FI80593B - Foerfarande foer framstaellning av ett preparat foer begraemjande av erektion och fertilitet. - Google Patents

Description

1 80593

Menetelmä erektiota ja fertiliteettiä edistävän valmisteen valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää mainitun aineen 5 tuottamiseksi, jota on eristetty miesten ja urosnisäkkäi-den Cowperin rauhasista ja vastaavista elimistä; naisten ja naarasnisäkkäiden suurista eteisrauhasista, Bartholi-nin rauhasista, joista tästedes käytetään nimitystä rauhaset .

10 Rauhasista saatavilla lipidiuutteilla on havaittu olevan ominaisuuksia, jotka antavat aiheen hyvin perustellusti odottaa, että nämä aineet edistävät erektiota, ejakulaatiota, itiöiden liikkuvuutta ja niiden kykyä tunkeutua proteiiniin ja naaraiden suvunjatkamiselimiin. Tä-15 mä aine voi siten olla aktiivisena aineosana tällä indikaatiolla käytettävissä farmaseuttisissa koostumuksissa.

Miesten ja urosnisäkkäiden rauhasia kutsutaan Cowperin rauhasiksi (myös bulbo-uretaalisiksi rauhasiksi), ne koostuvat symmetrisestä parista rakkulakoostumusrauha-20 siä, joilla on mainittu konsistenssi ja jotka ovat harmahtavan keltaisia tai hieman ruskeita väriltään ja tavallisen herneen tai salkopavun kokoisia. Niiden eritys-kanava on pituudeltaan korkeintaan 4 cm ja avautuu virtsaputkeen välittömästi sen kohdan lähellä, jossa virtsa-25 putki avautuu peniksen paisuvaiseen.

Naisten ja naarasnisäkkäiden vastaavia rauhasia kutsutaan Bartholinin rauhasiksi ja ne koostuvat kahdesta harmahtavan keltaisesta, pyöreästä tai soikeasta rauhasesta, joka on tavallisen herneen tai salkopavun kokoinen 30 ja sijaitsevat emättimen suuaukon selänpuoleisella sivulla. Erityskanava on 1,5 - 2 cm:n pituinen ja avautuu emättimen aukkoon. Ne vastaavat suoraan urosten Cowperin rauhasia. Näiden rauhasten funktiota ei täysin tunneta. Urosten Cowperin rauhasista tiedetään, että rauhasten 35 eritteen kokonaisuute koaguloi siemennestettä. Tällöin muodostuu limahyytymä, joka estää siemennesteen takaisin- 2 80593 virtauksen ejakulaation jälkeen. R.G. Hart, The mechanism of Cowper’s secretion in coagulating cat semen, J. Rep-rod. Fert. 17 (1968) 223-226. J.J. Gueze ja J.W. Slot, Synthesis and secretion of glycoproteins in rat bulbo-5 urethal (Cowper's) glands, Biology of reproduction 15 (1976) 118-125.

Näistä rauhasista peräisin olevien lipidifraktioi-den biologista vaikutusta ei ole aiemmin tutkittu. Siten tällä keksinnöllä, joka koskee lipidifraktioiden potens-10 sivaikutusta urogeenitaalialueen eri osiin, on suuri merkitys näiden rauhasten toiminnan määrittämiselle. Miehiltä ja naisilta, häriltä, karjuilta, pässeiltä, lampailta ja lehmiltä otetuista näistä rauhasista saatuja lipidi-fraktioita on tutkittu ja niillä on farmakologissa ko-15 keissa havaittu olevan suurin piirtein samanlaiset ominaisuudet kuin edellä esitettiin.

Tämän keksinnön tekijät ovat nyt yllättävästi löytäneet edellä mainituista lajeista peräisin olevien rauhasten lipidifraktiosta tekijän, joka näyttää vaikuttavan 20 sekä erektioon että ejakulaatioon samoin kuin itiöiden liikkuvuuteen ja niiden kykyyn tunkeutua proteiiniin ihmisissä ja eläimissä. Tämä tekijä näyttäisi olevan tehokas peptidilipidivälittäjäaine, joka on prostaglandii-nin/leukotrieenin kaltaista tyyppiä.

25 Tämä keksintö koskee menetelmää valmisteen valmis tamiseksi, joka koostuu ihmisten ja eläinten rauhasista saaduista lipidifraktioista, kuten hyppyrotan paksusuolta supistavista fraktioista. Prostaglandiinit ja niiden kanssa samankaltaiset aineet supistavat hyppyrotan paksu-30 suolta ja siitä syystä hyppyrotan paksusuolen supistumista käytetään tällaisten aineiden biologisen aktiivisuuden arvosteluperusteena. Tähän liittyvä testi tehdään seuraavasti: Hyppyrotalta poistetun paksusuolen ylempi osa ripustetaan tavanomaiseen suolihauteeseen siten, että alem-35 pi kiinnitys on kiinteä kun taas ylempi kiinnityskohta on kytketty tuntoelimeen, joka rekisteröi suolen supistumi- 3 80593 sen ja relaksaation erilaisten aineiden vaikutuksen alaisena.

Koska nämä aineet supistavat hyppyrotan paksusuolta, on olemassa hyvät perusteet otaksua, että ne sisältä-5 vät prostaglandiinin kaltaisia aineita. Rauhasista saatujen niiden lipidifraktioiden, jotka supistavat hyppyrotan paksusuolta ja ovat keksinnön mukaisia aineita, ei ole kuitenkaan osoitettu sisältävän mitään tunnettuja prostaglandiineja (vrt. esimerkki ja kuviot 2, 3, 4 ja 5, 10 joista havaitaan, että ei ole ollut mahdollista osoittaa prostaglandiineja PGI2, PGE2, PGE2, PGF2a ja PGA2 rauhasista saaduissa hyppyrotan paksusuolta supistavissa lipidi-fraktioissa tunnettuja menetelmiä käyttämällä). Hyppyrotan paksusuolen supistuksia voidaan siten käyttää arvos-15 teluperusteena sille, että keksinnön mukaista tekijää, jolla on hedelmällisyyttä edistäviä ominaisuuksia, on läsnä rauhasista saadussa lipidiuutteessa.

Tekijä reagoi positiivisesti ninhydriinin kanssa, mikä osoittaa sen sisältävän aminoryhmiä. Kokeet, joissa 20 käytettiin dispersiivistä röntgenanalyysiä (KEVEX), osoittavat rikin (S) läsnäolon tekijässä. Nämä kaksi seikkaa - positiivinen ninhydriinireaktio ja rikin läsnäolo - viittaavat siihen, että tämän tekijän ja leukotri-eenien välillä on yhtäläisyyksiä. Leukotrieenit eivät 25 kuitenkaan supista hyppyrotan paksusuolta. Toisaalta ne supistavat voimakkaasti kohdun lihaksistoa, kuten myös keksinnön mukainen aine.

Kaasukromatografia-massaspektrometria-analyysi osoittaa monimutkaisen seoksen, jossa tietyt fragmentit 30 kuitenkin viittaavat hermojen välittäjäaineiden kaltai siin aineisiin, joiden molekyylipaino on 200 - 1 000 m/e.

Fraktion, jolla on korkea biologinen aktiivisuus, NMR (ydinmagneettinen resonanssi) on osoittanut kaikki prostaglandiinin kaltaisten aineiden ominaispiirteet, ku-35 ten pitkä molekyyliketju, rasvahappojen läsnäolo ja terminaalinen -CHj-ryhmä.

4 80593

Keksinnön mukaiseen menetelmään sisältyy pros-taglandiinien uuttaminen ja erottaminen tavanomaisin menetelmin. Niinpä rauhasista voidaan ensin poistaa proteiinit, ts. tehdä etanoliuutto ja jäännös voidaan sitten 5 uuttaa happamassa pH:ssa dietyylieetterillä, joka liuottaa lipidit. Rauhaset voidaan uuttaa myös suoraan happa-missa olosuhteissa yhden tai useamman kerran liuottimel-la, erityisesti lipidiliuottimella, kuten etyyliasetaatilla, isopropanolilla, metanolilla, asetonilla, kloro-10 formilla tai niiden seoksella, kuten kloroformin ja meta-nolin seoksella tilavuussuhteessa 2:1 ja etyyliasetaatin seoksella isopropanolin, metanolin tai asetonin, joka sisältää vaihtelevan tilavuusosuuden vettä tai edellä mainittujen lipidiliuottimien kanssa, edullisesti metanolil-15 la tai etyyliasetaatin ja metanolin seoksella tilavuus-suhteessa 3:1 ja säätää pH puskurin avulla arvoon 3,5 -5, edullisesti 4,5, 0,1 M KH-ftalaatilla. Sitten poistetaan vesi tavanomaisesti, esimerkiksi kylmäkuivauksel-la. Uutteen voidaan myös antaa seistä yön yli pakastimes-20 sa lämpötilassa alle 0°C ja poistaa muodostuneet jääki-teet suodattamalla matalassa lämpötilassa, alle 0°C:ssa. Työ on edullista tehdä typpiatmosfäärissä tuotteen suojaamiseksi ilman hapen hapetusvaikutuksilta. Sitten näyte mahdollisesti haihdutetaan vesihauteessa (40°C), edulli-25 sesti typpiatmosfäärissä. Tätä näytettä voidaan käyttää keksinnön mukaisena erektiota edistävänä aineena. Näyte liuotetaan mahdollisesti muutamaan millilitraan edellä mainittua lipidiliuotinta, edullisesti etyyliasetaattiin ja säilytetään typpiatmosfäärissä -20°C:ssa.

30 Näyte voidaan sitten käsitellä tunnetuin menetel min, jotka ovat tavanomaisia prostaglandiinien erottamisessa ja ottaa talteen fraktiot, jotka supistavat hyppy-rotan paksusuolta. Erottaminen voidaan tehdä kromatogra-fisesti, esimerkiksi silikageelillä, edullisesti nk. kui-35 vapylväskromatografiällä käyttäen eluenttina etyyliase- 5 80593 taatin, iso-oktaanin, etanolin, veden, etikkahapon, kloroformin, isopropanolin ja muurahaishapon seoksia, edullisesti etyyliasetaatti-iso-oktaani)etanoli-etikkahappo-vesiseosta (tilavuussuhteessa 35:10:3:0,1:0,1) tai kloro-5 formi-isopropanoli-etanolimuurahaishapposeosta (tilavuus- suhteessa 45:5:0,5:0,3). Asiaankuuluvat fraktiot voidaan sitten eluoida ulos kloroformin ja metanolin seoksella, edullisesti tilavuussuhteessa 1:1.

Fraktiot voidaan erottaa silikageelilevyillä (TLC) 10 tai pylväskromatografisesti samalla tai muunnetulla liuo- tinsysteemillä. Fraktiot, jotka supistavat hyppyrotan paksusuolta, otetaan talteen ja säilytetään -20°C:ssa jatkoanalyysejä varten. Näitä fraktioita voidaan käyttää keksinnön mukaisena aineena, edullisesti kuiviinhaihdu-15 tuksen jälkeen. Ne voidaan myös puhdistaa edelleen kroma-tografisesti, edullisesti haihdutettuina ensin kuiviin. Fraktiot voidaan sitten puhdistaa kromatografisesti, edullisesti silikageelillä, esimerkiksi suurpaineneste-kromatografiällä, käyttäen eluenttina fosforihapon, ase-20 tonitriilin ja metanolin seoksia, edullisesti fosforihap-po-asetonitriili-metanoliseosta suhteessa 40:12:48.

Keksintöä kuvataan nyt tarkemmin viitaten liitteenä oleviin piirroksiin, joissa kuvio 1 valaisee edullista menetelmää esimerkin 1 25 mukaisen aineen tuottamiseksi; kuvio 2 valaisee prostaglandiinistandardien UV-ad-sorptiota eluutiotilavuuden funktiona suurpainenestekro-matografiässä; kuviot 3-5 valaisevat fraktioiden α4, a5 ja vas-30 taavasti a6, jotka on saatu esimerkissä 1 Silica Noelin DCC:llä tehdyssä kromatografiässä, UV-adsorptiota eluutiotilavuuden funktiona suurpainenestekromatografiässä.

Seuraavassa annetaan esimerkkejä keksinnön mukaisesta edullisesta valmistusmenetelmästä (viittaamme myös 35 kuvion 1 katsaukseen).

6 80593

Esimerkki 1

Tekijä eristetään rauhasista seuraavasti: Cowperin rauhaset poistetaan fertiileiltä uroksilta, jotka ovat juuri kuolleet. Preparaatti jäädytetään sitten välittö-5 mästi lämpötilaan -20°C. Bartholinin rauhaset poistetaan juuri kuolleilta fertiileiltä naarailta ja saadut preparaatit jäädytetään välittömästi -20°C:seen.

Lipidiuute saatiin esimerkin 1 mukaisista rauhasista seuraavalla menetelmällä: 23,5 g Cowperin rauhasia 10 ja 16,1 g Bartholinin rauhasia hienonnettiin pieniin osiin ja homogenoitiin kumpikin erikseen Ultraturrax-laitteella 60 ml:ssa ja vastaavasti 20 ml:ssa etyyliasetaatin ja metanolin seosta (tilavuussuhde 3:1). pH säädettiin 0,1 M kaliumvetyftalaatilla arvoon 4,5.

15 Lipidiuutteen annettiin seistä yön yli pakastimes sa ja poistettiin sen jälkeen vesikiteet suodattamalla lämpötilassa alle 0°C. Näyte väkevöitiin sitten haihduttamalla vesihauteessa (40°C) typpiatmosfäärissä. Täten saatiin Cowperin rauhasista 0,43 g ja Bartholinin rauha-20 sista 0,15 g tuotetta. Näyte säilytettiin sitten lämpötilassa -20°C typpiatmosfäärissä.

Biologinen tekijä erotettiin muunnetun kuivapyl-väskromatografiamenetelmän avulla, joka menestyksellisesti erottaa biologisesti aktiiviset lipidit uutteen muista 25 aineista. Käytettiin kolonnia, joka koostui 10 (kymmenestä) teflonrenkaasta, joiden korkeus oli 2 cm ja sisäläpi-mitta 2,5 cm ja jotka oli pakattu tiiviisti putkeen. Kukin rengas vastasi fraktiota, joka kattoi Rf-arvon kahden peräkkäisen desimaalin välisen alueen. Kolonni täytettiin 30 aktivoidulla Silica Woelm DCC:llä täristäen. Kumpikin mainituista 0,43 ja 0,15 g:n näytteistä laitettiin erikseen yhteen tällaiseen kolonniin ja eluoitiin liuotin-seoksella kloroformi-isopropanoli-etanoli-muurahaishappo (tilavuussuhde 45:5:0,5:0,3).

35 Liuotinsyöttö pidettiin vakiona 1-2 cm näytteen 7 80593 yläpuolelle sijoitetun erotussuppilon suuaukon avulla. Liuotinrintaman tulo kolonnin pohjan kohdalle osoitettiin sähköisellä tuntoelimellä tuotetulla akustisella varoitussignaalilla. Loppupiste osoitettiin toisella signaa-5 lilla. Sitten poistettiin putken yläpäässä oleva kierre-korkki, niin että sisällä oleva osista koostuva teflonko-lonni voitiin työntää akselin suuntaisesti ylöspäin männän avulla. Teflonrenkaat oli helppo irrottaa toisistaan yksi kerrallaan nopein leikkausliikkein. Lopuksi renkaat 10 sijoitettiin 10 teflonkolonniin, jotka oli järjestetty varta vasten samanaikaista eluointia varten. Tuloksena olevat fraktiot eluoitiin muutamalla ml:11a kloroformi-metanoliseosta (tilavuussuhde 1:1) ja biologinen aktiivisuus testattiin hyppyrotan paksusuolella. Fraktioiden 4, 15 5 ja 6 - renkaista 4, 5 ja 6 ylhäältäpäin laskettuna käy tetään tästedes nimityksiä alfa-4, alfa-5 ja alfa-6 - havaittiin supistavan hyppyrotan paksusuolta ja niillä oli kokeissa 1-7 esitetyt ominaisuudet. Tämä päti kumpaankin edellä mainituista fraktioista sekä Cowperin että Bastho-20 linin rauhasista saatuun. Fraktio haihdutettiin kuiviin typpiatmosfäärissä vesihauteessa (40°C) ja puhdistettiin seuraavasti, vaikkakin tämä puhdistusvaihe on valinnanvarainen.

Suurpainenestekromatografia-(HPLC)-analyysi 25 Asianmukaisista rauhasista eristetyt fraktiot al fa-4, alfa-5 ja alfa-6 analysoitiin suurpainenestekroma-tografialla, josta käytetään lyhennettä HPLC. Erotus tehtiin 5 pm:n RP-HPLC-kolonnilla. Käytettiin järjestelmää, joka koostui Consta Metric-lll-HPLC-pumpusta (Lab. Data 30 Control) ja vaihtelevalla aallonpituudella toimivasta detektorista Consta Metric Spectromonitos III (LDC). Detektori kytkettiin REC-2-rekisteröintilaitteeseen (Pharmacia) ja integraattoriin (HP 3888 A). Kolonnijärjestelmä koostui esikolonnista 49 x 4,6 mm LD, joka oli täytetty 35 40 pm:n käänteisfaasimateriaalilla (Pelliguar LC-18) ja e 80593 analyyttisestä kolonnista 250 x 4,6 DL, Supelcosil LC-18, joka oli täytetty 5 pm:n pallomaisilla hiukkasilla.

HPLC-järjestelmästä eluoituneet prostaglandiinit detektoitiin UV-alueella tapahtuvan adsorption avulla.

5 Prostaglandiinit, joista ei ollut muodostunut johdoksia, detektoitiin allonpituudella 199,5 nm. Kuivapylväskroma-tografiässä saadut, Cowperin ja vastaavasti Bartholinin rauhasista peräisin olevat, kuiviin haihdutetut fraktiot alfa-4, alfa-5 ja alfa-6 liuotettiin kukin 2 ml:aan abso-10 luuttista etanolia. Kustakin näistä 2 ml:n näytteistä otettiin 20 μ1:η annoksia. Cowperin ja Bartholinin rauhasista saaduista fraktioista alfa-4, alfa-5 ja alfa-6 käsiteltiin kustakin viisi tällaista 20 pl:n näytettä kolonnissa. Fraktioiden erottamiseen kolonnilla käytettiin 15 kolmikomponenttista eluenttia, joka sisälsi fosforihappoa (0,1 M), asetonitriiliä ja metanolia suhteessa 40:12:48. Näytteet otettiin sitten systemaattisesti kolonnista ja niistä analysoitiin hyppyrotan paksusuolen supistaminen. Fraktiosta alfa-4 saadut fraktioiden, joiden retentioajat 20 (RT) olivat 3-6 ja 12-15, alfa-5:n fraktioiden, joiden retentioajat olivat 3-6 ja 12-15 ja alfa-6:n fraktioiden, joiden retentioajat olivat 8-10, havaittiin supistavan hyppyrotan paksusuolta. Tämä pätee sekä Cowperin että Bartholinin rauhasten fraktioihin alfa-4, alfa-5 ja alfa-25 6.

Verrattaessa joukkoon prostaglandiinistandardeja, kuten PGE2, PGI2 ja PGE2 ja myös PGF2 ja PGA2, ei seoksessa ollut havaittavissa mitään näistä prostaglandiineista (vrt. kuviota 2, joka valaisee UV-adsorptiota aallonpi-30 tuudella 199,5 nm mainittujen standardien eluutiotilavuu- den ja retentioajan funktiona HPLC:ssä, kuvioihin 3, 4 ja 5, jotka valaisevat samaa käyrää kuivapylväskromatogra-fiässä saaduille fraktioille aK, a5 ja a6). Biologisen aktiivisuuden havaittiin kuitenkin olevan monimutkainen, 35 kun fraktiointi tehtiin HPLC:llä. Pääasiallinen biologi- 9 80593 nen aktiivisuus havaittiin HPLC-fraktioissa alfa-4:12-15, alfa-5:12-15 ja alfa-6:8-10.

Kaasukromatografia-massaspektrometria-analyysillä saatiin tulokseksi monimutkainen seos, jossa kuitenkin 5 havaittiin tiettyjä fragmentteja, jotka viittasivat hermojen välittäjäaineiden kaltaisten aineiden, joiden mole-kyylipaino on 200 - 1 000 m/c (alfa-6:8-10), läsnäoloon.

NMR-analyysiä (ydinmagneettista resonanssia) käytettiin fraktion alfa-5:12-15, jolla oli korkea biologi-10 nen aktiivisuus, tutkimiseen - sillä oli kaikki pros- taglandiinien kaltaisten aineiden ominaispiirteet, kuten pitkä ketju, rasvahappojen läsnäolo ja terminaalinen CH3-ryhmä.

Esimerkki 2 15 Kuolleilta miehiltä otetut Cowperin rauhaset (50 g) homogenoitiin 50 ml:n kanssa metanolia Ultratur-rax-laitteessa. pH säädettiin arvoon 4,5 0,1 M kaliumve-tyfosfaatilla. Uutteen annettiin seistä yön yli pakastimessa, minkä jälkeen jääkiteet poistettiin suodattamalla 20 lämpötilassa alle 0°C. Näyte väkevöitiin sitten haihduttamalla se kuiviin vesihauteessa typpiatmosfäärissä.

Seuraavassa esitetään joukko kokeita, jotka valaisevat keksinnön mukaisen tekijän biologista vaikutusta.

Koe 1 25 Tekijän vaikutus ihmisten ja nisäkkäiden (härkä) paisuvaisen lihaskollageeniansaisiin ja vaikutus peniksen valtimoiden sileään lihakseen.

Miehen ja koirasnisäkkäiden erektio aiheutuu peniksen jäykistyvien kudosten, ts. paisuvaisten (corpora 30 cavernosa) ylitäyttymisestä. Nämä sisältävät sienimäistä kudosta, joka koostuu kollageenikudoskimpuista ja sileis-tä lihaskuiduista, jotka muodostavat laajan verkoston, nk. paisuvaisten ansaat. Muodostuneet ontelot voivat laajentua ja supistua, ts. täyttyä verellä ja tyhjentyä sii-35 tä, nopeasti. Erektion yhteydessä paisuvaisten sileä li- 10 80593 haksisto relaksoituu. Lisäksi valtimot, jotka syöttävät verta paisuvaisiin, ts. penisvaltimot, laajentuvat. Peniksen erektio päättyy, ts. penis relaksoituu samalla tavalla, paisuvaisten lihaskuitujen ja penisvaltimoiden 5 vastaavan supistumisen seurauksena.

Joukko koiraseläimiä teurastettiin, kultakin irrotettiin koko penis ja kuljetettiin se laboratorioon puskuriliuoksessa (Krebsin liuos) lämpötilassa +4°C. Osia pässien paisuvaisista poistettiin samalla tavalla. Ansas-10 verkostossa olevan lihaksiston keskiosasta leikattiin pitkiä liuskoja, joiden pituus oli 1,5 cm ja leveys noin 4 cm. Samalla tavalla leikattiin penisvaltimon lihaksistosta liuska, jonka pituus oli 1,5 cm ja leveys noin 3 mm. Leikkely saatettiin loppuun 1-2 tunnin kuluessa eläi-15 men teurastuksesta. Liuskoja pidettiin Krebsin liuoksessa korkeintaan yksi vuorokausi eikä niissä ilmennyt tänä aikana aktiivisuuden heikkenemistä.

Tekijän vaikutusta eristettyihin lihassäikeisiin tutkittiin Grass Force Deplacement Transducer -laitteel-20 la, joka oli kytketty Grass-monikanavapiirturiin. Tässä kokeessa käytettiin standardeina PGE2 ja PGF2a. Välttämällä liiallista jännitystä biologiseen tutkimukseen käytetyn järjestelmän kiinnitysvälineissä voitiin säilyttää kudoksen spontaani liikkuvuus. Cowperin rauhasista peräi-25 sin olevaa tekijää tiputettiin eristetyille lihassäikeil-le, jolloin havaittiin selvä relaksaatio peniksen ansas-verkoston lihaksissa. Sama reaktio - vaikkakin heikompi -saatiin aikaan Bartholinin rauhasista peräisin olevalla fraktiolla. PGE2:lla pitoisuutena 50 ng/ml saatiin saman-30 lainen vaikutus, tosin äärimmäisen heikko, kun taas PFG2a samana pitoisuutena käytettynä sai aikaan kohonneen lihastonuksen .

Cowperin rauhasista saatua tekijää tiputettiin pe-nisvaltimolle, joka oli kiinnitetty biologiseen analyy-35 siin käytettyyn laitteistoon samalla tavalla kuin edellä 11 80593 mainitut lihassäikeet. Havaittiin lihaksiston selvä relaksaatio, kun tekijää tiputettiin penisvaltimolle. ^<^2^ pitoisuutena 50 ng/ml ja PGE2 samana pitoisuutena johtivat sitä vastoin penisvaltimon voimakkaaseen supistumiseen.

5 Tämä näyttää osoittavan selvästi, että käytetyt kaksi pros-taglandiinityyppiä toimivat pääasiallisesti erektion vastaisesti, kun taas rauhasista peräisin olevat lipidifrak-tiot edistävät voimakkaasti erektiota.

Koe 2 10 Rauhasista saatava tekijä supistaa miesten ja koi- rasnisäkkäiden virtsaputken lihaksistoa. Virtaputki koostuu limakalvokanavasta, josta suurimman osan sulkee sisäänsä lihaskerros, joka koostuu sisemmästä pituussuunnassa kulkevasta lihaksistosta ja ulommista poikittaissuuntaisis-15 ta kerroksista. Se on parhaiten kehittynyttä virtsaputken takaosassa. Virtsaputken etuosassa esiintyy vinosti kulkevia lihaskimppuja. Miesten sukuelinten eturauhasleikkausten yhteydessä poistetaan eturauhasvyöhykkeestä osa virtsaputkea, joka preparoidaan ja säilytetään Krebsin puskurissa. Biolo-20 gisessa kokeessa preparoidut lihasliuskat kiinnitettiin edellä kuvattuun bioanalyysilaitteistoon, joka oli äärimmäisen herkkä. Kudoshauteeseen lisättiin 02:n (95 %) ja CC^in (5 %) seosta lämpötilassa 3rC. Cowperin rauhasista saatua tekijää tiputettiin lihasliuskoille, jolloin havaittiin 25 virtsaputken lihaksiston huomattava supistuminen. Sama vaikutus, vaikkakin vähemmän voimakas, havaittiin Bartholinin rauhasista saadulla tekijällä. Kummatkin tekijät oli uutettu ihmisten rauhasista. Nämä tulokset on myöhemmin vahvistettu käyttämällä härän virtsaputkea; PGF2otjohti saman-30 laiseen virtsaputken lihaksiston supistumiseen, kun taas PGE2 relaksoi lihaksistoa. Mainitulla tekijällä käsitellyn virtsaputken lihaksiston supistumisen täytyy edistää eja-kulaatiotapahtumaa. On totta, että tämän toiminnan mittausmenetelmä on epäsuora, mutta tällä hetkellä ei ole olemassa 35 menetelmiä, joilla tätä funktiota voitaisiin mitata suorasti ihmisillä.

12 80S93

Koe 3

Tekijä edistää siittiöiden motiliteettia. On tunnettua, että E-tyypin Prostaglandiineilla ei ole vaikutusta siittiöiden liikkuvuuteen. Prostaglandiini F2Ä:lla on mah-5 dollisesti siittiöiden motiliteettia heikentävä vaikutus. Kokeissa, joita teimme tekijällä, siittiöiden motiliteettia tutkittiin mikroskoopin alla. Tässä yhteydessä liuotettiin Bartholinin ja vastaavasti Cowperin rauhaset fysiologiseen suolaliuokseen ja lisättiin liuokset aktiivisia siittiöitä 10 sisältävään liuokseen.

Voitiin osoittaa, että Bartholinin rauhasista peräisin oleva tekijä paransi erityisen voimakkaasti siittiöiden liikkuvuutta. Cowperin rauhasista saadulla tekijällä oli samanlainen, vaikkakin vähemmän voimakas, vaikutus samana 15 pitoisuutena käytettynä. Fysiologisella suolaliuoksella ei ollut vaikutusta. Ihmisten, lampaiden ja härkien siittiöt tyhjennetään ejakulaatiossa emättimeen ja ne pyrkivät kohti munasolua oman liikkumiskykynsä turvin. Siten on olemassa hyvät perusteet otaksua, että tekijä helpottaa siitiöiden 20 aktiivista vaeltamista emättimen ja kohtuontelon läpi.

Koe 4

Tekijä edistää siittiöiden tunkeutumista tuoreen munanvalkuaisen läpi. Kananmuna rikottiin ja munanvalkuaista laitettiin mikroskooppilevylle. Munanvalkuaiseen vietiin 25 sitten kapillaariputki ja munanvalkuaista imettiin putkeen. Kahdelle kellolasille laitettiin siittiönäytteet, joista toiseen oli lisätty tekijää ja toiseen ei. Sekä Bartholinin että Cowperin rauhasista saatua tekijää, jotka molemmat olivat ihmisperäisiä, käytettiin vastaavissa koemenette-30 lyissä. Munanvalkuaista sisältävät putket sijoitettiin siittiönäytteisiin ja kiinnitettiin plastisiinilla (muovailuvahalla) . Kapillaariputket sijoitettiin pystyyn ja kello-lasit, joille kapillaariputket oli sijoitettu, laitettiin sitten lämmityskammioon. Siittiöiden kykyä kulkea munanval-35 kuaisen läpi tutkittiin sitten mikroskoopin alla 60, 120 ja 180 minuutin kuluttua. Havaittiin selvästi, että 13 80593

Bartholinin rauhasista saatu tekijä paransi merkittävästi siittiöiden kykyä kulkea munanvalkuaisen läpi; Cowperin rauhasista saadulla tekijällä oli samanlainen, vaikkakin heikompi, vaikutus.

5 Siittiöiden kyvyllä tunkeutua munasolujen proteiinin läpi on mitä suurin merkitys hedelmöitymiselle.

Koe 5

Tekijä koaguloi siemennestettä (nestettä, johon siittiöt ovat suspendoituneina). Siemennesteessä olevat 10 fibrinolyyttiset entsyymit saavat aikaan koaguloituneiden siittiöiden täydellisen tai osittaisen hajoamisen. On tunnettua, että härkien ja pässien Cowperin rauhasten eritteen kokonaisuute koaguloi siemennestettä. Funtionaalisesti ilmaistuna siemennesteestä muodostuu hyytymä, mikä on tärkeä 15 piirre ejakulaatiotapahtumassa. Se myös estää siemennesteen takaisinvirtauksen ejakulaatiovaiheen aikana ja edistää eläinten fertilitettiä, erityisen huomattavasti pässeillä .

Tekijän kykyä koaguloida siittiöitä valaisee seuraa-20 va: 0,5 ml nestemuodossa (vapaasti virtaavassa tilassa) olevia siittiöitä laitettiin koeputkeen 37°C;ssa. 0,5 ml tekijää (Cowperin rauhasista) liuotettiin fysiologiseen suolaliuokseen ja lisättiin nestemäisiin siittiöihin. Siittiöiden havaittiin koaguloituvan nopeasti, jolloin muo-25 dostui kiinteä hyytymä. Tämän hyytymän havaittiin palaavan nestemuotoon noin 10 minuutin kuluttua. Bartholinin rauhasista saadun tekijän lisääminen sai aikaan samanlaisen, vaikkakin heikomman, koaguloitumisen.

Koe 6 30 Tekijä supistaa naisten munanjohdin-kohtuliitoskoh- dan (UTJ) sileää lihaksistoa. Kun tekijää laitetaan UTJ:n sileälle lihaksistolle, saadaan aikaan yhdistelmävaste. Tämä johtuu siitä, että naaraan kohtu-munatorviliitoskohta sisältää kolme erilaista lihaskerrosta, jotka reagoivat 35 spesifisesti prostaglandiiniryhmän lipidivälittäjäaineisiin. Lihaskudosta eristettiin UTJ:sta, joka otettiin terveiltä 14 80593 fertiileiltä naisilta, joille oli tehty sterilisaatio tai kohtuleikkaus. Rengas- ja pitkittäislihassäikeitä asetettiin biologiseen analyysiin käytettävään laitteistoon, joka sisälsi Krebsin bikarbonaattipuskuria. Normaalin käytän-5 non mukaisesti lisättiin hapen ja hiilidioksidin seosta ja testit tehtiin lämpötilassa 37°C. Tekijän havaittiin saavan aikaan pitkittäislihaksiston supistuminen ja rengasmaisen lihaksiston relaksaatio.

Koe 7 10 Tekijä supistaa emättimen lihaksistoa. Lehmien emät timen seinämistä eristettyä sileää lihaksistoa sijoitettiin bioanalyysiyksikköön. Häristä saatu Cowperin rauhasista peräisin oleva tekijä sai aikaan lihassuikaleiden merkittävän supistumisen. On hyvin tunnettua, että peniksen valti- 15 mot laajenevat erektiossa, verta tulee enemmän paisuvaiseen, joka täyttyy tämän seurauksena ja tapahtuu erektio Ejakulaatiossa virtsaputkea ympäröivä lihaksisto vetäytyy kokoon useiden autonomisten supistusten tapahtuessa ja ruiskuttaa siemennesteen peniksestä suurella pai- 20 neella. Ejakuloidussa siemennesteessä olevat siittiöt joutuvat emättimeen ja liikkuvat, joko aktiivisen liikkumisen tai passiivisen vaeltamisen kautta, kohtuonteloon, josta siittiöt vaeltavat edelleen ja saavuttavat munasolun, johon ne sitten tunkeutuvat.

25 Koe 3 - Erektiotesti

Apinat (marakatit), jotka olivat 3-4 vuoden ikäisiä ja painoivat 4,5 - 5,0 kg, nukutettiin antamalla ketalaria 1,8 ml + mahdollisesti vielä 0,5 ml. Kunkin apinan penis pidettiin paikallaan pitkän imulaitteen avulla.

30 Seuraavia aineita ruiskutettiin valkokalvon läpi paisuvaiseen (sileään lihaksistoon) ruiskulla (kärki 26 G); ruiskutettavan liuoksen lämpötila oli 30°C.

1. 0,5 ml fysiologista natriumkloridia (NaCl), joka ei saanut aikaan reaktiota; 35 2. 0,5 ml (15 mg) papaveriinia, joka edisti muutaman minuutin kuluessa erektiota; erektio kesti 1-2 tuntia; is 80S93 3. 0,5 ml (2 mg) fenoksibentsamiinia, joka sai aikaan samanlaisen, mahdollisesti pidempään kestävän reaktion kuin papaveriini; 4. esimerkissä 2 saatua kylmäkuivattua ainetta liuo-5 tettuna 0,5 ml:aan fysiologista NaCl typpipuhalluksen jälkeen. Testi tehtiin kolmella apinalla. Havaittiin erektio ja se kesti kahdella eläimellä 2-4 tuntia ja jopa 24 tuntia yhdellä eläimellä.

On ollut mahdollista osoittaa, että ihmisen ja ni-10 säkkäiden rauhasista (Cowperin ja Barthiolinin rauhasista) peräisin oleva tekijä edistää selvästi sekä erektiota ja ejakulaatiota ja hedelmöittää munasolun: laajentamalla peniksen paisuvaisen lihaksistoa; laajentamalla penisvaltimon lihaksistoa; 15 supistamalla virtsaputken lihaksistoa; supistamalla emättimen lihaksistoa; supistamalla kohtu-munatorviliitoskohdan pitkittäisiä lihas-kimppuja ; vahvistamalla siittiöiden aktiivista liikkuvuutta; 20 lisäämällä siittiöiden kykyä läpäistä albumiinia (proteiinia) ; ja koaguloimalla siemennestettä.

Yhdistettynä siihen tunnettuun tosiasiaan, että rau-hasuute voitelee urogenitaalisia limakalvoja, saadaan täten 25 osoitetuksi, että tällä tekijällä on todellista merkitystä erektion, ejakulaation ja siittiöiden liikkuvuuden sekä siittiöiden proteiininläpäisykyvyn edistämisessä. Tekijää voidaan siten käyttää fertilitettiä parantavana aineena.

Tapaa, jolla tämä tekijä saa aikaan vaikutuksensa 30 in vivo -tilanteessa, voidaan valaista lähtemällä uraauurtavasta työstämme rauhasten elektronimikroskooppitutkimus-ten alalla /L. Hellgren, E. Mylius ja J. Vincent, The ultra-structure of the human bulbo-urethral gland, J. Submicrose Cytol 14 nro 4 (1982) 683-689J. Tekijällä voi-35 daan ajatella olevan joko suora tai epäsuora vaikutus tai näiden kahden yhdistelmä. Suoran vaikutuksen voidaan 16 80593 ajatella kohdistuvan siittiöihin kokeiden 1-7 mukaisesti. Tekijän epäsuora (hormonaalinen) vaikutus penisvaltimon, emättimen, virtsaputken ja munanjohtimen lihaksistoon voidaan saavuttaa verenkierron kautta. Sitä, että näin on to-5 dennäköisesti asianlaita, tukevat elektronimikroskooppiha-vaintomme, joiden mukaan Cowperin ja Bartholinin rauhasten eritysjyväset sijaitsevat rauhasten verisuonissa, jolloin jyvästen sisältö lyhentyy todennäköisesti suoraan verenkiertoon.

10 Tekijää voidaan käyttää fertiliteettiä ja erektiota edistävänä aineena. Näitä aineita voivat olla sellaiset Cowperin ja Bartholinin rauhasista saatavat lipidifraktiot kuin ne, jotka supistavat hyppyrotan paksusuolta, esimerkiksi ensimmäinen epäpuhdas kokonaislipidiuute ja erityi-15 sesti aktiiviset fraktiot, jotka eluoituvat kuivapylväskro-matografiässä tai suurpainenestekromatografiässä esimerkissä 1. Aineet voivat esiintyä myös koostumuksissa yhdessä tavanomaisten jatkeaineiden kanssa. Koostumukset voivat olla ruiskeina annettavissa olevien nesteiden, suihkeiden, 20 tablettien, suspensioiden, liuosten, siirappien, peräpuikkojen ja kapselien muodossa. Näyteliuokset haihdutetaan edullisesti kuiviin, liuotetaan fysiologiseen keittosuola-liuokseen ja infektoidaan.

Claims (7)

1. Menetelmä erektiota ja fertiliteettiä edistävän valmisteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 5 se valmistetaan seuraavien vaiheiden mukaisesti ainakin yhdestä rauhasesta, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluu nisäkkäiden, ihmisten mukaanluettuna, Cowperin ja Bartho-linin rauhaset, a) rauhanen jauhetaan hienoksi, 10 b) hienoksi jauhettu rauhanen uutetaan happamessa pHrssa lipidiliuottimella, joka on etyyliasetaatti, meta-noli, vesi tai niiden seos, c) saadusta uutteesta poistetaan vesi, d) liuotin haihdutetaan pois uutteesta, 15 e) saatu jäännös fraktioidaan kromatografisesti ja f) valitaan ne fraktiot, jotka supistavat hyppyro-tan paksusuolta, jolloin valitut fraktiot sisältävät erektiota ja fertiliteettiä edistävän valmisteen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää lisävaiheen, jossa kohdassa a) saatu hienoksi jauhettu rauhanen vapautetaan proteiineista uuttamalla se etanolilla ennenkuin saatu jäännös uutetaan vaiheen b) mukaisesti.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää lisävaiheen, jossa vaiheessa f) valitut fraktiot puhdistetaan kromatografisesti .

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että kromatografiaprosessi suoritetaan silikageelillä, jolloin eluoidaan etanoli-, vesi-, kloroformi-, isopropanolimuurahaishapposeoksella.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seos on kloroformi, isopropa- 35 noli, etanoli ja muurahaishappo tilavuussuhteessa 45:5:0,5:0,3. 18 80593

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että jatkopuhdistuksen lisävaihe suoritetaan suurpainenestekromatografian avulla, jolloin eluoidaan fosforihapon, asetonitriilin ja metanolin seok- 5 silla.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fosforihapon, asetonitriilin ja metanolin tilavuussuhde on 40:12:48. i9 80593