SE454646B - Erektions- och fertilitetsbefremjande medel fran cowper's- och/eller bartholini's kortlar fran deggdjur inbegripet menniskan samt sett for framstellning derav - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 454 646 från körteln koagulerar semen. Det bildas därvid en slempropp, vilken vid ejakulationen hindrar reflux av seminalvätska. R.G.

Hart. The mecanism of Covper's secretion in coagulating rat semen. J. Reprod, Fert. (1968). 17. 223-226. J.J. Gueze och J.W. Slot Synthesis and secretion of glycoproteins in rat bulbo-urethral (Covper's) glands. Biology of reproduction 15, 118-125 (1976).

Den biologiska effekten av lipidfraktionerna från körtlarna har tidigare aldrig undersökts. Föreliggande upptäckt av lipidfraktíonernas potenta effekt på olika delar av urogeni- talsfären är därför av stor vikt för att klarlägga körtlarnas funktion. Lipidfraktionen från dessa körtlar från män, kvin- nor, tjurar, galtar. baggar, får och kor har undersökts och visade ungefär samma egenskaper 1 farmakologiska tester som redovisas nedan.

Uppfínnarna har sålunda nu överraskande i lipidfraktionen från körtlarna från ovannämnda arter funnit en faktor som synes påverka såväl erektion som ejakulation och spermiernas rörlig- het och penetrationsförmåga genom äggvita hos människa och däggdjur. Faktorn synes vara en potent peptidolipidmediator med prostaglandinliknande/leukotrienliknande typ..

Uppfinningen avser ett medel som utgöres av sådana lipidfrak- tioner från körtlarna från människa och däggdjur som kontrahe- rar gerbil colon (ökenrättas tjocktarm). Prostaglandiner och prostaglandinliknande substanser kontraherar gerbil colon och kontraktion av gerbil colon användes därför som ett kriterium på dessa substansers biologiska aktivitet. Detta test går till på följande sätt: Övre delen av colon fríprepareras från en ökenrâtta och upphânges i ett konventionellt tarmbad där nedre fästet är fixerat medan det övre är förbundet med en sensor som registrerar kontraktioner och relaxationer i tarmen under påverkan av olika substanser.

, Eftersom medlet kontraherar gerbil colon kan den på goda grunder anses innehålla prostaglandinliknande substanser. I de 10 15 20 25 30 35 454 645 lipidfraktioner från körtlarna som kontraherar gerbíl colon och som utgör medlet enligt uppfinningen har dock inga kända prostaglandíner kunnat påvisas (jämför exemplet och figurerna 2, 3, 4 och 5 där det framgår att prostaglandinerna PGI2.

PGEI. PGE2. PGFZIX och PGA2 ej kunnat påvisas i sådana lipidfraktioner från körtlarna som kontraherar gerbil colon med den använda tekniken). Kontraktíonerna av gerbíl colon kan därför användas som ett kriterium på att faktorn med fertili- tetsbefrämjande egenskaper enligt uppfinningen föreligger i lipidextraktet från körtlarna.

Faktorn reagerar positivt på ninhydrin vilket talar för att den innehåller aminogrupper. Undersökningar med dispersiv röntgenanalys (KEVEX) visar förekomst av svavel (S) i faktorn.

Dessa båda förhållanden - den positiva ninhydrinreaktionen och S förekomst - talar för att faktorn har likheter med leuko- trienerna. Dessa kontraherar emellertid icke gerbil colon.

Däremot kontraherar de, i likhet med faktorn, potent uterus- muskulaturen.

Gaskromatografisk-masspektrometrisk analys visar en komplex blandning där emellertid vissa fragment talar för närvaro av neurotransmittorliknande substanser med molekylvikt mellan 200 - 1000 m/e.

NHR (nuclear magnetic resonance) av en fraktion med stor biologisk aktivitet har visat alla karakteristika för prosta- glandinliknande substanser såsom: lång kedja, närvaro av fett- syror, terminal CH3-grupp.

Medlet enligt uppfinningen framställes med vanliga extrak- tions- och separationsmetoder för prostaglandiner. Körtlarna kan sålunda först befrias från proteiner med t.ex. etanol- extraktion och sedan extraheras återstoden vid surt pH med dietyleter som löser lipider. Han kan även extrahera körtlarna direkt vid surt pH en eller flera gånger med lösningsmedel isynnerhet lipidlösningsmedel såsom etylacetat, isopropanol. metanol. aceton. kloroform och blandningar därav såsom kloro- 10 15 20 25 30 35 454 646 o form/metanol 2:1, vol/vol; etylacetat 1 blandning med isopro- panol. metanol, aceton i varierande volymprocent med vatten eller ovanstående lösningsmedel; företrädesvis metanol eller etylacetat/metanol 3:1. vol/vol. pH-värdet justeras med buf- fert till pH 3.5-5 företrädesvis till 4.5 med 0,1 M KH-ftalat.

Därefter avlägsnas vatten på konventionellt sätt, t.ex. genom frystorkning. Man kan även låta extraktet stå över natten i frysen vid en temperatur under O°C och avlägsna iskristaller genom filtrering vid låg temperatur under 0°C. Det är fördel- aktigt att arbeta under kväve för att skydda mot oxidativa effekter från luftens syre. Provet indunstas eventuellt sedan i vattenbad (40°C) helst under kvävgas. Detta prov kan använ- das som det erektions- och fertilitetsbefrämjande medlet en- ligt uppfinningen. Provet löses eventuellt i några ml av ovan- stående lipidlösningsmedel helst i etylacetat och förvaras under.kvâve vid -20°C.

Provet kan därefter behandlas med vanliga separationsmetoder för prostaglandiner. och sådana fraktioner som kontraherar gerbil colon tages tillvara. Separationen kan ske med kromato- grafering t.ex. på silikagel företrädesvis med s.k. torrko- lonnkromatografi under eluering med blandningar av etylacetat. isooktan, etanol, vatten. ättiksyra. kloroform. isopropanol och myrsyra företrädesvis med etylacetat-isooktan-etanol-ät- tíksyra-vatten (35:l0:3:0,l:0,l) eller med k1oroform-isopropa- nol-etanol-myrsyra (45:5:O,S:0,3) vol/vol. De respektive frak- tionerna kan sedan elueras ut med blandningar av kloroform och metanol företrädesvis i volymsförhållandet 1:1.

Separationen kan även ske på silikagelplattor (TLC) eller pelarkromatografi med samma eller modifierat lösningsmedels- system. Sådana fraktioner som kontraherar gerbil colon tages tillvara och förvaras vid -20°C för vidare analys. De kan an- vändas som medlet enligt uppfinningen företrädesvis efter in- dunstning till torrhet. De kan även renas vidare med kromato- grafi. varvid de först bör indunstas till torrhet. Därefter kan de renas genom kromatografi företrädesvis på silikagel 10 15 20 25 30 35 454 646 t.ex. med högtrycks~vätskekromatografi under eluering med blandningar av fosforsyra, acetonitril. metanol företrädevis fosforsyra-acetonitril-metanol 40:12:46.

Uppfinningen beskrives närmare med hjälp av de bifogade rit- ningarna av vilka: Fiq. 1 visar ett föredraget framställningsförfarande enligt exempel 1.

Pig. 2 visar U.V.-adsorptionen som funktion av elueringsvoly- men vid högtrycksvätskekromatografí av prostaglandinstandarder.

Fig. 3-S visar U.V.-adsorptionen som funktion av elueringsvo- lymen vid hög tryckvätskekromatografi av fraktionerna MÅ, u respektive M' från kromatografin på Silica Woelm DCC i 5 6 exempel 1.

Nedan återges exempel på en föredragen framställningsmetod enligt uppfinningen (se även översikt på fig. 1).

Exempel 1 Isolering Isolering av faktorn från körtlarna skedde på följande sätt: Cowper's körtel fripreparerades från nyligen avlidna fertila män. Preparaten fryses därefter omedelbart ned till -20°C.

Bartholini's körtlar isolerades från nyligen avlidna fertila kvinnor. Preparaten fryses omedelbart till -20°C.

Extraktion Lípidextrakt från körtlarna i exempel 1 extraherades enligt följande schema: 23,5 g av Cowper's körtlar och 16,1 g av Bartholini's körtlar finfördelades och homogeniserades var för sig med en Ultraturrax i 60 resp. 20 ml etylacetat/metanol 3:1 vol/vol. pH justerades med 0,1 H kaliumväteftalat till 4.5.

Lipídextraktet fick stå över natten i frys och vattenkristal- ler avlägsnades därefter medelst filtrering under 0°C. Provet 10 15 20 25 30 35 PÛÛR uUALlTY * 454 64-6 koncentrerades därefter genom indunstning under kväve i vat- tenbad (40°C). Man erhöll 0.43 g från Cowper's körtel och 0,15 g från Bartholini's körtel. Provet förvarades sedan under kvävgas vid -20°C.

Separation och rening Den biologiska faktorn separerades med hjälp av en modifierad metod för torrkolonnkromatografi som framgångsrikt skiljer upp de bioaktiva lipiderna från de övriga substanserna i extrak- tet. En kolonn bestående av 10 teflonringar. 2 cm höga och inre diameter 2.5 cm, tätt packad i ett rör användes. varje ring motsvarade en fraktion som sträcker sig mellan två på varandra följande decimaltals (Rf-)-värden. Kolonnen fylles under vibration med aktiverad Silica Woelm DCC (Silikagel erhàllen från Woelm, Västtyskland). Därefter anbringades de 0,43 resp 0,15 grammen pà var sin sådan kolonn och eluerades i lösningsmedelsblandningen kloroform/isopro- panol/etenol/myrsyra 45:5:0,5:0,3 vol/vol.

Lösningsmedels-tillförseln hölls konstant medelst utloppet från en separertratt 1-2 cm över provet. Lösningsmedelsfron- tens läge nära kolonnens botten angavs med en första akustisk varningssignal från en elektrisk avkännare. Slutpunkten angavs med en andra signal. Därefter avlägsnades ett skruvlock överst på röret så att den inre delade teflonkolonnen kunde skjutas uppåt med en kolv. Teflonringarna separerades lätt en och en med snabba skärande rörelser. Slutligen monterades varje ring i tio speciellt anordnade teflonkolonner för samtidig elue- ring. De erhållna fraktionerna eluerades med några ml kloro- form/metanol 1:1 vol/vol och den biologiska aktiviteten testa- des på gerbil colon. Fraktionerna 4, 5 och 6 - ringarna 4, 5 och 6 räknat uppifrån benämnes nedan alfa-4, alfa-5 och alfa-6 _ visade sig kontrahera gerbil colon och har de egenskaper. som redovisas i experiment 1-7. Detta gällde både de nämnda fraktionerna från både Cowper's och Bartholini's körtlar.

Fraktionerna indunstades till torrhet under kvävgas i vatten- bad (40°C) och renas eventuellt enligt nedan. 10 20 25 30 QUALITY 454 646 Högtrycks-vätskekromatografi QHPLC)-analys Fraktionerna alfa-4. alfa-5 och alfa-6, från respektive kört- lar underkastades en analys med högtrycks-vätskekronatografi s.k. HPLC. separationen skedde på högtrycks 5/um onvänd-fas- -kolonn. Ett system bestående av Consta Metric-III-HPLC-pump (Lab. Data Control) och Consta Metric Spectromonitor III (LDC) variabel våglängdsdetektor användes. Detektorn var kopplad till en rec-2-recorder (Pharmacia) och en integrator (HP 3885 A). Kolonnsystemet bestod av en 49 x 4,6 mm LD förkolonn, packad med 40/um partikelformad reverse phase material (Pelliguar LC-18) och en 250 x 4.6 LD, Supelcosil LC-18 analy- tisk kolonn packad med 5 um sfäriska partiklar. Pelliguar LC-18 och SupelcosilLC-18 är erhållna från Supelco, Bellefonte, Pennsylvania USA.

Prostaglandiner som eluerades från HPLC-systemet detek- terades genom adsorption i UV. Oderivatiserade prostag- landiner detekterades vid 199,5 nm. De till torrhet indunstade fraktionerna alfa-ll, alfa-S och alfa-ö från Cowper's resp. Bartholini's körtlar från torrkolonn-kromato- grafin löstes var och en i 2 ml absolut etanol. För var och en av dessa 2 ml uttogs 20 ul. Av Cowper's resp. Bartholini's / körtlar kördes vardera 5 sådana 20 ul prover på kolonnen för varje fraktion alfa-4, alfa-5 och alfa-6. En trekomponente- luent bestående av fosforsyra (0,1 M), acetonítril. metanol 40:12:48 användes för separation av fraktionerna på kolonnen.

Därefter togs systematiskt prover ut från kolonnen och analy- serades med avseende på kontraktion av gerbil colon. De frak- tioner med retentíonstider (RT) 3-6 och 12-15 från fraktion alfa-4, de med RT3-6 och 12-15 från alfa-5 och de med RT 8-10 från alfa-ö kontraherade gerbil colon. Detta gäller alfa-å. alfa-5 och alfa-6 från både Cowper's och Bartholini's körtlar.

Vid jämförelse med ett antal prostaglandinstandarder sásanPGE2, PGIZ och PGEl liksom PGFZQ och PGAZ, kunde inga av dessa prostag- landiner påvisas i blandningen (Jfr fig.2 som visar UV-adsorptionen vid 199,5 nm som funktion av elueringsvolumen och retentionstiden (RT) vid HPLC av nämnda standarder med figuerna 3, 4 och 5, som visar sanna kurva för fraktionerna m4, as, us från Silica Woelm DCC). Emellertid visade sig biologiska aktiviteten vara komplex när fraktioneringen med 10 15 20 25 30 35 454 646 HPLC företogs. Den huvudsakliga biologiska aktiviteten fanns i HPLC-subfraktioner alfa-4:12-15. alfa-5:12-15 och alfa-6:8-10.

Gaskromatografisk-masspektrometrisk analys Denna visar en komplex blandning där emellertid vissa fragment påvisades som talar för närvaro av neurotransmittor-1iknande substanser med molekylvikt mellan 200-1000 m/e (alfa-6:8-10).

NHR-analys NMR (nuclear magnetic resonance) användes för att undersöka fraktion alfa-5:12-15. en fraktion med stor biologisk aktivi- tet. som visade alla karakteristika för prostaglandinliknande substanser såsom: lång kedja, närvaro av fettsyror. terminal CH3-grupp.

Exempel 2 50 g av Cowper's körtlar från avlidna män homogeniserades med SO ml metanol i Utraturrax. pH justerades till 4.5 med 0.1 H kalíumvätefosfat. Extraktet fick stå över natt i frys, och vattenkristaller avlägsnades därefter genom filtrering under 0°C. Provet'koncentrerades därefter till torrhet genom in- dunstníng under kväve i vattenbad. Provet frystorkades.

Nedan återges nâgra experiment som belyser den biologiska effekten av faktorn enligt uppfinningen.

Experiment 1 Faktorns inverkan på muskel-kollagen-trabekelverket i corpora cavernosa hos människa och däggdjur (tjur): inverkan på penis- artärernas glatta muskulatur.

Erektionen av mannens och däggdjurens penis beror av en över- fyllnad av de erektiva vävnaderna i penis dvs. corpora caver- nosa (svällkropparna). Dessa innehåller en svampartad vävnad som består av bindvävsbalkar och glatta muskeltrådar vilka bildar ett utbrett fackverk det s.k. trabekula corpora caver- nosa. De hålrum som bildas kan snabbt vidgas resp. kontrahe- ras, dvs. tömmas och fyllas med blod. Det blir vid erektionen 10 15 20 25 30 35 454 646 -.;~.. en relaxation av den glatta muskulaturen 1 corpora cavernosa.

Därtill dilateras även de artärer som förser corpora cavernosa med blod dvs. penisartären. Upphörandet av erektionen och av- slappandet av penis sker på samma sätt genom en motsvarande kontraktíon av muskeltrådarna 1 corpora cavernosa och penisar- tären.

Preparering: Efter slakt av tjur avlägsnades hela penis och transporterades till laboratoriet i en buffertlösning (Krebs lösning) vid +4°C. På samma sätt togs delar av corpora caver- nosa från baggar. Longitudinella strips av ca 1.5 cm längd och 4 cm tjocklek skars ut från den mellersta delen av muskulatu- ren i trabekelverket. På samma sätt utskars en 1.5 cm lång och ca 3 mm tjock strip från penisartärens muskellager. Dissektio- nen var avslutad inom 1~Z timmar efter slakten av djuret.

Strips förvarades í Krebs-lösningen under max. 1 dygn och visade sig under denna tid icke förlorar något 1 aktivitet.

Bioanalys: Hedelst en Grass Force Deplacement Transducer kopp- lad till en Grass-polygraph kunde effekten av faktorn på de isolerade muskeltrådarna studeras. Som standard användes där- vid PGE2 och PGFZM. Genom att i bioassaysystemet undvika att spänna för mycket i fästanordningen kunde den spontana motiliteten i vävnaden behållas. Faktorn från Cowper's körtel pådroppades och därvid erhölls en klar relaxation av muskel- trabekelverket från penis. Samma reaktion, ehuru svagare erhölls med fraktionen från Bartholini's körtel. PGE2 i koncentrationen 50 ng/ml gav en mycket svag liknande effekt och PGF i en motsvarande koncentration gav istället en ZM ökad muskeltonus.

Faktorn från Cowper's körtel pådroppades penisartären upphängd i bioanalyssystemet på samma sätt. Därvid erhölls en klar relaxation av muskulaturen när faktorn pådroppades. PGF2N,50 ng/ml och PGE2 kontraktion av penisartären. Detta skulle definitivt innebära i samma koncentration gav däremot en kraftig att båda typerna av prostaglandiner närmast motverkar erektio~ nen medan lipidfraktionerna från körtlarna starkt befrämjar 10 15 20 25 30 35 454 646 1o denna.

Experiment 2 Faktorn från körtlarna kontraherar urethramuskulaturen hos man och handäggdjur. Urinröret (urethra) består av en slemhinneka- nal som mestadels är omgiven av ett muskellager med inte längsgående muskulatur och yttre tvârgående skikt. Detta är bäst utvecklat i bakre delen av urethra. I främre delen av urethra finns snedförlöpande muskelbuntar. Från urethra inom prostatasektionen erhölls efter operation av prostata från man en urethradel som frípreparerades och förvarades i Krebs buffert. Vid bioanalysförsöket anbringades de fripreparerade muskelremsorna i den tidigare beskrivna bioanalysenheten med stor känslighet. Till organbadet sattes en blandning av 02 (95 t) och C02 (5 t) vid 37°C. Faktorn från Cowper's körtel pådroppades. Därefter erhölls en uttalad kontraktion av urethramuskulaturen. Samma ehuru mindre uttalet erhölls med faktorn från Bartholini's körtel. Båda faktorerna var extrahe- rade från människas körtlar. Resultaten har sedan verifierats med urethra från tjur PGFZM kontraherade på samma sätt urethramuskulaturen medan PGE2 relaxerade denna. Kontraktio- nen av urethramuskulaturen efter exposition för faktorn måste befrämja ejakulationsprocessen. Metoden att mäta denna funk- tion är visserligen indirekt men några direkta metoder att studera detta på människa existerar för närvarande icke.

Experiment 3 Faktorn befrämjar spermiernas motilitet. Det är känt att prostaglandiner av E-typ icke har någon påverkan på spermier- nas rörlighet. Prostaglandin F N har eventuellt en retarde- 2 rande effekt på spermiemotiliteten. Vid våra försök med fak- torn studerdes spermiernas motílitet under mikroskop. Lipid- extraktet från Cowper's körtel resp. Bartholini's körtel upp- löstes i saline och tillsattes en lösning med aktiva spermier.

Det kunde visas att faktorn från Bartholini's körtel åstadkom en synnerligen aktiv potentiering av spermiernas rörelser.

Faktorn från Cowper gav samma effekt men betydligt mindre 10 15 20 25 30 35 454 646 11 uttalad 1 motsvarande koncentration. Saline var utan effekt.

Sperman hos människa, får. tjur tömmes efter ejakulationen i vagina och är sedan hänvisad till att nå ägget genom egen motilitet. Faktorn kan sålunda på goda grunder anses under- lätta spermiernas aktiva migration genom vagina och uterinka- viteten.

Experiment 4 Faktorn befrämjar spermiernas penetration genom färsk äggvita.

Ett hönsägg krossades och äggvitan placerades i ett objekt- glas. I äggvitan placerades därefter en kapillär varvid äggvi- tan sögs upp i denna. På två urglas placerades spermaprov, det ena tillsatt med faktorn och det andra utan faktorn. Faktorn från såväl Bartholini's körtel som från Covper's körtel från människa användes vid respektive delförsök. I spermaproven placerades rören med hönsäggvítan och fixerades med plastelli- na. Kapillärerna ställdes vertikalt och urglasen med anbringa- de kapillärer sattes därefter i värmeskåp. Hed tidsintervallen 60, 120 och 180 minuter studerades därefter spermiernas vandringsförmåga genom äggvitan under mikroskop. Det kunde klart visas att faktorn från Bartholíni's körtel signifikant ökade spermiernas penetrationsförmåga genom äggvitan och att även faktorn från Cowper hade en liknande ehuru svagare effekt.

För befruktningen är spermiernas förmåga att penetrera protei- net i äggcellerna av största betydelse.

Experiment 5 Faktorn koagulerar semen (sädesvätska). Fibrinolytiska enzymer i sädesvätskan orsakar en fullständig eller partiell líquefie- ring av koagulerad sperma. Det är känt att totalextrakt från Cowper's körtel från tjur och från galt koagulerar semen.

Funktionellt tycks detta medföra att semen av flytande form bildar en koagulationspropp som utgör ett viktigt led i ejaku- lationen. Det hindrar även reflux av semen under ejakulations- fasen och befrämjar sålunda fertiliteten hos djur..särskilt framträdande hos galt. ø~nnas 10 15 20 25 30 35 454 646 12 Faktorns förmåga att koagulera sperma visades på följande sätt: 0.5 ml liquefierad sperma bringades (i lättflytande tillstånd) 1 ett provrör vid 37°C. 0.5 ml av faktorn (frân Cowper's körtel) upplöstes i saline och tillsattes den flytan- de sperman. Det visade sig att man snabbt erhöll en koagula- tion av sperman till ett fast koagel. Efter ca 10 minuter övergick denna åter till liguefierad form. Tillsats av faktorn från Bartho1ini's körtel gav en liknande ehuru svagare koagu- lation.

Experiment 6 Faktorn kontraherar glatt muskulatur i kvinnans uterotubalfog (UTJ). Om faktorn applicerades på glatt muskulatur från UTJ erhölls ett sammansatt svar. Förklaringen är att kvinnans uterotubalfog innehåller tre olika muskellager vilka ger specifika svar på lipidmediatorer inom prostaglandinfaniljen.

Muskelvävnad från UTJ från friska fertila kvinnor. som genom- gått steriloperation eller hysterectomia isolerades. Cirkulära resp. longitudinella muskeltrådar apterades i bioanalysenheten med Krebs bikarbonatbuffert. En blandning av syre och koldi- oxid tillsattes som vanligt och försöken gjordes vid 37°C.

Faktorn visade sig åstadkomma en kontraktion av den longitudi- nella muskulaturen och en relaxation av den cirkulära.

Experiment 7 Faktorn kontraherar vaginalmuskulatur. I bioanalysenheten anbringades glatt muskulatur isolerad från vaginalväggen från ko. Faktorn från Cowper's körtel från tjur åstadkom en klar kontraktíon av muskelremsor. Det är välkänt att vid erektionen dilateras penísartärerna, mera blod tillföres svällkropparna (corpora cavernosa), som fylles upp varvid erektionen uppkom- Illel' . vid ejakulationen drages muskulaturen omkring urethra sig sam- man i ett antal autonoma kontraktioner och tvingar ut sädes- vätskan ur penis med högt tryck. Spermierna i ejakulatet placeras i vagina och föres genom aktiva rörelser eller passiv migration till uterinkaviteten där spermien vandrar vidare och 10 15 20 25 30 35 454 646 -uouoo 13 när ägget som penetreras.

Experiment 8 Erektionstest Apor (markattor) 3-4 år gamla. vikt 4.5 - 5,0 kg sövdes med Ketalar 1.8 ml + eventuellt ytterligare 0,5 ml. Penis hölls retraherad med en elongerad sugapparat.

Nedanstående substanser injicerades med en spruta 26 G spets genom tunica albuginea i corp cavarnosum (glatt muskulatur) varvid injektionslösningen hade en temp av 30°C. 1. 2. lade erektion, 0.5 ml fysiol NaCl, som inte gav någon reaktion. 0,5 ml (15 mg) papaverin, som efter nâgra minuter framkal- som kvarstår l-2 timmar. 3. 0.5 ml (2 mg) fenoxibensamin. som ger samma reaktion som papaverin. eventuellt något längre. 4. Frystorkad substans erhållen i exempel 2 upplöstes i 0.5 ml fysiologískt koksalt efter avblåsning i kväve. Tre apor under- söktes.

Erektion konstaterades och varade 2-4 timmar hos två djur och upp till 24 timmar hos ett djur. vi har kunnat visa att faktorn från körtlarna hos människa och däggdjur (Cowper, Bartholini) synes klart kunna befrämja såväl erektion som ejaculation och befruktning av ägget genom att: dilatera den glatta muskulaturen i corpora cavernosa i penis dilatera penisartärens muskulatur kontrahera urethramuskulaturen kontrahera vaginalmuskulaturen kontraher de longitudinella stråken av uterotubalfogen (livmoder-äggledarövergângen) potientiera spermiernas aktiva rörelser öka spermiernas förmåga att penetrera äggvita koagulera semen. 10 15 20 25 30 454 646 14 Detta tillsammans med det kända faktum att extrakt från kört- larna verkar lubricerande på urogenitalslemhinnor. indikerar att faktorn har betydelse för att befrämja erektionen. ejaku- lationen och spermiernas rörelser och penetrationsförmåga.

Faktorn är sålunda användbar som fertilitetsbefrämjande medel.

Hur faktorn utövar sin påverkan i en in vivo situation kan belysas med utgångspunkt från våra pionjårarbeten med elek- tronmikroskopiska studier på körtlarna. främst Cowper's körtel (L. Hellgren, E. Mylius och J. Vincent. The ultrastructure of the human bulbo-urethral gland. J. Submicrose. Cytol., l14(4), 683-689. 1982). Faktorn kan tänkas antingen ha en direkt eller indirekt verkan. eller kombination av båda. Den direkta effek- ten kan tänkas verka på spermierna enligt experiment 1-7. Den indirekta (“hormonella“) effekten av faktorn på penisartår-, vaginal-. urethral- och äggledarmuskulaturen kan ske genom blodcirkulationen. Att det förhåller sig så stödjes av våra elektronmikroskopiska fynd av sekretoriska granula i Cowper's och Bartholini's körtlar ligger 1 körtelblodkärlen varvid in- nehållet i granula förmodligen tömmes direkt i cirkulationen.

Faktorn kan användas som fertilitets- och erektionsbefrämjande medel. Dessa medel kan utgöras av sådana lipidfraktioner från Cowper's eller Bartholini's körtlar, som kontraherar gerbil colon t.ex. det första orenade totala lipidextraktet och isyn- nerhet de aktiva fraktioner, som elueras vid torrkolonnkroma- tografín eller högtrycksvätskekromatografin i exempel 1. Med- len kan även föreligga i kompositioner tillsammans med vanliga utdrygningsmedel. Kompositionerna kan vara injicerbara väts- kor, (sprayer), tabletter, suspensioner. lösningar, sirapar, suppositorier och kapslar. Företrädesvis indunstas provlös- ningarna till torrhet och upplöses i fysiologiskt koksalt och injiceras.

Claims (5)

10 15 20 25 30 “HPOOR QUALITY 454 646 15 PATENTKRAV

1. l. Erektions- och fertilitetsbefrämjande medel, k ä n n e t e c k n a t därav, att det framställts fràn Cowper's- och/eller Bartholini's körtlar från däggdjur inbegripet människan genom att körtlarna finfördelats och extraherats, efter det att de först eventuellt befriats från proteiner, med lipidlösande medel vid surt pH, varefter vattnet avlägsnats, lös- ningsmedlet avdunstats och återstoden kromatografiskt fraktionerats på känt sätt, och att de fraktioner som konstaterats kontrahera gerbil colon tillvaratagits och eventuellt ytterligare renats genom kromatogra- fiska metoder, varvid de tillvaratagna fraktionerna utgör det erektions- och fertilitetsbefrämjande medlet, eventuellt tillsammans med vanliga utdrygningsmedel.

2. Sätt att framställa erektions- och fertilitets- befrämjande medel från Cowper's- och/eller Bartholini's körtlar fràn däggdjur inbegripet människan, k ä n n e - t e c k n a t därav, att körtlarna finfördelas och extraheras, efter det att de först eventuellt befriats fràn proteiner, med lipidlösande medel vid surt pH, varefter vattnet avlägsnas, lösningsmedlet avdunstas och återstoden kromatografiskt fraktioneras pá känt sätt, varefter de fraktioner som konstateras kontrahera gerbil colon tillvaratages och eventuellt ytterligare renas genom kromatografiska metoder.

3. Sätt enligt kravet 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att extraktionen med lipidlösande medel utföres med etylacetat, isopropanol, metanol, aceton, aceton-vat- tenblandningar, kloroform eller blandningar därav.

4. Sätt enligt kravet 2, k ä n e t e c k n a t där- av, att den kromatografiska fraktioneringen utföres på silikagel med användning av etylacetat, isooktan, etanol, ättiksyra och vatten,i volymförhållandet 35:10:3:0,l:0,l, eller kloroform, isopropanol, eta- 454 646 16 nol och myrsyra, i volymförhàllandet 45:5:0,5:0,3, såsom elueringsmedel.

5. Sätt enligt kravet 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att den ytterligare reningen utföres šenom högtrycksvätskekromatografi (HPLC) med en blandning av fosforsyra, acetonitril och metanol, i volymför~ hållandet 40:12:48, såsom elueringsmedel.