och peptid 2 syntetiserades sàsom framàtriktade respek- tive omvända primersekvenser: Oligonukleotid 1: 5'-gtaaaacgacggccagt-TTYGGNGTNTGGGARATHTT-3' (resterna 1-8 i peptid 1) Oligonukleotid 2: 5'-aattaaccctcactaaaggg-CKRTCRAAYTCYTGIARNCC-3' (resterna 2-8 i peptid 2, omvänd sträng) vari H är A, C eller T, C, G eller T; R är A eller G; Y är C eller T; baser med I är inosin; K är G eller T; N är A, små bokstäver tillades som märkningssekvenser.Four of the sequenced peptides gave easily interpretable sequences (Fig. 2). A database search revealed that these four peptides showed similarity to starch branching enzymes and it was interesting to note that the peptides were more related to starch branching enzyme II from other plant species than to starch branching enzyme I from potatoes. Construction of Oligonucleotides Encoding Peptides 1 and 2 Degenerate oligonucleotides encoding peptide 1 and peptide 2 were synthesized as forward and reverse primer sequences, respectively: Oligonucleotide 1: 5'-gtaaGGATGTAgTG (residues 1-8 in peptide 1) Oligonucleotide 2: 5'-aattaaccctcactaaaggg-CKRTCRAAYTCYTGIARNCC-3 '(residues 2-8 in peptide 2, reverse strand) wherein H is A, C or T, C, G or T; R is A or G; Y is C or T; bases with I are inosine; K is G or T; N is A, lowercase letters were added as labeling sequences.

Rening av mRNA från potatisknöl, syntes av cDNA och PCR- -amplifiering av ett cDNA-fragment motsvarande potatis- stärkelseförgreningsenzym II Totalt RNA från mogna potatisknölar (S. tuberosum cv. Amanda) isolerades såsom beskrivits (Logemann et al 1987). ning av 2 pg totalt RNA och 60 pmol oligo-dT” som ned- Första strängens CDNA syntetiserades med använd- ströms primersekvenser. Primersekvensen hybridiserades till polyA i mRNA vid 60°C i 5 min. Förlängningen av cDNA genomfördes enligt den tekniska manualen fràn tillverka- ren med användning av Riboclone® cDNA Synthesis System M-MLV (H-) CDNA som kodar för det nya stärkelseförgreningsen- (Promega). zymet II enligt uppfinningen amplifierades i en Perkin- -Elmer GeneAmp® 9600 PCR thermocycler (Perkin-Elmer Cetus Instruments, CT, USA) med användning av tvà degenererade primersekvenser konstruerade fràn peptiderna 1 och 2 (se ovan) under följande betingelser: l mM dNTP, 1 pM av var- dera primersekvensen och en alikvot av cDNA beskrivet 10 l5 20 25 30 35 513 208 ovan i en total reaktionsvolym av 20 pl med lx AmpliTaq® buffert och 0,8 enheter AmpliTaq® (Perkin-Elmer Cetus).Purification of potato tuber mRNA, cDNA synthesis and PCR amplification of a cDNA fragment corresponding to potato starch branching enzyme II Total RNA from mature potato tubers (S. tuberosum cv. Amanda) was isolated as described (Logemann et al 1987). of 2 pg total RNA and 60 pmol oligo-dT ”as down- The first strand CDNA was synthesized with use current primer sequences. The primer sequence was hybridized to polyA in mRNA at 60 ° C for 5 min. The extension of the cDNA was performed according to the technical manual from the manufacturer using the Riboclone® cDNA Synthesis System M-MLV (H-) CDNA which encodes the new starch branching (Promega). The enzyme II of the invention was amplified in a Perkin-Elmer GeneAmp® 9600 PCR thermocycler (Perkin-Elmer Cetus Instruments, CT, USA) using two degenerate primer sequences constructed from peptides 1 and 2 (see above) under the following conditions: 1 mM dNTP , 1 pM of each primer sequence and an aliquot of cDNA described 10 l 5 20 25 30 35 513 208 above in a total reaction volume of 20 μl with 1x AmpliTaq® buffer and 0.8 units AmpliTaq® (Perkin-Elmer Cetus).

Cykliseringsbetingelserna var: 96°C i 1 min, 80°C medan enzymet tillsattes som en “hotstart" (ungefär 15 min), en: oavsiktlig: fall till 25%, s cykler vid 94°c i 20 s, 45°C i 1 min, höjning till 72°C under 1 min och bibehål- lande vid 72°C i 2 min, och 30 cykler av 94°C i 5 s, 45°C i 30 s och 72°C i (2 min + 2 s per cykel) och komplet- terat med 72°C i 10 min före kylning till 4°C.The cyclization conditions were: 96 ° C for 1 min, 80 ° C while the enzyme was added as a "hot start" (about 15 min), a: unintentional: drop to 25%, s cycles at 94 ° c for 20 s, 45 ° C for 1 min, raising to 72 ° C for 1 min and maintaining at 72 ° C for 2 min, and 30 cycles of 94 ° C for 5 s, 45 ° C for 30 s and 72 ° C for (2 min + 2 s per cycle) and supplemented with 72 ° C for 10 minutes before cooling to 4 ° C.

Ett prov av denna reaktion (0,1 pl) omamplifierades med användning av cykliserihgsbetingelserna: 96°C i 1 min, 80°C medan enzymet tillsattes som en "hotstart" (ungefär 5 min), 5 cykler av 94°C i 20 s, 45°C i 1 min och 72°C i 2 min, och 25 cyklerfav 94°C i 5 s, 45°C i 30 s och 72°C i 10 min före kylning till 4°G. Efter avslutad PCR-ampli- (2 min + 2 s per cykel) och avslutad med 72°C i fiering satsades reaktionsblandningen pä en 1,5% Seakem® agarosgel (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA). Efter elektrofores och färgning med etidiumbromid skars ett huvudband ut med en synbar storlek av 1500 bp och frag- mentet eluerades genom skakning i vatten (200 pl) i 1 h.A sample of this reaction (0.1 μl) was unamplified using the cyclization conditions: 96 ° C for 1 min, 80 ° C while the enzyme was added as a "hot start" (approximately 5 min), 5 cycles of 94 ° C for 20 s , 45 ° C for 1 min and 72 ° C for 2 min, and 25 cycles of 94 ° C for 5 s, 45 ° C for 30 s and 72 ° C for 10 min before cooling to 4 ° G. After completion of PCR ampli- (2 min + 2 s per cycle) and completion at 72 ° C in celebration, the reaction mixture was applied to a 1.5% Seakem® agarose gel (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA). After electrophoresis and staining with ethidium bromide, a headband with a visible size of 1500 bp was excised and the fragment was eluted by shaking in water (200 μl) for 1 hour.

Detta fragment användes som mall i sekveneringsreaktioner efter omamplifiering med användning av primersekvenser motsvarande märkningssekvenserna (i oligonukleotiderna 1 och 2), rening med agarosgelelektrofores som ovan och extraktion fràn gelen med användning av Qiaex® gelext- raktionssats enligt tillverkarens instruktioner (DIAGEN GmbH, Hilden, Tyskland). Sekveneringsreaktionerna gjordes med användning av DyeDeoxy®:Terminator Cycle Sequencing kits (Perker-Elmer Cetus Indtruments) med användning av märkningssekvenser och inteﬁna primersekvenser. Sekvene- ringsreaktionen analyseradeš pà en Applied Biosystems 373A DNA-sekvenerare enligt;tillverkarens protokoll. Sek- vensen redigerades och gav än sekvens omfattande 1393 bp (fig 3), exklusive nukleotiderna 1 och 2. Jämförelser av konsensussekvensen med EMBL¿ och GenBank-databaserna visade ca 80% identitet med stärkelseförgreningsenzym II 10 15 20 25 30 35 513 208 från andra växtarter. Föreliggande uppfinnare betecknar därför enzymet som kodas av den nya förgreningsenzymsek- vensen för potatisstärkelseförgreningsenzym II ("potato starch branching enzyme II").This fragment was used as a template in sequencing reactions after amplification using primer sequences corresponding to the labeling sequences (in oligonucleotides 1 and 2), purification by agarose gel electrophoresis as above and extraction from the gel using Qiaex® gel extraction kit according to the manufacturer's instructions (DIAGEN GmbH, Hilden, Hilden ). The sequencing reactions were performed using DyeDeoxy®: Terminator Cycle Sequencing kits (Perker-Elmer Cetus Indtruments) using labeling sequences and not primers. The sequencing reaction was analyzed on an Applied Biosystems 373A DNA sequencer according to the manufacturer's protocol. The sequence was edited and gave a sequence comprising 1393 bp (Fig. 3), excluding nucleotides 1 and 2. Comparisons of the consensus sequence with EMBL¿ and the GenBank databases showed about 80% identity with starch branching enzyme II 10 15 20 25 30 35 513 208 from others plant species. The present inventors therefore designate the enzyme encoded by the new potato starch branching enzyme II ("potato starch branching enzyme II") sequence.

Transformation av potatisplantor Det isolerade fullängds-cDNA fràn potatisstärkelse- förgreningsenzym II och andra funktionellt aktiva frag- ment i området 50-2700 bp från fullängds-cDNA (se nedan) klonas i omvänd orientering efter promotorer som är akti- va i potatisknölar. Med uttrycket "funktionellt aktiva" menas fragment som kommer att pàverka amylos/amylopektin- förhållandet i potatisstärkelse. Den för närvarande till- gängliga DNA- och aminosyrasekvensen av SBE II enligt uppfinningen visas i fig 3. Promotorerna är valda bland t ex patatinpromotorn, promotorn fràn genen för granul- bundet potatisstärkelsesyntas I eller promotorer isolera- de från generna för potatisstärkelseförgreningsenzymerna I och II. Konstruktionen klonas antingen i en binär Ti-plasmidvektor lämplig för transformation av potatis medierad av Agrobacterium tumefaciens, eller i en vektor, lämplig för direkt transformation med användning av bal- listiska tekniker eller elektroporering. Det inses att sens- (se nedan) och antisens-konstruktionerna màste innehålla alla nödvändiga reglerelement. Transgena pota- tisplantor transkriberar specifikt den omvända stärkel- seförgreningsenzym II-konstruktionen i knölarna, vilket leder till antisensinhibering av enzymet. En reduktion av och ett förändrat mönster för förgreningen av amylopektin såväl som ett ändrat amylos/amylopektinförhällande bör därvid uppträda i potatisknölstärkelse.Transformation of potato plants The isolated full-length cDNA from potato starch branching enzyme II and other functionally active fragments in the range 50-2700 bp from the full-length cDNA (see below) is cloned in reverse orientation after promoters active in potato tubers. By the term "functionally active" is meant fragments which will affect the amylose / amylopectin ratio in potato starch. The currently available DNA and amino acid sequence of SBE II according to the invention is shown in Figure 3. The promoters are selected from, for example, the potato promoter, the promoter from the granule-bound potato starch synthase I gene or promoters isolated from the potato starch branching enzymes I and II genes. The construct is cloned either into a binary Ti plasmid vector suitable for transformation of potatoes mediated by Agrobacterium tumefaciens, or into a vector suitable for direct transformation using ballistic techniques or electroporation. It is understood that the sense (see below) and antisense constructions must contain all the necessary control elements. Transgenic potato plants specifically transcribe the reverse starch branching enzyme II construct in the tubers, leading to antisense inhibition of the enzyme. A reduction of and a changed pattern for the branching of amylopectin as well as a changed amylose / amylopectin ratio should then occur in potato tuber starch.

Antisenskonstruktionen för potatisstärkelseförgre- ningsenzym II används också i kombination med antisens- konstruktioner för potatisstärkelseförgreningsenzym I, för granulbundet potatisstärkelsesyntas II, för lösliga potatisstärkelsesyntaser II och III, för potatisstärkel- sedisproportioneringsenzym (D-enzym) eller för potatis- stärkelseavförgreningsenzym för att transformera potatis 10 15 20 513 208 till att ändra graden av förgrening av amylopektin och amylos/amylopektinförhällandet. Detta kommer att ge nya och värdefulla material till stärkelseprocessindustrin.The antisense construct for potato starch branching enzyme II is also used in combination with antisense constructs for potato starch branching enzyme I, for granular bound potato starch synthase II, for soluble potato starch synthases II and III, for potato starch disproportionation enzyme (10-branching enzyme) 513 208 to change the degree of branching of amylopectin and the amylose / amylopectin ratio. This will provide new and valuable materials to the starch process industry.

Det isolerade potatisstärkelseförgreningsenzymet II enligt uppfinningen kommer öcksà att användas för att isolera ett fullängds-CDNA som kodar för enzymet antingen genom amplifiering, såsom med PCR-teknologin, eller genom undersökning av CDNA-bibliotek eller genom en kombination av dessa tillvägagångssätt.ÄFullängds-CDNA-sekvensen som kodar för enzymet klonas i sensorientering efter en eller flera av de ovan nämnda promotorerna, och konstruktioner- na överföres till lämpliga transformationsvektorer, såsom beskrivs ovan, och används för transformation av potatis.The isolated potato starch branching enzyme II of the invention will also be used to isolate a full-length CDNA encoding the enzyme either by amplification, such as by PCR technology, or by examination of CDNA libraries or by a combination of these methods. the sequence encoding the enzyme is cloned into sensor orientation after one or more of the above promoters, and the constructs are transferred to appropriate transformation vectors, as described above, and used to transform potatoes.

Regenererade transformerade potatisplantor förväntas producera ett överskott av stärkelseförgreningsenzym II i knölarna, vilket leder till en ökad grad och förändrat mönster av förgrening av amylopektin eller till inhibe- ring av transkription av endogen stärkelseförgreningsen- zym II-transkription beroende pà sam-suppression, vilket resulterar i en minskad förgrening av amylopektin. lO l5 20 25 513 208 10 Referenser Mülle-Röber, B., Koßmann, J., (1994) Approaches to in- fluence starch quantity and starch quality in transgenic plants. Plant Cell Environm. 17, 601-613.Regenerated transformed potato plants are expected to produce an excess of starch branching enzyme II in the tubers, leading to an increased degree and altered pattern of branching of amylopectin or to inhibiting transcription of endogenous starch branching enzyme II transcription due to co-suppression, resulting in a reduced branching of amylopectin. lO l5 20 25 513 208 10 Referenser Mülle-Röber, B., Koßmann, J., (1994) Approaches to in- fluence starch quantity and starch quality in transgenic plants. Plant Cell Environm. 17, 601-613.

Martin, C., Smith, A. (1995) Starch Biosynthesis. Plant Cell 7, 971-985.Martin, C., Smith, A. (1995) Starch Biosynthesis. Plant Cell 7, 971-985.

Laemmli, U.K. (1979) Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.Laemmli, U.K. (1979) Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

Logemann, J., Schell, J. och Willmitzer, L. (1987) Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Anal. Biochem. 163, 16-20.Logemann, J., Schell, J. and Willmitzer, L. (1987) Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Anal. Biochem. 163, 16-20.

Rosenfeld, J., Capdeville, J., Guillemot, J.C., Ferrara, P. (1992) In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203, 173-179.Rosenfeld, J., Capdeville, J., Guillemot, J.C., Ferrara, P. (1992) In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203, 173-179.

Visser, R.G F., Jacobsen, E. (1993) Towards modifying plants for altered starch content and composition.Visser, R.G F., Jacobsen, E. (1993) Towards modifying plants for altered starch content and composition.

TibTech 11, 63-68.TibTech 11, 63-68.

Claims

10 15 20 25 30 35 513 zeà 1 1 PATÉNTKRAV

1. A process for the production of transgenic potatoes with either an increased or decreased degree of branching of amylopectin starch, characterized in that it comprises the following steps J) a transfer and incorporation of a vector comprising all or a functionally active part of the DNA sequence encoding potato starch branching enzyme II (SBE II) comprising the nucleotide sequence shown in Fig. 3 of the accompanying drawings, or variants thereof resulting from the degeneration of the genetic code, and regulatory elements active in potatoes into the the name of a potato cell and b) regeneration of intact, whole plants from the transformed cells.

Method for the production of transgenic potatoes with a reduced degree of amylopectin starch branching, characterized in that it comprises the following Steps: a) transmitting and incorporating a vector comprising all or a functionally active part of the DNA sequence encoding for starch branching enzyme II (SBE II) from potatoes comprising the nucleotide sequence shown in Fig. 3 of the accompanying drawings and regulatory elements active in potatoes, which DNA sequence is inserted in the antisense direction (reverse orientation), into the genome of a potato cell and I b ) regeneration of intact, whole plants from the transformed cells.

The method of claim 2, wherein the vector also comprises an antisense construct of starch branching (SBE I).

A method according to claim 2 or 3, wherein the vector enzyme I, also comprises an antisense construct of granule-bound potato starch synthase-II; ~ -ß »- +« -1 ---- '= ~~ = ~ i f-' ~~ ~ = ~ = »~ * - HA.1L || .n | \ xm |. |. | .. || l. \ I | .. | u | m .. \. |. | \ M. 10 513 208 12

A method according to any one of claims 2 to 4, wherein the vector also comprises an antisense construct of soluble potato starch synthases II and III.

A method according to any one of claims 2 to 5, wherein the vector also comprises an antisense construct of potato starch disproportionation enzyme (D enzyme). _

A method according to any one of claims 2 to 6, wherein the vector also comprises an antisense construct of potato starch branching enzyme.

Use of transgenic potatoes prepared according to one or more of claims 1-7 for the production of starch. ï