SE419346B - Forfarande for stabilisering av bakteriologiska prover - Google Patents

Description

78021474: torier påvisas. I Försöken användes B. tuberculosis och det visade sig, att tuberkelbakterierna ej Förstördes i mjölk- prover, som blivit konserverade med 1-procentig borsyra, sam- tidigt som denna konservering gjorde det möjligt att transpor- tera proverna under lång tid utan att dessa undergick hâgra icke; önskade förändringar, som interfererade med examina- tionen i laboratoriet. 7 Möjligheten att underlätta det bakteriologiska labora- torieerbetet vid bakterieanalyser av urinprover med hjälp av borsyrakonservering hade ännu ej accepterats vid slutet av 1920-talet. Vikten av att omedelbart bakteriologiskt examinera urinprover vid suspekta urinvâgsinfektioner För att i möjligaste mån undvika överväxt av bakteriestammar har understrukits utomordentligt starkt trots att borsyra kan användas preana- lytiskt utan att störa mätningar av andra parametrar. Möj- ligheten att använda borsyra som 1-procentigt transport- medium För att undvika överväxt vid undersökning av Brusella abortus har visats. _ Borsyra har använts vid Flera olika studier både humana och enimala, av bakterieväxt och hämning därav i olika vehiklar. Trots detta påpekas det i flera vetenskapliga arbeten, att bakteriologiska undersökningar av urin måste utföras omedelbart, om ej Förvaring under kyla (+4°C) är möjlig, och då endast under 48 timmar. Problemet med överväxt vid långsam transport av urinprover till bekteriologiska laboratorier kvarstår alltså. I ett arbete från slutet av 1960-talet påpekas det något överraskande, att studium av borsyra som konserveringsmedel vid urintransporter ej blivit beaktat än mindre undersökt.I detta arbete meddelas att den optimala borsyrakoncentrationen i ett färdigt urin- transportprov skall vara 1,B%, och att den preanalytiska tiden ej bör överstiga Fyra dagar. _ Trots dessa vetenskapliga medicinska arbeten och 780214744 trots att borsyra tidigt var känd som ett funktionellt konserveringsmedel med avseende på bakterieväxt, har denna metod rönt ringa utbredning vara sig nationellt eller inter- nationellt vid bakteriologiska laboratoriearbetet.

Flera orsaker kan emellertid påvisas till denna tröghet att adaptera en till synes säker och relativt sett klart mer ekonomisk transportmetod än kyltransport. Metoden innebär stora praktiska svårigheter, eftersom man måste mäta upp mycket små mängder av ett pulver, eftersom det-ta skall transpor- teras i mycket små transportrör, samt att borsyran har en relativt låg löslighetsgrad i urin. Om pulvret dessutom löses i vatten-För att lättare kunna mätas i exakta volymer, erhålles alltför stor volym av borsyralösning och urin För att bli praktiskt användbart vid transporter. För att på laboratoriet kunna distingera mellan urinprover med borsyra och urinprover utan borsyra, kräves ett extra arbetsmoment, vilket är praktiskt störande, emedan den centraliserade laboratoriediagnostiken kräver så få arbetsmoment som möjligt på grund av det stora antal urinprover, som dagligen inkommer (ca 500 per dag vid ett större laboratorium).

Borsyrans löslighet i vatten: vid n°c ' 2,66 g/wo g vatten vid 2o°c 4,9 9/100 g vatten vilket innebär, att man i praktiken inte kan arbeta med högre koncentratiuner än 3-prouentiga lösningar för att undvika utkristellisation.vid temperatursvängningar. Av bl.a. kost- nadsskäl eftersträvas så små traneportenheter som möjligt och i allmänhet användes standardiserade transportbehållare med en volym av 10 ml.

Vid användning av 3-procentig borsyralösning måste 13 ml sättas till 9 ml urin För att koncentrationen skall bli 1,B% borsyra, vilket är erforderligt För att erhålla konsarvering. Detta medFör, att mycket vatten tillföras ?eoz1avå4 proverna och att volymen ökas till över det dubbla.

Det har visat sig, att man kan uppnå mer effektiv preservation genom tillsats av endast 0,5 - 0,8% borsyra, om denna föreligger som ett organiskt komplex.. I Eftersom koncentrationen av borsyra i dessa komplex är hög, blir en tillsats av 0,4 - 1,4 ml till 9 ml urin fullt tillräcklig._ Man ökar på detta sätt volymen i så begränsad omfattning, att de standardiserade transport- rören kan användas.

Förfarandet enligt uppfinningen kännetecknas av att till provet sättas en sådan mängd av ett borsyrakomplex med formeln H R/Û\e/Ü H eller R/u\=B/Ü\R \Ü/ \Ü \Ü/ \D/ där R betecknar: etylenglykol propandiol-1,2 glycerol fruktcs mannit sorbit eller andra vattenlösliga dioxi- eller polycxiföreningar och som framställts genom upphettning av borsyran och oxi- föreningeng varjämte 1 - 2 mol av vid dess framställning bildat reaktionsvatten har avlägsnats, att halten borsyra i provet blir 0,2 - 1,4 viktprocsnt, företrädesvis 0,4 - 0,8 viktprocent. Övriga kännetecken på uppfinningen Framgår av underkraven. 7802147-4 För att man lättare skall kunna Fastställa, om preservationsmedel tillsatte, kan dessa infärgas med metylenblått eller annat lämpligt Färgämne, som ej stör den bakterilogiska undersökningen.

EXEMDEL 1 100 viktdeler etylenglykol 17 viktdelar boreyra BP upphettadas till ÉSOC, varvid vatten avspjälkades, varefter temperaturen höjdes till 11200 under en tid av Fyra minuter.

Därvid avgick 2 mol vatten Borsyrahalten = l7,7% pH i koncentrerad reaktionsprodukt = 2,5 pH i 10-procentig vattenlöening = 4,4 EXEfiEEL 2 124 viktdelar glycerol DAB 6 d = 1,23 17 viktdelar borsyra BP upphettades till 11Û°C, varigenom reaktionen initierades och 2 mol vatten avspjälkadee. Vattenhalten steg i reaktioneblandningen från 11,3% till 22,3%. Temperaturen höjdes under en uid av tre minuter till 129°c, varefter upphettning avbröts och reaktionsprodukten Fick kallna.

Vattenhalten = 15,5% aorsyrahalten = 12,4% pH i koncentrerad reaktionsprodukt = 1,3 pH i 10-procentig vattenlüsning = 3,9 Metylenblått tillsattes i en koncentration av 5 - 50 ppm- ?so214v-4 EXEMPEL 3 100 viktdelar d-mannit 70 viktdelar vatten 32 viktdelar borsyra upphettades till 8000, varvid reaktionen började. Temperaturen höjdes under sju minuter till ll2°C, varvid 2 mol vatten avgick. 0 Borsyrahalten = l0,8% pH i koncentrerad reaktiensprodukt = 0,85 pH i 10-procentig vattenlösning = 3,5 Produkten fick stelna och pressades till tabletter. .fllššïlißåïlf 4 __...- 100 viktdelar Fruktos 50 viktdelar vatten 36 viktdelar borsyra upphettades till B0°C, varefter temperaturen höjdes under sex minuter till l09°C, varvid 2 mol vatten avgick.

Borsyrahalten = l2,l% pH i koncentrerad reaktionsprodukt : 1,1 pH i Hlprocentig vattenlösning = 4,2 Reaktiensprndukten pressades till tabletter.

EXEMPEL 5 100 viktdelar propandiol-1,2 25 viktdelar borsyra upphettades till 98°C, varefter temperaturen höjdes till 160°E under tio minuter.

Borsyrahalt = 20% pH i koncentrerad reaktionsprodukt = 1,7 ll å u U\ pH i 10-procentig vattenlösning Infärgas med metylenblått.

W_Hsus1ao21u7-4 Borsyra-glycerol-komplexet, som är framställt enligt exempel 2, har undersökushuruvida individuell känslighet Föreligger mellan olika bakteriearter, vid olika bakterietal och i prov, som samtidigt innehåller flera olika bakterie- stammar genom att undersöka prov dels före och dels efter normalt förekommande transportfiyp_(mindre än ett dygn), dels i prov, som förvarats längre tid före utodlingen. Avsikten var också att individuellt undersöka de olika i produkten ingående komponenterna vad avser antibakteriell effekt samt att försöka bedöma, hur stora avvikelser från instruk- tionen, som kan tolereras, vad avser tillsatt mängd av den bor- eyrahaltiga konserveringsprodukten resp. mängden Urin. ' Två typer av försök har utförts: l) Prov har tagits från patienter med bakteriuri. Dels har prov tagits av laboratoriets personal, üels har prov tagits av avdelningspersonalen och transporterats med normala transporter till laboratoriet. I de fall prov och transporter utförts av laboratoriets personal, har man haft Full kontroll av provtagningsteknik och transporttid. Prov har tagits efter tvättning och tork- ning som s.k. "mid-stream-prov" och utodlats inom en timma. Utodling har gjorts på blodagarplatta, Drigal- skiagar och acidsorbitolagar. Kvantitering har gjorts efter utodlingar från seriespädning av urinprov i kok- salt. Artbestämning har gjorts med sedvanlig rutin- metod efter primär inkubering under 18 timmar vid 37°C. 2) Laboratoríeförsök med experimentellt framställd, hakteriehaltig urin har utförts För att möjliggöra testning av speciella stammar. För försöket har använts åtta bakteriestammar, som är vanliga vid urinvägs- infektion, nämligen: 73021474» Escherichia coli Klebsiella Pssudomonas aeruginosa Dseudomonas mirabilis Enterokocker Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus I Försök, som krävt speciellt känslig teststam, har gonokocker använts.

Undersökningarna har i huvudsak utförts som jämförelser mellan förvaring av prov i kyla resp. i rumstemperatur med boro-glycerolgtillsats.

Som referensvärde har använts det odlingsresultat, som ernölls efter utodling inom en timma efter provtagningen) För Försöken har använts dels ren borsyra i pulverform, dels olika koncentrationer av borsyra-komplex enligt exempel 2.

Experimentell bakteriuri-urin: Från bakteriekolonier på agarplattor gjordes slamning i fysiologisk koksaltlösning. Kvantitering gjordes med måïsäfitningen att erhålla en bakteriemängd mellan ca lÜU OUO och 10 miljoner/ml urin efter tillsats av slam- ningen i oinfekterad urin. 7802147-4 Resultat Försök utfördes med borsyra i pulverform. Till 9 ml urin sattes 0,1 g borsyra. Använda taststammar Framgår av tabell l. Ûdlad efter +4°c +22°c +4°c +22°c Entsrococci 6,7 6,3 6,3 ' 6,2 6,2 Drot.mir. 6,3 6,3 6,3 6,1 6,1 St. aureus 5,8 5,9 5,7 5,9 5,8 Pseudomonas 6,2 6,1 6,0 6,0 5,9 Klabsialia 6,1 5,6 6,2 6,0 6,7 E. 6611 5,5 5,5" 5,5 5,2 5,1 Tabell 1 QÛ log av antalet bakterier) Den enligt metodbeskrivningen framställda, bakterie- haltiga urinen kvantiterades och delades i två portioner. Den ena placerades vid +4°C,till den andra sattes borsyra och För- varades i rumstemperatur. Kvantitering utfördes efter 24 timmar och efter 48 timmar. Av tabellen framgår det, att inga anmärk- ningsvärda avvikelser sker vare sig urinen förvarats i kyla eller vid rumstemperatur med boreyratillsats.

Patientprov: Prov togs från sex geriatriska patienter i lång- tidsvård. Proven utodlades inom en timma, varefter proven be- handlades analogt enligt ovan. Av tabell 2 Framgår det, att avvikeleerna för såväl kylda som i borsyra förvarade prov är mindre än en 10-potens. 7so2147-4 _ 10 patient odlad efter 1 h 24 n 24 h barsyra as h aa n b@rsy_ +4°c +22°c +4°c ra +z2°c 1. E,co1i i7,5 7,7 7,7 7,6 7,6 2. E.c°1i 7,1 6,9 6,9 7,1 6,6 3. Prat. g 6,9 6,5 7,0 7,0 7,2 4. prat. 7,4 7,4 7,2 7,3 7,1 5. Drot. 6,3 5,9 6,3 5,6 5,4 6. Prot. 6,9 6,8 6,7 5,9 5,7 Tabell 2 För att utröna om glycerol i sig skulle ha hämmande effekt på bakterier, genomfördes Följande Försök: Femton färska bakterieisolat från patienter med bakteriuri tillsattes urin, som kvantiterades och uppdelades i tre portioner För Förvaring vid +4°C, för Förvaring i rumstemperatur med tillsats av borsyra och För förvaring vid +22°C med till- sats av glycerol. Av tabell 3 Framgår testade bakterflestammar och uppmätta Förändringar i 10-log. I intet av fallen har hämning erhållits genom tillsats av glycerol. Förändringar i kylförvarat resp. vid rumstemperatur Förvarat prov med borsyratillsats var i samtliga fall mindre än en 10-potens.

För att utröna om negativ effekt kunde erhållas genom kombinationen av borsyra-komplex enligt exempel 2 och kylförvaring, utfördes Följande försök: Till urin sattes Fem olika bakteriearter. Provet kvantiterades och delades. Übe- handlad urin Förvarades vid -2D°C. En annan portion av' provet tillfördes borsyra-komplex enligt exempel 2 och förvarades dels vid +4°C, dels vid rumstemperatur. ll 7802147-4 Üdlad efter l h 24 h 24 h borsyra 24 h glycerol +a°c +22°c +22°c nmteus 1 5,0 5,05 6,0 >9 Proteus 2 5,7 5,8 5,9 >9 Proteus 3 6,5 6,5 7,1 8,15 Proteus 4 8,05 8,05 8,25 8,20 Proteus 5 8,2 8,0 8,25 8,7 proteus 6 6,05 6,5 6,15 >9 Klebsiella 1 4,75 4,4 4,55 >9 Kleusiella 2 6,7 6,7 6,5 >9 Klebsiella 3 7,3 8,3 7,5 8,2 Klebsialla 4 6,05 5,7 5,45 >9 Klebsiella 5 6,8 6,75 6,9 7,5 Pseudomonas 1 7,5 7,0 7,3 7,8 Pseudomonas 2 7,8 8,0 7,8 8,2 Enterococci 5,35 4,4 5,5 >9 E. coli 7,7 7,7 7,8 8,05 Tabell 3 Bakterie Ympning Borsyra-glycerolkomplex (S952) 18 h 10 h +40: la h +22°c -20°c E. coli 5,7 5,5 5,8 3,5 Prat. mirabilis 6,5 6,0 6,2 2,4 Dseudomonas 6,9 6,1 6,3 3,9 :interna-Joni 6,5 6,0 6,0 4,2 Staph. aureus 6,0 6,0 6,0 5,7 Tabell 4 758021 47-1: 12 Av tabellen Framgår det, att kombinationen kylför- varing och borsyra-glycerol-komplex enligt exempel 2 ej ger avvikande resultat efter Förvaring i 18 timmar. Frysning av urin medför helt otillförlitliga kvantitativa resultat.

Avvikelserna är större för gram-negativa stavar än För gram- positiva kocker.

För att utröna glycerolens effekt på bakterier, gjordes Försök med en speciellt känslig stam: Urin med och utan glyceroltillsats jämfördes. Till 9 ml urin sattes 0,65 ml glyoerol. Gonokooker tillsattes såväl denna urin som urin utan glyceroltillsats. Kvantitering gjor- des efter en, tvâ, fyra och sex timmar. Av tabell 5 framgår den procentuella andel av ursprungligen tillförda gonokocker, som kan återisoleras efter resp. tid. Av tabellen Framgår det, att gonokocker snabbt avdödas i urin och ej kan återfinnas Fyra timmar efter tillsatsen, medan tillsats av glycerol gör, att gonokocker Fortfarande isoleras efter sex timmar. I Testorganism ' timmar Urin med 0,65 ml Urin glycerol/9m1 cnnecucci 1 100% i 60% 2 100% e 60% a 40% <1% e 107; 41% Tabell 5 Experimentet gjordes med tillsatser av olika Färg- ämnen. Löfflers metylenblàtt (0,5 g/1.000 ml) späddes och sattes till urin. Färgen i en koncentration av 0,01 ml/9ml urin var'tydligt iakttagbar för det obeväpnade ögat. För att utröna metylenblåtts effekt på bakterier, gjordes Försök med en 10 gånger 780211174» 13 starkare lösning. Borsyra-glycerol-komplex med och utan matylenblått sattes till prov. Av tabell 6 framgår det, att gtillsatsen av metylenblått ej störde kvantiteringen av de testade bakteriestammarna. i I Ympmedel Efter 24 h med t Utan metylenblått mecy1enb1àtt ! +22°C +2z°c E. coli 5,6 5,5 5,3 Droteus mir. 6,0 5,9 6,0 Pseudomonas aeruginosa 6,0 5,9 5,9 Enterococci 6,2 6,0 5,9 Staph. aureus 6,0 6,0 6,2 Tabell 6 Felmarginaler: För att utröna 1 hur hög grad man kan göra avsteg från metodbeskrivningen beträffande mängd urin resp. mängd borsyra-komplex-tillsats, gjordes Försök med olika koncentrationer.

För Försöket användes urin med tillsats av E. coli.

Med utgång från tidigare rapporter om lämplig koncentration av borsyra och efter justeringar byggda på erfarenheter gjordes ett borsyra-glycerolkomplex med l2,4% borsyra. Till normal urinprovmängd - 9 ml - sattes nio olika mängder från 0,4 till 0,8 ml (0,65 ml motsvarar 0,É2% borsyra). Prov förvarades vid +22°C i 24 timmar. Kvantitering gjordes dels från drygtfem|nânadar gammal lösning, dels från nyberedd lösning.

Förändringarna inom spädningsområdet var mindre än en 10-potens. Borsyra-komplexet var förpackat i en por- tionspáse. Genom val av 0,65 ml per portionspåse på- verkades sannolikt ej resultatet, om man genom slarv under- låter att tömma en tredjedel av innehållet i urinprovet och därmed erhåller en lägre koncentration av borsyra än vad som e'?8~0'21h7-1+ 14 är avsett. Metoden förefaller även tåla en viss koncentra- tionsökning genom att för litet urin hälls i röret. Enligt beräkning tillåter metoden, att man försummar att tillsätta 3 - 4 ml av rekommenderade 9 ml.

Slutförsñkz Slutförsök utfördes på prov taget från patienter med - bakteriuri. All provtagning gjordes med tillsats från portionspåse och transport av prov gjordes med ordinarie rutiner. En del av provet försågs med boro-glycerol-komplex och förvarades i rumstemperatur, den andra delen kyldes och kyltransporterades. Båda provtyperna förvarades under 24 timmar, varefter kvantitering utfördes. Resultaten framgår av tabell 7. 78021117-4 15 Pat. Födelsedatum Kön Bakterie Antal bakterier/ml urin nr Bore-glycerol-komplex +22°C +4°C 1 96 10 16 K E. 6611 6,00 6,06 2 90 04 13 M Klebsiella 7,67 7,48 3 se 03 30 K E. 6611 0,42 0,20 4 94 09 06 K Staph.aureus 6,60 7,00 Proteus 6,23 6,69 _ E. 6011 6,90 7,20 5 07 03 lB K E. coli 6,40 6,76 e 9: 12 25 K E. 6011 3,300 2,00 *) 7 96 10 16 K' E. coli 7,50* 7,65 a 90 10 29 K Enterococci 3,90 ) 3,600 9 91 02 25 M Enterococci 5,17 5,11 Proteus 6,20 6,00 10 92 12 ll Klebeiella 7,59 8,36 11 93 04 13 E. 6611 0,15 0,34 12 01 10 05 Proteus 4,85* 5,96** Enterococci 4,15) 4,11 ) Dift. Stavar 8,00 8,00 13 97 ll 05 K Proteus 6,48 7,70 Enterococci _ 5,90 5,78 mebsiena 7,10 7,00 14 K E. 6611 ? 0,07 0,17 15 87 02 06 M ; Enterococci E 7,47 7,47 g Proteus mir. _ 6,69 6,69 i Proteus 0019.; 7,77 7,77 f stapn. ep. I 7,30 5,60 Tabefl 7. 10 log. av antal bakterier efter preservering av 9 ml urinprov med 0,65 m1 boro-glycerol-komplex motsvarande 0,82% borsyra vid rumstemperatur jämfört med urin preserverad vid +ä°C.

*) Ej märkbar bakteriuri Troligen ej märkbar bakteriuri **) 780214741 ie -f -- Stora problem föreligger vid transport av prov för bakteriologisk odling. Icke önskade förändringar inträffar, om ej utodling sker inom mycket kort tid efter provtagningen.

Förändringarna kan förhindras genom kyltransport. Kylning av prov kan ibland medföra frysning av prov, vilket är deletärt för många bakteriearter. Kylförfarandet är klumpigt _ och oekonomiskt. Användandet av borsyra som preserverande tillsats i urinprov har tidigare påvisats och verifierats med nya försök. Nackdelarna med borsyra i pulverform har initierat försök att erhålla borsyra i lösning. BUrsyra-gly- cerol-komplex har framställts enligt exempel 2 och metylenblått har tillsatte för att visualisera tillsats i provet. Såväl laboratoriemässiga som kliniska provundersökningar har visat, att kompositionen enligt uppfinningen haft avsedd effekt. För- ändringar har ej uppstått i prov under två dygn. Ett stort antal olika bakteriearter, aktuella som etiologi till urinvägs- infektion, har testats. Ingen antibakteriell effekt har påvisats för någon av de ingående komponenterna vid använd koncentration.

Uttitrering av säkerhetsmarginalerna för felanvändning av produkten har visat, att man sannolikt kan tolerera en 30-procentig feldosering, såväl uppåt som nedåt, från den rekommenderade koncentrationen.

Genom produktens koncentration är man ej låst till någon speciell rörtyp utan kan flexibelt anpassa sig till de prov- volymer och rörtyper, som användes vid olika laboratorier.

Det är uppenbart, att detta system är betydligt smidigare än kyltransport och att det eliminerar risker för frysskador på prov. Från transportsynpunkt erbjuder metoden större smidighet och betydligt lägre kostnader. Rätt genomförd kyltransport har praktiskt visat sig vara mycket svår att åstadkomma.

Claims (4)

78021474: 17 P A T E N T K R A V

1. Förfarande För stabilisering av prover, som skall underkaetas bakterilogiska laboratorieündersökningar, i synnerhet urinprover, För deras preservering under transport, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att till provet sättas en sådan mängd avett borsyrakomplex med formeln R//Û\\\B//0 H eller R// B/// \\R H \Ü/ \0 \Û/ \Û/ där R betecknar: Û- 0 etylenglykol propandiol-1,2 glycerol fruktos mannit sorbit eller andra vattenlüsliga dioxi- eller polyoxiföreningar och som framställts genom upphettning av borsyran och oxiföreningen, varjämte 1 - 2 mol av vid dess framställning bildat reaktionsvatten har avlägsnats, att halten borsyra i provet blir 0,2 - 1,4 viktprocent, företrädesvis 0,4 ~ 0,8 vlktprocent.

2. Fürfaranda enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att man tillsätter en blandning av borsybakomplex.

3. Förfarande enligt kravet 1 eller 2, k ä n n e- t e c k n a t d ä r a v, att man använder ett borsyra- komplex, som innehåller en Färgtillsats, 78021117 - lf 18

4. Förfaranda enligt kravet 3, k ä n n e t B c k- n'a t d ä r a v, att man använder matylenblâtt som Färgtillsafs i en mängd av 5 - SD ppm. ANFöRoA PußLn Norge 92 654 (12 Mza/os), 99 607 (co7f 5/02) sforbruunnien 405 998, 511 641, saa 853, 931-759 Andra publikationer: Gmelin Hondbuch der Anorguníschen Chemie vol. 33. del 8. (1976). Borverbíndungen, s. 115-16, 118, 120 Chem. Åbstr. 69 (1968), 80 943