SE459099B - Saett att oevervaka en mikrobiologisk process varvid de uttagna proven blandas med en inhibitor - Google Patents

Description

man ett prov i en bioreaktor och ror detta till ett 10 15 20 25 30 35 40 analysställe, så finns det risk att processen fortsätter under transporten och detta eventuellt under delvis ändrade för- hållanden. Mätresultatet behöver därför icke ge en klar bild av läget vid provtagningsögonblicket. En möjlighet att lösa detta problem är att snabbt "frysa" provet och transportera det i fryst tillstånd. Även härvid kan dock provresultatet påverkas.

BESKRIVNIHQ AV UPPFINNINGEN Ovannämnda problem löses enligt uppfinningen på så sätt att nämnda vätskeprov blandas med en inhibitor nära prov- tagningsstället, företrädesvis i själva reaktorn, för att förhindra att processen framskrider även under transporten från provtagningsstället till analysstället.

Analysen underlättas om vätskeprovet härvid bringas till ett cellfritt tillstånd genom dialys eller annan filtrering. Den använda analysutrustningen behöver härvid icke pâverkas av de större komplexa material, som kan finnas med i vâtskeprovet från början.

Analysen underlättas även, om vätskeprovet bringas att passera en enzymreaktor med ett enzym, som omvandlar det mätta ämnet till en lättare mätbar produkt eller som konsumerar ett lätt mätbart co-substrat, t ex syre, som mätes med en enkel syreelektrod.

Analysens säkerhet underlättas, om vätskeprovet med jämna mellanrum föres förbi enzymreaktorn direkt till analysstället för nollställning av den använda analysutrustníngen.

Säkerheten underiattus ytterligare, om vätskeprovet med jämna mellanrum ersättes med en kalibreringslösning för kalib- rering av den anvënda analysutrustningen.

Såsom nämnda inhibitor väljes företrädesvis någon ur gruppen cyanider, acider och tunga metalljoner, såsom koppar-, silver- eller kvicksilverjoner.

Tillämpas sättet enligt uppfinningen vid en bioteknisk process för mätning av bildad eller förbrukad glukos, användes lämpligen kaliumcyanid såsom ínhibitor.

Alternativt till ovannämnda ämnen kan man såsom inhibitor välja en utspädningsvätska med sådan pH-nivå, att den aktuella processen avbrytas. 10 15 20 25 30 35 40 5 459 099 Tillümpas sättet enligt uppfinningen vid enzymatisk nedbrytninö av stärkelse med hjälp av amylas, kan man såsom inhibitor välja ett ämne som kallas just amylasinhibitor.

Användes istället sättet enligt uppfinningen i samband med proteinhydrolys med hjälp av enzymet proteas, så kan man såsom inhibitor välja en proteasinhibitor, t ex sojbean trypsin- inhibitor (STI) eller alfa-2-makroglobulin.

Den använda analysutrustningen kan i vissa fall pâverkas mindre, om membran eller annat filtermedium resp inhibitor väljes så i förhållande till varandra, att en väsentlig del av inhibitorn förhindras passera membranet. Härigenom minskas risken att mätresultatet förändras med tiden.

För att man skall få en klar bild av en mikrobiologisk process krävs i många fall att mätningen av nämnda ämne kombin- eras med en mätning av den totala mängden torr cellmassa i det medium, som är föremål för processen.

Företrädesvis väljas såsom enzymreaktor en sådan med enzymet uppbundet på en fast bärare, t ex porösa glaskulor.

Härigenom minskar mängden använt enzym jämfört med den mängd enzym, som krävs vid användning av detsamma i fri form.

För att icke den använda inhibitorn skall blanda sig med det medium, som är föremål för processen, väljes lämpligen såsom provtagningsinstrument en dubbel~lumen-kateter, i vilken en lumen användes för att transportera inhibitorn till en punkt nära provtagningsstället, medan den andra lumen användes till att transportera vätskeprovet tillsammans med inhibitorn till analysstället.

Lämpligen använder man sig av en dubbel-lumen-kateter bestående av två koncentriska rör, varvid det inre röret slutar på ett kort avstånd från kateterns spets inuti det yttre röret och varvid lämpligen det yttre röret användes för tillförseln av nämnda inhibitor.

RITNlNGSBESKRIVNING Fig l visar i schematísk form ett analyssystem, som kan användas för genomförande av sättet enligt uppfinningen.

Pig 2 visar den främre änden av en dubbel-lumen-kateter, som kan användas i samband med genomförandet av sättet enligt uppfinningen. 459 099 10 15 20 25 30 35 ig 3 visar glukoshaltens ändring vid en försöks- fermentation av Saccharomyces cerevisiae.

Fig 4 visar glukoshaltens ändring vid en försöks- fermentation av Escherichia coli.

UTRUSTNING m Den i fig 1 visade utrustningen kan användas för över- vakning av olika biotekniska, t ex mikrobiologiska eller enzym- atiska processer, men beskrivas för enkelhets skull i samband med fermentation. Vid en sådan användning betecknar 1 en fermen- tor med ett medium 2, som omröres med hjälp av en omrörare 3.

Prov uttages med en dubbel-lumen-kateter 4, vars främre ände visas í förstorad skala i fíg 2. Till katetern föres via en ledning 5 med en pump 6 en inhibítor från en källa 7. Denna inhibitor blandas med ett vätskeprov från fermentorn l och föres via en ledning 8 till en ventil 9.

Under provtagning Eöres den från ventilen 9 genom en ledning 10 med en pump 11 in i en dialysator 12 pà den ena sidan om ett membran 13 och vidare genom en ledning 14 till en slaskpåse 15. En del av prdvet dialyseras emellertid genom membranet 13 o ch föres vidare genom en ledning 16 till en ventil 17.

Från denna ventil kan provet antingen föras direkt till en mätelektrod 18 eller via en enzymreaktor 19 till samma mätelektrod. Ledes vätskeprovet förbi enzymreaktorn, sker detta genom ledningen 20. så Från mät- elektroden 18 ledes vätskeprovet genom en ledning 21 till slaskpåsen 15.

Ledes vätskeprovet förbi enzymreaktorn 19, så kan man nollställa analysutrustningen i förhållande till den syremängd, som finns i vätskeprovet före enzymreaktorn, dvs den syremängd som icke är beroende av glukoshalten. Önskar man kalibrera det använda systemet, så omställes ventilen 9 så att en kalibreringslösning kan föras via en ledning 22 från en källa 23 för en sådan lösning.

Dialysen av vätskeprovet sker mot en ren vâtskelösning, som exempelvis kan bestå av natriumklorid upplöst i vatten.

Denna losning tages från en källa 24 via en ledning 25 med en pump 26 till den provet m atorn 12. otsatta sidan av membranet 13 i dialys- 10 15 20 25 30 35 459 099 Den uppmätta signalen föres till en mikrodator 27, som i sin tur kan vara anordnad att styra i systemet ingående pumpar och ventiler. Detta antydes med streckade linjer.

Mikrodatorn 27 kan vidare stå i kontakt med en display 28 för avläsning av erhållna värden, ett tangenbord 29 för in- matning av önskade kontrollvärden samt eventuella externa datorer 30, som exempelvis kan vara anordnade att styra själva fermentationsprocessen.

*I fig 2 visas alltså den främre änden av en i samband med uppfinningen använd dubbel-lumen-kateter. Denna kateter består av ett inre rör 4a och ett yttre rör 4b, varvid det yttre röret i det visade fallet användes för att tillföra en inhibitor från källan 7, medan det inre röret användes för att föra denna inhibitor tillsammans med det uttagna provet till dialystorn 12.

Vid den visade konstruktionen är risken minimal att inhibitorn skall tränga in i fermentorn. Önskar man minska denna risk ytterligare, så kan man anordna tryck- eller flödesövervakning av de båda ledningarna 5 och 8 till och från katetern och avbryta analysen, om exempelvis tillförseln till katetern skulle överstiga vad som ledes bort.

EXEMPEL Två olika mikroorganismer, en jäst (Saccharomyces cere- visiae) och en bakterie (Escherichía coli) har använts vid försök till övervakning i enlighet med uppfinningen. Detta skedde i samband med fermentation, som utfördes i en fermentor med en arbetsvolym på 3 liter (PLC-B~3, Chemoferm AB, Hägersten, Sweden).

Saccharomyces cerevisiae kultiverades i ett medium inne- hållande (alm: gnnws 3,6; Nn4c1 0,8; Na2n1=o4 2 ago 0,6; xazroê 0,4; MgSO4 7 H20 0,2 samt jästextrakt 1,0. Magnesiumsulfat och glukos autoklaverades separat.

Temperaturen hölls vid 30°C och pH vid 6,0 genom auto- matisk-titrering med hjälp av l,0 M Na0H. Ett par droppar antiskumuingsmedel tillfogades för att förhindra skumning.

Luftflödet hölls vid ungefär 1 vvm (volym per volym och minut) och omrërarens hastighet hölls vid 300 varv per minut. Ûggnympulingssatsen (l00 nl) fick växa över natten på ett substrat (YHB, Difco, USA) vid ningsanorduing. 30°C i en roterande omskak- Escherichia coli kultiverades vid 37°C i ett medium 5 innehållande (g/l) glukos 4,3; NH4C1 0,8; Ha2HPG4 2 H20 0,6; jästextrakt 1,0 samt spårämnen cac12 2 H20 0,33; zns04 7 H20 0,09; cus04 5020 0,08 och mns04 4 H20 0,08. Glukos, Më304 och FeCl3 autoklaverades separat.

KH2Po4 0,4; ngs04 7 H20 0,2; (mt/1) Fec13 6 H20 8,35; C°Cl2 2 H20 0,09; 10 pH hölls vid 7,0 genom automatisk tillförsel av 1,0 M NaOH.

Några droppar av antiskumningsmedel tillfördes för för- nindrande av skumning. Luftflödet var ungefär 1 vvm och om- rörningshastigheten sattes vid 500 varv per minut. Inympnings- satsen (100 ml) kultiverades över natten på ett substrat-(NB, 15 Difco, USA) vid 37° C i en roterande omskakare. Avjoniserat vatten användes.

KEHIKALIER 20 Glukos (AnalaR) erhölls från BDH Chemicals Ltd, England.

Jästextrakt köptes från Dífco, USA. Antiskumningsmedel (Adekanol LG-109) anskaffades från Asahi Electro Chemical Company, Japan.

Alla andra kemikalier var av analyskvalitet. 25 SEPARATA ANALYSER Torrvikten av cellerna bestämdes genom filtrering av en känd volym fermentationslösning genom ett förtorkat membran- filter (0,2 U m, Schleicher & Schuell, FRG). Filtret torkades 30 därefter vid l05°C i 75 minuter och vägdes.

Kontrollprov för glukosbestämning togs från fermentorn genom ett gummimembran vid dennas botten. Proverna steril- filtrerades (0,2 um, Sartorius) inom 30 sekunder och frystes omedelbart. Glukoshalten bestämdes med användning av en kommers- iellt tillgänglig enzymatisk provtagningssats (Glukos, test, Merck, Darmstadt, FRG). 35 Mercko- 10 15 20 25 30 35 459 099 INSTRUHENTERING Analysutrustningen som användes var en kommersiellt tillgänglig glukosmonitor (Gambro AB, Lund, Sweden) innehållande de i fig 1 visade detaljerna. Själva analysdelen utgjordes av en glukos-oxidas~elektroddetektor av Clark-typ.

PROVTAGNINGSUTRUSTHING Provtagningsutrustningen utgjordes av den ovan beskrivna och i fig 2 visade dubbel-lumen-katetern. Flödet i den yttre ledningen hölls härvid vid 3 ml/h medan flödet i den inre ledningen hölls vid 6 ml/h. Membranet i dialysatorn utgjordes av en 17 mikron tjock flatfolie av Cuprofan. Pâ den provet motsatta sidan av membranet passerade en koksaltslösning med ett flöde på 60 ml/h. Små molekyler såsom glukos kunde passera membranet medan större molekyler och andra partiklar hölls kvar. På så sätt kunde ett cellfritt prov erhållas.

Såsom inhibitor användes i båda fallen kaliumcyanid.

RESULTAT Resultatet framgår av fíg 3 och 4, varvid fig 3 avser försöket med Saccharomyces cerevisiae och fig 4 försöket med Escherichia coli. Fallet i signalen i fig 4 vid ungefär 300 minuter beror på rekalíbrering av systemet. Erhållna värden hade stor överensstämmelse med de vid sidan om gjorda kontrollprover.

KOMPLETTERANDE FÖRSÖKSBESKRIVNING Ovan nämnda försök beskrives närmare i detalj i bifogade artikel "Monitoring of glucose in fermentation processes using a commercial glucose analyser", vilket kommer att publiceras inom en nära framtid. Artikeln inkluderas därför i föreliggande beskrivning Ogâppfinnixlgen är naturligtvis icke inskränkt till enbart de ovan beskrivna utföringsexemplen, utan kan varieras inom ramen för efterföljande patentkrav. Exempelvis står det klart för fackmannen att den även kan tillämpas vid många andra bio- tekniska processer än den ovan såsom exempel valda fermenta- tionsprocessen.

Claims (15)

10 lS 20 25 30 35 459 099

1. Sätt att övervaka en mikrobiologisk process i en reaktor, vid vilken ett ämne förbrukas eller bildas, varvid koncentrationen av dettatämne mätes kontinuerligt eller dis- kontinuerligt såsom ett mått på processens framskridande eller tillstånd genom att vätskeprov föres från mediet (2), som är föremål för processen, till ett analysställe (18) på avstånd från själva processtället, kännetecknat av att nämnda vätskeprov blandas med en inhibitor (7) nära provtagningsstället (4), företrädesvis i själva reaktorn, för att förhindra att proces- sen framskrider även under transporten från provtagningsstället (4) till analysstället (18).

2. Sätt enligt kravet l, kännetecknat av att vätskeprovet bringas till cellfritt tillstånd genom dialys eller annan filtrering.

3. Sätt enligt kravet l eller 2, kännetecknat av att vätskeprovet bringas att passera en enzymreaktor (19) med ett enzym, som omvandlar det mätta ämnet till en lättare mätbar produkt eller som konsumerar ett lätt mätbart co-substrat, t ex syre, som mätes med en enkel syreelektrod (18).

4. med jämna mellanrum föres förbi enzymreaktorn (19) direkt till Sätt enligt kravet 3, kânnetecknat av att vätskeprovet analysstället (18) för nollställning av den använda analys- utrustningen.

5. att vätskeprovet med jämna mellanrum ersättes med en kalib- Sätt enligt något av föregående krav, kännetecknat av reringslösning (23) för kalibrering av den använda analys- utrustningen.

6. Sätt enligt något av föregående krav, kännetecknat av att såsom inhibitor (7) väljes någon ur gruppen eyanider, azider och tunga metalljoner, såsom koppar-, silver- eller kvick- silverjoner. 7.

Sätt enligt kravet 6, tillämpat vid en bioteknisk process för mätning av bildad eller förbrukad glukos, känne- tecknat av att såsom inhibitor (7) användes kaliumcyanid.

Sätt enligt något av kraven l-S, kännetecknat av 10 15 20 25 30 att såsom inhibitor (7) väljes en utspädningsvätska med sådan pH-nivå,

9. Sätt enligt något av kraven l-5, atisk nedbrytning av st att den aktuella processen avbrytes. tillämpat vid enzym- ärxelse med hjälp av amylas, kännetecknat av att såsom inhibítor (7) väljes amylasinhibitor.

10. Sätt enligt något av kraven 1-5, tillämpat vid prot- einhydrolys med hjälp av enzymer av typ proteas, kännetecknat av att såsom inhibitor (7) väljes en proteininhibitor, sojbean trypsininhibitor (STI) eller alfa-2 t ex -makroglobulin.

ll. Sätt enligt kravt 2, kânnetecknat av att membran (13) eller annat filtermedium och inhibitor (7) väljes så i för- hållande till varandra, att en väsentlig del av ínhibitorn (7) förhindras_passera membranet (13).

12. Sätt enligt något av föregående krav, att mätningen av nämnda äm kännetecknat av ne kombineras med en mätning av den totala mängden torr cellmassa i det medium (2), som är föremål för processen.

13. Sätt enligt kravet 3, enzymreaktor (19) väljas en s fast bärare, 14. kännetecknat av att såsom âdan med enzymet uppbundet på en t ex porösa glaskulor.

Sätt enligt något av föregående krav, kännetecknat av att såsom provtagningsinstrument väljes en dubb (4), el-lumen-kateter i vilken en lumen (Ab) användes för att transportera innibitorn till en punkt nära provtagningsstället, medan den andra lumen 4a användes till att transportera vätskeprovet tillsammans med inhibitorn (7) till analysstället.

15. Sätt enligt kravet 14, kännetecknat av att såsom nämnda dubbel-lumen-kateter (4) väljes en sådan bestående av tvâ koncentriska rör, varvid det inre röret (4b) slutar på ett kort avstånd från kateterns spets inuti det yttre röret (4a) och varvid lämpligen det yttre röret (4a) användes för tillförsel av inhibitorn (7).