SE410737B - PEARLY, IN THE WATER SWELLABLE COPOLYMERISAT AS CARRIER FOR BIOLOGICAL ACTIVE SUBSTANCES, WHICH COPOLYMERISAT CONTAINS EPOXY GROUPS - Google Patents
PEARLY, IN THE WATER SWELLABLE COPOLYMERISAT AS CARRIER FOR BIOLOGICAL ACTIVE SUBSTANCES, WHICH COPOLYMERISAT CONTAINS EPOXY GROUPSInfo
- Publication number
- SE410737B SE410737B SE7310177A SE7310177A SE410737B SE 410737 B SE410737 B SE 410737B SE 7310177 A SE7310177 A SE 7310177A SE 7310177 A SE7310177 A SE 7310177A SE 410737 B SE410737 B SE 410737B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- carrier
- bound
- active substances
- water
- biologically active
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
- C12N11/087—Acrylic polymers
Landscapes
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Polymerisation Methods In General (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Graft Or Block Polymers (AREA)
Description
7310177-6 10 15 20 25' 30 35 40 o ler vid hydrolys. 2 Bärare baserade pâ polysackarider, såsom cellulosa, stärkelse, dextran, agaros och dess derivat kan nedbrytas enzymiskt, vilket kan ske genom mikrobiologiskt angrepp el- ler närvaro av hydrolytiska enzymer. Den vid dessa bärare ofta observerade "utblödningen" av biologiskt aktiva substan- ser kan hänföras sâväl till en sådan nedbrytning som till en ofullständig bindning. Vid bindningen av biologiskt aktiva ämnen på ytan av oorganiska eller syntetiska material med de- finierad, kompakt form, såsom glaspärlor eller syntetiska fib- rer, erfordras en särskilt aktivering. Bindningsförmågan är -mycket ringa på grund av den relativt lilla tillgängliga ytan. 7310177-6 10 15 20 25 '30 35 40 or by hydrolysis. Carriers based on polysaccharides, such as cellulose, starch, dextran, agarose and its derivatives can be degraded enzymatically, which can be done by microbiological attack or the presence of hydrolytic enzymes. The "bleeding" of biologically active substances often observed in these carriers can be attributed both to such degradation and to incomplete binding. When binding biologically active substances on the surface of inorganic or synthetic materials with a defined, compact shape, such as glass beads or synthetic fibers, a special activation is required. The bonding ability is -very low due to the relatively small available area.
I plast i form av pärlor inbäddade enzymer, vilka_som fyllning i en kolonn tillåter en hög genomströmningshastighet, är enligt en metod av Nilsson och Mosbach tillgängliga däri- genom, att man låter omättade monomerer polymeriseras i en en- zynhaltig vattenlösning under härdning. De uppstående vatten- haltiga polymerisatpärlorna innesluter enzymet utan kemisk bindning. Vid detta förfarande kan man endast använda utspäd- da enzymlösningar och därvid binda endast ca 3% aktivt protein.According to a method by Nilsson and Mosbach, enzymes embedded in plastics in the form of beads, which as a filling in a column allow a high flow rate, are accessible by allowing unsaturated monomers to be polymerized in an enzyme-containing aqueous solution during curing. The resulting aqueous polymer beads contain the enzyme without chemical bonding. In this process, only dilute enzyme solutions can be used, binding only about 3% of active protein.
Ej heller med koncentrerade enzymlösningar erhåller man någon högre beläggning av bäraren med aktivt material, emedan detta skadas av radikalpolymerisationsreaktionen. Från den färdiga produkten kan enzymer ständigt utblöda vid användningen genom svällning och avsvällning. Är å andra sidan bryggbildningen eller härdningen så stark, att enzymet blir ständigt inneslu- tet, så kan högmolekylära substrat ej längre vandra in i pär- lorna och reagera med enzymet. Detsamma gäller för alla för- faranden, vid vilka biologiskt aktiva ämnen inbäddas i membra- ner, folíer eller andra semipermeabla skikt.Even with concentrated enzyme solutions, no higher coating of the support with active material is obtained, as this is damaged by the radical polymerization reaction. From the finished product, enzymes can constantly bleed out during use through swelling and decompression. On the other hand, if the bridging or hardening is so strong that the enzyme is constantly entrapped, high molecular weight substrates can no longer migrate into the beads and react with the enzyme. The same applies to all processes in which biologically active substances are embedded in membranes, foils or other semipermeable layers.
I DT-OS l 908 290 beskrives förnätade, starkt svällba- ra sampolymerisat av akrylamid och maleinsyraanhydrid för fixe- ring av protein, vilka framställes i ett komplicerat flerstegs- förfarande. Dessa sampolymerisat uppvisar i likhet med övriga anhydridgruppinnehållande bärare den olägenheten, att de bind- ningsaktiva anhydridgrupperna lätt hydrolyseras i vatten och att fria karboxylgrupper bildas vid bindning av proteiner el- Bäraren får därvid en starkt anjonisk karak- tär, vilket är en nackdel vid användning av det bärarbundna' proteinet, eftersom anjoniska substrat avstötes från den anjo- niska bärarmatrisen, medan katjoniska substrat hâlles fast i 10 15 20 25 30 35 40 7310177-6 3 ytan med ringa varaktiga jonbindningar. I åtskilliga fall försvåras växelverkan mellan substratet och de i bärarens in- re bundna proteinmolekylerna. , Pärlpolymerisat som kemiskt binder biologiskt aktiva ämnen ur en vattenlösning är kända genom den tyska utläggnings- skriften 2 062 818. De framställes på så sätt, att man löser en lösning av maleinsyraanhydrid, vinyletrar och divinyletrar i ett starkt polärt lösningsmedel, emulgerar och polymeriserar lösningen i ett kolväte till droppar. Därvid uppstår stor- maskigt rymdnätsförgrenade, svällda polymerisatpärlor, som till en början är förhållandevis hydrofoba. Först genom hydro- lys av anhydridgrupperna till karboxylgrupper ökar deras hydro- fila egenskaper och därmed även svällbarhet med vatten. I den mån som hydrolysen och svällningen vid beröring med en vatten- fas fortskrider utifrån och inåt kan även ett i vattenfasen löst biologiskt aktivt ämne diffundera in i pärlorna och bin- das genom de efter långtgående hydrolys kvarvarande anhydrid- grupperna.DT-OS 1 908 290 describes crosslinked, highly swellable copolymers of acrylamide and maleic anhydride for fixing protein, which are prepared in a complicated multi-step process. These copolymers, like other anhydride group-containing carriers, have the disadvantage that the binding-active anhydride groups are easily hydrolyzed in water and that free carboxyl groups are formed upon binding of proteins or The carrier thereby acquires a strong anionic character, which is a disadvantage when using the carrier-bound 'protein, since anionic substrates are rejected from the anionic carrier matrix, while cationic substrates are retained in the surface with little permanent ionic bonds. In several cases, the interaction between the substrate and the protein molecules bound within the carrier is made more difficult. Bead polymers which chemically bind biologically active substances from an aqueous solution are known from German Offenlegungsschrift 2,062,818. They are prepared by dissolving a solution of maleic anhydride, vinyl ethers and divinyl ethers in a strongly polar solvent, emulsifying and polymerizing the solution. in a hydrocarbon to droplets. This results in large-mesh space-branched, swollen polymer beads, which are initially relatively hydrophobic. Only by hydrolysis of the anhydride groups to carboxyl groups does their hydrophilic properties increase and thus also swellability with water. To the extent that the hydrolysis and swelling on contact with an aqueous phase proceeds from the outside and inwards, a biologically active substance dissolved in the aqueous phase can also diffuse into the beads and bind through the anhydride groups remaining after extensive hydrolysis.
Utgângsämnenas hydrofoba natur inverkar försvårande på pärlpolymerisationsförfarandet. Monomererna är lösliga även i kolvätefasen och polymeriserar där till en avsevärd del under bildandet av ett finfördelat fällningspolymerisat, som endast med svårighet kan avskiljas från de äkta polymerisatpärlorna.The hydrophobic nature of the starting materials has an aggravating effect on the bead polymerization process. The monomers are soluble even in the hydrocarbon phase and polymerize there to a considerable extent during the formation of a finely divided precipitate polymer, which can only be separated with difficulty from the real polymer beads.
Fällningspolymerisatet upphäver nâgra av de fördelar, som lig- ger i enzymbärarens pärlform. Det försvårar nämligen filtrer- barheten, tillåter inte en fullständig avskiljning från en sub- stratlösning och minskar genomloppshastigheten i kolonnreakto- rer.The precipitating polymer eliminates some of the advantages inherent in the pearl form of the enzyme carrier. This is because it makes filterability more difficult, does not allow complete separation from a substrate solution and reduces the flow rate in column reactors.
En väsentlig nackdel med polymerisaten ligger i den bristande hydrofila egenskapen i utgångsstadiet. Indiffunde- ringen och bindningen av de biologiskt aktiva ämnen måste all- tid föregås av hydrolys och hydrofilering. Anhydridgrupperna hydrolyseras mestadels helt innan biologiskt aktiva molekyler, ”framförallt högmolekylära ämnen, kan intränga i det svällda området. Dessa enzymbärares bindningskapacitet är därför förhållandevis begränsad och likaså den specifika aktivite- ten, dvs. andelen av det kemiskt bundna material som har bi- behållit sin biologiska aktivitet. Ändamålet med uppfinningen är att åstadkomma förbätt- rade enzymbärare. De skall föreligga i definierad pärlform 7310177-6 10 15 20 25 4 och ej tillsammans med finfördelade fällningspolymerisat, ej vara enzymiskt nedbrytbara och kovalent binda biologiskt ak- tiva substanser med högt utbyte och under bibehållande av dessas biologiska aktivitet. De erhållna enzymprodukterna skall lätt och fullständigt kunna avskiljas från substratlös- ningar och tillåta en hög genomloppshastighet genom en med dessa fylld kolonn. Förutsättningen för detta är en stor fri volym mellan enskilda partiklar i en lös massa av sådana.A significant disadvantage of the polymers lies in the lack of hydrophilic property in the initial stage. The diffusion and binding of the biologically active substances must always be preceded by hydrolysis and hydrophilization. The anhydride groups are mostly hydrolyzed completely before biologically active molecules, “especially high molecular weight substances, can penetrate into the swollen area. The binding capacity of these enzyme carriers is therefore relatively limited, as is the specific activity, ie. the proportion of the chemically bound material that has retained its biological activity. The object of the invention is to provide improved enzyme carriers. They must be in defined pearl form and not together with finely divided precipitated polymers, not be enzymatically degradable and covalently bind biologically active substances in high yield and while maintaining their biological activity. The resulting enzyme products must be easily and completely separable from substrate solutions and allow a high throughput through a column filled with them. The prerequisite for this is a large free volume between individual particles in a loose mass of such.
Kulformiga delar med i hög grad enhetlig storlek uppfyller denna förutsättning, man aat har hittills aj varit möjligt att framställa enzymbärarsubstanser i form av ett enhetligt pärlpolymerisat.Spherical parts with a highly uniform size meet this condition, it has hitherto not been possible to produce enzyme carrier substances in the form of a uniform bead polymer.
En förbättrad enzymbärare har enligt uppfinningen er- nåtts genom ett pärlformigt, förnätat, i vatten svällbart samr polymerisat, som har de i efterföljande krav 1 angivna känne- tecknen.According to the invention, an improved enzyme carrier has been obtained by means of a pearlescent, crosslinked, water-swellable polymer which has the characteristics stated in the following claim 1.
Genom andelen vattenlösliga monomerer är den för pärl- polymerisationen använda monomerblandningen som helhet hydro- filare och skarpare avgränsad från det omgivande hydrofoba mediet än vad som är fallet vid framställningen av pärlpoly- merisat enligt den tyska utläggningsskriften 2 062 818. En- hetliga polymerisatpärlor uppstår utan åtföljande fällnings- polymerisat. Tack vare sin hydrofila natur sväller pärlpoly- merisaten enligt uppfinningen snabbt och kraftigt i vatten, varvid i svällningsvattnet lösta, biologiskt aktiva substan- ser samtidigt intränger och binds kovalent. De fördelaktiga egenskaperna hos produkterna enligt uppfinningen framgår tyd- ligt av efterföljande jämförelse med produkter enligt den tyska utläggningsskriften 2 062 818. 7310177-6 Pärlformiga bärarpolymerisats reaktion med trypsin Bärare: Pärlpolymerisat enligt tyska Pärlpolymerisat enligt utläggningsskriften 2 062 818 uppfinningen Exempel 3 Exempel N Exempel 1 (butandiol- (butandio1- (akrylamid/9lYCidY1' divinyleter/ dívinyleterl akrylfit, 421 mOl) maleinsyra- etylvínyleterl anhydrid maleinsyra- 1 : 2 mol) anhydrid 1 : 1 :pl mol) Reaktions- förhållande (torrt bärarmaterial: trypsin) 2 : 1 2 : 1 N : 1 Svällnings- grad (0,05 mo1.fosfat- buffert pH 7,5) 3 30 11 Proteinhalt hos reak- tíonsproduk- ten 0,7U 1 1,9 % 8 % Utbyte bundet enzym (använt 2) %2% 3 enzym) 1,5 % 30 % Medel- ) aktivitet (mU/mg harts) 1,9 1,5 11,2 Den enzymiska aktívitetens stabilitet vid upprepad användning nej nej ja 1) 1 mÜ motsvarar spaltningen av 1 x 10 -5 umol peptidbíndníngar per minut som medelvärde vid en reaktionstid av 60 minuter mätt genom automatisk títrering. 2) Värdena erhölls efter flerfaldiga tvättningar utan ernående av en konstant slutaktivitet. Värdena för kovalent bundet protein torde ligga ännu lägre. \ 10 15 20 25 30 35 vz1o1?7e6 6 De reaktiva grupperna av de under a) nämnda monomerer- na är sådana grupper, som vid temperaturer av O-40°C i vatten- lösning reagerar med primära aminogrupper och hydroxylgrupper och därvid bildar en kovalent bindning till syre- eller väte- atomen hos hydroxyl- respektive aminogruppen. Emedan vatten alltid föreligger i avsevärt överskott i förhållande till hydroxyl- respektive aminogrupperna är grupper, som spontant reagerar med vatten, såsom exempelvis isocyanatgrupper, mind- re lämpliga. Företrädesvis handlar det om aktiverade karboxyl- grupper, som är kända från peptidkemin, eller om N- eller O- -alkyleringsmedel såsom alkylhalogenid- eller epoxidgrupper.Due to the proportion of water-soluble monomers, the monomer mixture used for the bead polymerization as a whole is more hydrophilic and sharper delimited from the surrounding hydrophobic medium than is the case in the preparation of bead polymer according to German Offenlegungsschrift 2,062,818. accompanying precipitating polymer. Due to their hydrophilic nature, the bead polymers according to the invention swell rapidly and strongly in water, whereby dissolved, biologically active substances dissolved in the swelling water simultaneously penetrate and bind covalently. The advantageous properties of the products according to the invention are clear from the following comparison with products according to the German Offenlegungsschrift 2,062,818. (butanediol- (butanediol1- (acrylamide / 9lYCidY1 'divinyl ether / divinyl ether] acrylate, 421 mOl) maleic acid-ethylvinyl ether / anhydride maleic acid- 1: 2 mol) anhydride 1: 1: pl mol) Reaction ratio (dry support material: 1 trypsin) 2: 1 N: 1 Degree of swelling (0.05 mo1.phosphate buffer pH 7.5) 3 30 11 Protein content of the reaction product 0.7U 1 1.9% 8% Yield bound enzyme (used 2) % 2% 3 enzyme) 1.5% 30% Mean) activity (mU / mg resin) 1.9 1.5 11.2 Stability of the enzymatic activity in repeated use no no yes 1) 1 mÜ corresponds to the cleavage of 1 x 10 -5 μmol peptide bonds per minute as an average at a sale action time of 60 minutes measured by automatic titration. 2) The values were obtained after multiple washes without achieving a constant final activity. The values for covalently bound protein should be even lower. The reactive groups of the monomers mentioned under a) are those groups which at temperatures of 0-40 ° C in aqueous solution react with primary amino groups and hydroxyl groups to form a covalent bond to the oxygen or hydrogen atom of the hydroxyl and amino groups, respectively. Since water is always present in considerable excess relative to the hydroxyl and amino groups, groups which react spontaneously with water, such as, for example, isocyanate groups, are less suitable. Preferably these are activated carboxyl groups known from peptide chemistry, or N- or O- -alkylating agents such as alkyl halide or epoxide groups.
Exempel på aktiverade karboxylgrupper, som används i peptid- kemin för bildandet av peptidbindningar, är karbonsyraklorid-, karbonsyraanhydrid- och karbonsyraacidgrupper samt fenylestrar och karbonsyraestrarna av hydroxylaminderivat med den allmänna formeln R! / R-CO-O-N R" Såsom exempel på föreningar av grupp a) kan nämnas gly- cidylester av a,ß-omättade karbonsyror, speciellt glycidyl- -akrylat och metakrylat.Examples of activated carboxyl groups used in peptide chemistry for the formation of peptide bonds are carboxylic acid chloride, carboxylic anhydride and carboxylic acid groups and the phenyl esters and carbonic acid esters of hydroxylamine derivatives of the general formula R Examples of group (a) are glycidyl esters of α, β-unsaturated carboxylic acids, especially glycidyl acrylate and methacrylate.
Vid föreningen med enzymer, enzymsubstrater, inhibi- torer, hormoner, antibiotika, antikroppar, antigener och pep- tider bildar epoxigrupperna i vattenlösning vid temperaturer av 0-40°C kovalenta bindningar till 0- eller N-atomer. Om de biologiskt aktiva substanserna har äggvitekaraktär innehåller dessa i varje fall en primär ändaminogrupp samt i många fall ytterligare OH- eller NH-grupper i aminosyraestern av nitin, citrullin, arginin, lysin, serin, treonin eller tyrosin. Icke äggviteartade biologiskt aktiva substanser kan endast bindas om de innehåller åtminstone en primär amino- eller hydroxyl- grupp, såsom exempelvis polysackarider, nukleinsyror, ampi- cillin, tyramin. Epoxidgrupperna är hydrolyskänsliga och kan, om de inte reagerar med de förekommande ämnena,i närvaro av vatten övergå till hydrofila hydroxylgrupper. De aktiverade grupperna förekommer därför i bärarmaterialet i vanligen stör- re antal än som erfordras för bindning av enzymproteinet. 10 15 20 25 30 35 40 'där en kovalent bindning sker. 7310177-6 7 Epoxidgrupperna reagerar dock lättare med hydroxyl- eller aminogrupper än med vatten. Matrisens elektriskt neutrala karaktär bibehålles också efter bindning av det biologiskt aktiva materialet.When combined with enzymes, enzyme substrates, inhibitors, hormones, antibiotics, antibodies, antigens and peptides, the epoxy groups in aqueous solution at temperatures of 0-40 ° C form covalent bonds to 0 or N atoms. If the biologically active substances have an egg white character, these in each case contain a primary end amino group and in many cases additional OH or NH groups in the amino acid ester of nitine, citrulline, arginine, lysine, serine, threonine or tyrosine. Non-egg white biologically active substances can only be bound if they contain at least one primary amino or hydroxyl group, such as, for example, polysaccharides, nucleic acids, ampicillin, tyramine. The epoxide groups are sensitive to hydrolysis and can, if they do not react with the substances present, turn into hydrophilic hydroxyl groups in the presence of water. The activated groups therefore occur in the carrier material in usually larger numbers than are required for binding of the enzyme protein. 10 15 20 25 30 35 40 'where a covalent bond occurs. 7310177-6 7 However, the epoxide groups react more easily with hydroxyl or amino groups than with water. The electrically neutral character of the matrix is also maintained after binding of the biologically active material.
I den vattenhaltiga enzymlösningen sväller bärarmate- rialen till flera gånger den ursprungliga volymen. Därvid diffunderar ej endast vatten utan även den däri lösta, bio- logiskt aktiva substansen till det inre av de små delarna, Polymerisatpärlornas svällbar- het beror pâ deras halt av hydrofila grupper. Monomerenheter med hydrofila grupper bildar en väsentlig beståndsdel av poly- De härleder sig från vattenlösliga, neutrala, Som vattenlösliga merisatet. saltartade, sura eller basiska monomerer. i enlighet med uppfinningen gäller sådana monomerer, som vid rumstemperatur ger åtminstone 10%-iga vattenlösningar. Bland neutrala monomerer av detta slag är sådana med en amidgrupp, framförallt akryl- eller metakrylamid eller N-vinylpyrrolidon, särskilt viktiga. Monomerer innehållande hydroxylgrupper, så- som etylenglykolmonoakrylat eller -monometakrylat är något mindre hydrofila. Monomerer med saltartade grupper är ex- tremt hydrofila och kan i förhållandevis ringa mängder delta- ga i uppbyggnaden av sampolymerisaten enligt uppfinningen.In the aqueous enzyme solution, the carrier material swells to several times the original volume. In this case, not only water but also the biologically active substance dissolved therein diffuses into the interior of the small parts. The swellability of the polymer beads depends on their content of hydrophilic groups. Monomer units with hydrophilic groups form an essential component of poly- They are derived from water-soluble, neutral, As water-soluble meritate. salty, acidic or basic monomers. in accordance with the invention, such monomers apply which, at room temperature, give at least 10% aqueous solutions. Among neutral monomers of this kind, those with an amide group, especially acrylic or methacrylamide or N-vinylpyrrolidone, are particularly important. Monomers containing hydroxyl groups, such as ethylene glycol monoacrylate or monomethacrylate, are slightly less hydrophilic. Monomers with saline groups are extremely hydrophilic and can participate in relatively small amounts in the construction of the copolymers according to the invention.
Monomerer av detta slag är exempelvis vinylsulfonsyra och dess salter och de kvaterniserade aminoalkylestrarna av d,ß- omättade karbonsyror, exempelvis metakryloxietyl-trimety1- ammoniumklorid. Monomerer med karboxylgrupper bildar salter i alkalisk och monomerer med sekundära eller tertiära amino- grupper i sur, vattenhaltig miljö, men dessa monomerer res- pektive de därav erhållna monomerenheterna är hydrofila även om de inte föreligger i form av salter.Monomers of this kind are, for example, vinylsulfonic acid and its salts and the quaternized aminoalkyl esters of d, β-unsaturated carboxylic acids, for example methacryloxyethyl-trimethyl-ammonium chloride. Monomers with carboxyl groups form salts in alkaline and monomers with secondary or tertiary amino groups in acidic, aqueous environment, but these monomers and the monomer units obtained therefrom are hydrophilic even if they are not in the form of salts.
Bärarmaterialens svällbarhet i vatten beror ej endast pâ de hydrofila grupperna av de i komponenten c) sammanfatta- de monomererna utan även på de genom hydrolys av epoxigrupper uppstående fria hydroxylgrupperna. En andel av upp till 50 molprocent av monomererna kan vara vattenolösliga och ha mind- re hydrofil natur. Å andra sidan kan vissa andelar hydrofoba komponenter erfordras för en optimal verkan av de bundna, bio- logiskt aktiva ämnena. Som icke vattenlösliga monomerer ifrâgakommer exempelvis akryl- och metakrylsyraestrar av ali- fatiska alkoholer, nitriler av dessa syror, vinylestrar av 10 15 20 25 30 35 40 1310177-6 8 lägre fettsyror, såsom vinylacetat eller vinylpropionat, vi- nylidenklorid och liknande. Inbyggnaden av sådana monomerer begränsas emellertid av polymerisationsförfarandet. tillåtes inte medanvändning av monomerer, som vid pärlpolyme- risationen löses med företräde i den exempelvis av högre ali- fatiska kolväten bestående, kontinuerliga fasen, såsom exem- pelvis akryl- och metakrylestrar av alkoholer med fyra eller Därför flera kolatomer.The swellability of the carrier materials in water depends not only on the hydrophilic groups of the monomers summarized in component c) but also on the free hydroxyl groups formed by hydrolysis of epoxy groups. A proportion of up to 50 mol% of the monomers may be water-insoluble and have a less hydrophilic nature. On the other hand, certain proportions of hydrophobic components may be required for an optimal effect of the bound, biologically active substances. Examples of non-water-soluble monomers are acrylic and methacrylic acid esters of aliphatic alcohols, nitriles of these acids, vinyl esters of lower fatty acids, such as vinyl acetate or vinyl propionate, vinylidene chloride and the like. However, the incorporation of such monomers is limited by the polymerization process. The co-use of monomers which are dissolved with preference in the continuous phase, for example consisting of higher aliphatic hydrocarbons, such as, for example, acrylic and methacrylic esters of alcohols with four or therefore several carbon atoms, is not permitted.
En tillräcklig hydrofil egenskap hos sampolymerisatet erhålles om ett motsvarande, utan medanvändning av härdande monomerer framställt sampolymerisat - åtminstone efter hydro- lysen av de aktiverade grupperna - vore lösligt i vatten, Ge- nom härdningen medelst sådana monomerer, som innehåller tvâ eller flera radikalpolymeriserbara koldubbelbindningar, såsom exempelvis glykoldimetakrylat eller -diakrylat, divinylbensql, triallylcyanurat, metylen-bis-aktylamid eller -metakrylamid och liknande, upphäves vattenlösligheten. Den optimala härd- ningsgraden, dvs. valet av mängden härdningsmedel inom grän- serna 0,2 till 5 molprocent, fastställes lämpligen empiriskt.A sufficiently hydrophilic property of the copolymer is obtained if a corresponding copolymer produced without curing monomers - at least after the hydrolysis of the activated groups - were soluble in water. By curing by means of such monomers containing two or more radical polymerizable carbon double bonds, such as, for example, glycol dimethacrylate or diacrylate, divinylbenzyl, triallyl cyanurate, methylene-bis-actylamide or methacrylamide and the like, the water solubility is eliminated. The optimal degree of cure, ie. the choice of the amount of curing agent within the limits of 0.2 to 5 mol%, is suitably determined empirically.
Härdningsgraden kan anses tillräcklig, när polymerisatpartik- larna i vatten sväller till 5-100-faldig volym eller mera men som enhetspartikel bibehåller idet närmaste sfärisk form även när de i vattenhaltig miljö sätter sig till ett skikt. Mellan partiklarna skall fria, endast med vattenfasen fyllda mellan- rum bestå. Vid för liten härdning deformeras partiklarna vid avsättningen så att inga mellanru bildas, medan vid för kraf- tig härdning ingen eller endast en ringa svällning inträffar, exempelvis till mindre än dubbla utgångsvolymen. En härdning med särskilt stormaskig rymdförgrening kan ernås därigenom, att man låter polymerisationen försiggå i närvaro av ett icke vattenhaltigt svällningsmedel, som beskrives närmare nedan.The degree of curing can be considered sufficient when the polymer particles in water swell to 5-100-fold volume or more, but as a unit particle retain the nearest spherical shape even when they settle to an aqueous environment. There must be free spaces between the particles, filled only with the aqueous phase. With too little curing, the particles are deformed during the deposition so that no interstices are formed, while with too strong curing no or only a small swelling occurs, for example to less than double the initial volume. A curing with a particularly large-scale space branching can be achieved by allowing the polymerization to take place in the presence of a non-aqueous swelling agent, which is described in more detail below.
Pâ grund av epoxidgruppernas hydrolyskänslighet utfö- res polymerisationen i så vattenfritt medium som möjligt. Vid en vattenhalt av exempelvis l% i monomerfasen uppträder i all- mänhet ingen nämnvärd hydrolysering av epoxidgrupperna, men vattenhalten måste å andra sidan hållas under den gräns, vid vilken en märkbar andel av de för enzymbildningen nödvändiga, reaktiva grupperna hydrolyseras. Denna gräns ligger olika högt i beroende av de reaktiva gruppernas vattenkänslighet och i regel mellan 2 och 5 volymprocent. I huvudsak är det 10 15 20 25 30 35 40 7310177-6 9 att föredraga att arbeta i fullständig frånvaro av vatten.Due to the hydrolysis sensitivity of the epoxide groups, the polymerization is carried out in as anhydrous medium as possible. At a water content of, for example, 1% in the monomer phase, no appreciable hydrolysis of the epoxide groups generally occurs, but the water content must, on the other hand, be kept below the limit at which a appreciable proportion of the reactive groups necessary for enzyme formation are hydrolyzed. This limit is differently high depending on the water sensitivity of the reactive groups and usually between 2 and 5% by volume. In essence, it is preferable to work in the complete absence of water.
Formingen av härdade, kulformade delar hos bärarmate- rialet med snäv partikelstorleksfördelning ernås genom ett speciellt förfarande för pärlpolymerisationen, vid vilket ett starkt opolärt, organiskt medium, som ej är något bra lös- ningsmedel för monomererna som skall polymeriseras, användes som kontinuerlig fas. Som sådana lämpar sig särskilt alifa- tiska kolväten, främst sådana med 8 och flera kolatomer i molekylen.The formation of cured, spherical parts of the support material with a narrow particle size distribution is achieved by a special bead polymerization process in which a strongly non-polar organic medium, which is not a good solvent for the monomers to be polymerized, is used as a continuous phase. Aliphatic hydrocarbons are particularly suitable as such, mainly those with 8 and more carbon atoms in the molecule.
En tydlig polaritetsskillnad mellan monomerfasen och den kontinuerliga fasen är en förutsättning för att överhuvud- taget en faselning sker och monomerblandningen vid början av polymerisationen föreligger i diskreta små droppar. Endast under denna förutsättning uppstår kulformade polymerpartiklar med enhetlig storlek. Ju mindre polära de deltagande monome- rerna är, desto större är deras benägenhet att åtminstone del- vis lösa sig i det opolära mediet. Denna benägenhet kan mot- verkas genom att man späder monomerfasen med goda lösnings- medel för monomererna, som ej är blandbara med det opolära, organiska mediet, exempelvis formamid, dimetylformamid eller dimetylsulfoxid, i mängder av exempelvis 20 till 200 viktpro- cent räknat på monomermängden. Denna åtgärd bidrar samtidigt till en stormaskig rymdförgrening och en god svällbarhet hos polymererna. En begränsad löslighet av monomererna i den kon- tinuerliga, organiska fasen är ej störande då polymerisatio- nen av denna monomerdel i den kontinuerliga fasen är uteslu- ten. I den utsträckning, som monomererna i de små dropparna reagerar genom polymerisationen, kan då nämligen en âterdiffu- sion av de lösta monomererna till dropparna uppträda. Därför användes företrädesvis polymerisationsinitiatorer, som i ringa grad löser sig i det organiska mediet.A clear polarity difference between the monomer phase and the continuous phase is a prerequisite for a phase precipitation to occur at all and the monomer mixture at the beginning of the polymerization is present in discrete droplets. Only under this condition do spherical polymer particles of uniform size occur. The less polar the participating monomers are, the greater their tendency to dissolve, at least in part, in the non-polar medium. This tendency can be counteracted by diluting the monomer phase with good solvents for the monomers which are immiscible with the non-polar organic medium, for example formamide, dimethylformamide or dimethylsulfoxide, in amounts of, for example, 20 to 200% by weight based on the amount of monomer. . This measure also contributes to a large-mesh space branch and a good swellability of the polymers. A limited solubility of the monomers in the continuous organic phase is not disturbing as the polymerization of this monomer moiety in the continuous phase is excluded. To the extent that the monomers in the droplets react through the polymerization, a re-diffusion of the dissolved monomers into the droplets can then occur. Therefore, polymerization initiators which dissolve to a small extent in the organic medium are preferably used.
Monomerblandningen fördelas i det organiska mediet ge- nom kraftig omrörning till små droppar. För att upprätthålla det genom omrörningen åstadkomna fördelningstillståndet av mo- nomerfasen - som eventuellt kan innehålla lösningsmedel - un- der hela polymerisationsförloppet, användes dessutom ett dis- pergeringsmedel, som är lösligt i den opolära, organiska fa- sen. För detta ändamål ägnar sig statistiska sampolymerisat eller segment- eller ymppolymerisat, som är uppbyggda av be- ståndsdelar med olika polaritet. Statistiska sampolymerisat 7310177-6 10 15 20 25 30 35 40 10 av en övervägande andel, exempelvis 60-95 grundmolprocent av en opolär, lângkedjiga alkylrester innehållande monomer, som akryl- eller metakrylsyraestrar av elkylalkoholer med åtmins- tone 4 kolatomer i alkylresten, vinylestrar med minst 4 kol- atomer innehållande fettsyror osv., och till övriga delen av polära, vattenlösliga monomerer, såsom metakryloyl-kolinklo- rid, dimetylaminetylmetakrylat, dess salter med oorganiska eller organiska syror, akryl- eller metakrylsyra eller akryl- eller metakrylamid, har*en god dispergeringsverkan. Man kan emellertid även använda enligt kända metoder framställda ymp- eller segmentpolymerisat, i vilka monomerer av de båda nämn- da slagen ej är statistiskt fördelade utan skilda från var- andra i olika molekylblock eller i baskedjan och sidokedjan av ett ymppolymerisat. Dispergeringsmedlen förmår redan,i en mängd av 0,02%,räknat på vikten av den kontinuerliga fasen, upprätthålla suspensionstillståndet till polymerisationens slut. Ju större mängden dispergeringsmedel väljes och ju kraftigare omrörningen sker, desto mindre delar bildas. Man eftersträvar en partikelstorlek av 0,1 till 1 mm i osvällt tillstånd.The monomer mixture is distributed in the organic medium by vigorous stirring into small drops. In order to maintain the state of distribution of the monomer phase - which may possibly contain solvents - brought about by the stirring during the entire polymerization process, a dispersant which is soluble in the non-polar organic phase is also used. For this purpose, random copolymers or block or graft polymers are used, which are composed of constituents of different polarity. Statistical copolymers 7310177-6 10 15 20 25 30 35 40 10 of a predominant proportion, for example 60-95 base mole percent of a non-polar, long chain alkyl radical containing monomer, such as acrylic or methacrylic acid esters of alkyl alkyl alcohols having at least 4 carbon atoms in the alkyl radical, vinyl esters with at least 4 carbon atoms containing fatty acids, etc., and to the rest of the polar, water-soluble monomers, such as methacryloylcholine chloride, dimethylaminethyl methacrylate, its salts with inorganic or organic acids, acrylic or methacrylic acid or acrylic or methacrylamide, good dispersion effect. However, it is also possible to use graft or block polymers prepared according to known methods, in which monomers of the two mentioned types are not statistically distributed but differ from each other in different molecular blocks or in the base chain and the side chain of a graft polymer. The dispersants are already able, in an amount of 0.02%, based on the weight of the continuous phase, to maintain the suspension state until the end of the polymerization. The larger the amount of dispersant selected and the more vigorous stirring, the smaller parts are formed. A particle size of 0.1 to 1 mm is sought in the unsoiled state.
Förhållandet mellan monomerfasen - med eller utan till- sats av ett lösningsmedel - och den kontinuerliga fasen kan ligga mellan l:l och l:l0, men förhållandet mellan l:l,5 och 1:4 är att föredra. Fördelningstillstândets stabilitet blir större ju mindre täthetsskillnaden mellan de båda faserna är.The ratio between the monomer phase - with or without the addition of a solvent - and the continuous phase may be between 1: 1 and 1: 10, but the ratio between 1: 1, 5 and 1: 4 is preferred. The smaller the density difference between the two phases, the greater the stability of the distribution state.
Den kontinuerliga fasens täthet kan anpassas genom tillsats av halogenkolväten, såsom perkloretylen, trikloretylen, klor- form eller koltetraklorid, till den mestadels större och un- der förloppet av polymerisationsförfarandet ytterligare till- tagande tätheten av monomerfasen.The density of the continuous phase can be adjusted by adding halogenated hydrocarbons, such as perchlorethylene, trichlorethylene, chloroform or carbon tetrachloride, to the mostly larger and during the course of the polymerization process further increasing the density of the monomer phase.
Polymerisationen igångsättes med en i monomerfasen lättlöslig och i den kontinuerliga fasen möjligast svårlös- lig, radikalbildande initiator, exempelvis azobis-cyanvale- riansyra. Med denna initiator inträder polymerisationen vid temperaturer av 50 till 80°C, vilket innebär den nackdelen att monomerernas löslighet i den kontinuerliga fasen vid des- sa temperaturer blir olämpligt hög så att risk för en fäll- ningspolymerisation föreligger. Det är därför att föredraga att utlösa polymerisationen vid lägre temperatur, exempelvis 15 till 30°C, medelst ett redoxinitiatorsystem. Ett lämpligt 10 15 20 25 30 35 40 7310177-6 ll sådant är bensoylperoxid/dimetylani1in. Vid god omrörning och värmeavledning kan polymerisationen vara avslutad på 1 till 3 timmar. Polymerisationspärlorna avskiljes genom filt- rering av den kontinuerliga fasen och eventuellt sker rening av vidhäftande rester av den flytande fasen genom tvättning med ett vattenfritt lösningsmedel. Om pärlorna har fram- ställts i närvaro av formamid, dimetylformamid eller dimetyl- sulfoxid,så avlägsnas dessa lösningsmedel i allmänhet inte från de med dessa svällda pärlorna,utan dessa får reagera i det erhållna fuktiga tillståndet med den vattenhaltiga enzym- lösningen. Det är t.o.m. fördelaktigt att svälla pärlorna före reaktionen med sådana lösningsmedel, när de ej medanvän- des vid polymerisationen.The polymerization is initiated with a radical-forming initiator which is readily soluble in the monomer phase and in the continuous phase as difficult as possible, for example azobis-cyanovaleric acid. With this initiator, the polymerization occurs at temperatures of 50 to 80 ° C, which means the disadvantage that the solubility of the monomers in the continuous phase at these temperatures becomes inappropriately high, so that there is a risk of a precipitation polymerization. It is therefore preferable to trigger the polymerization at a lower temperature, for example 15 to 30 ° C, by means of a redox initiator system. A suitable one is benzoyl peroxide / dimethylaniline. With good stirring and heat dissipation, the polymerization can be completed in 1 to 3 hours. The polymerization beads are separated by filtration of the continuous phase and, if appropriate, purification of adhesive residues of the liquid phase is carried out by washing with an anhydrous solvent. If the beads have been prepared in the presence of formamide, dimethylformamide or dimethylsulfoxide, these solvents are generally not removed from those with these swollen beads, but are allowed to react in the resulting moist state with the aqueous enzyme solution. It is t.o.m. it is advantageous to swell the beads before the reaction with such solvents, when they are not used in the polymerization.
Reaktionen med den vattenhaltiga enzymlösningen bildar en konkurrensreaktion mellan den önskade kovalenta bindning- en av det biologiskt aktiva ämnet och den icke önskade hydro- lysen av epoxidgrupperna. Ju högre koncentrationen av det biologiskt aktiva ämnet i den vattenhaltiga lösningen ligger, desto gynnsammare är därvid den önskade fixeringen. Lösning- arna skall vara så fria som möjligt från inaktiva följdpro- teiner eller andra hydroxyl- eller aminogrupphaltiga ämnen, som annars kan bindas till bärarmaterialet. Om inte ett bestämt pH-omrâde måste innehållas för upprätthållandet av aktiviteten låter man reaktionen med de biologiskt aktiva substanserna ske vid pH = 5 - 8, företrädesvis vid tempera- turer av 0-30°C. Reaktionen kommer igång i den utsträckning som polymerisatpärlorna sväller i vatten. Efter en reaktions- tid av några timmer till nâgra dagar under svag omrörning har den största delen av enzymet bundits och överskottet aktiva 'grupper hydrolyserats.The reaction with the aqueous enzyme solution forms a competitive reaction between the desired covalent bond of the biologically active substance and the undesired hydrolysis of the epoxide groups. The higher the concentration of the biologically active substance in the aqueous solution, the more favorable the desired fixation. The solutions must be as free as possible from inactive sequential proteins or other hydroxyl- or amino-group-containing substances, which can otherwise be bound to the carrier material. Unless a specific pH range must be contained to maintain the activity, the reaction with the biologically active substances is allowed to take place at pH = 5 - 8, preferably at temperatures of 0-30 ° C. The reaction is initiated to the extent that the polymer beads swell in water. After a reaction time of a few hours to a few days with gentle stirring, most of the enzyme has been bound and the excess active groups have been hydrolyzed.
Den största delen av de biologiskt aktiva ämnena binds i de stormaskiga "hålrummen“ i det inre av de svällda delar- na. Där skyddas de känsliga ämnena mot nedbrytning på grund av skjuvkrafter som kan uppträda vid omrörning eller vid höga strömningshastigheter i kolonnreaktorer, men är lätt tillgäng- liga för substratmolekyler. Endast extremt högmolekylära substrat angrips uppenbarligen till att börja med huvudsak- ligen av de på polymerisatytan bundna molekylerna och kan vid avtagande molekylstorlek reagera i tilltagande grad med de i det inre bundna ämnena. I den skyddade anordningen av enzym- 10 15 20 25 30 35 40 7310177-6 l2 molekylerna torde även orsaken till det bättre bibehållandet av enzymaktiviteten vid bindningen till polymerisatet, i jäm- förelse med på annat sätt uppbyggda enzymbärarämnen, ligga.Most of the biologically active substances are bound in the large-mesh "cavities" in the interior of the swollen parts, where the sensitive substances are protected against degradation due to shear forces that can occur during stirring or at high flow rates in column reactors, but are Only extremely high molecular weight substrates are apparently initially attacked mainly by the molecules bound to the polymerization surface and can, with decreasing molecular size, increasingly react with those in the internally bound substances. The molecules should also be the reason for the better maintenance of the enzyme activity during the binding to the polymer, in comparison with enzyme carriers which are constructed in a different way.
Dessa aktiveras oftast som fasta partiklar och binder enzy- met övervägande på ytan, där det lätt kan skadas genom skjuv- krafter. Vid bindningen av proteiner till ohärdade sampoly- merisat av maleinsyraanhydrid under samtidig härdning binds förmodligen enzymmolekyler även i bärpartiklarnas inre, men dessa blir genom efterföljande härdning så starkt inneslutna att en reaktion med substratmolekyler ej längre är möjlig.These are usually activated as solid particles and bind the enzyme predominantly on the surface, where it can easily be damaged by shear forces. In the binding of proteins to uncured copolymers of maleic anhydride during simultaneous curing, enzyme molecules are probably also bound in the interior of the carrier particles, but these become so strongly entrapped by subsequent curing that a reaction with substrate molecules is no longer possible.
Bland de biologiskt aktiva substanser, som kan bindas till de pärlformiga bärarna enligt uppfinningen, är främst enzymerna, särskilt hydrolas av betydelse. Som exempel på lämpliga enzymer kan främst nämnas proteaser, såsom svamp- och bakterieprocesser, trypsin, kymotrypsin, pankreatin samt amylaser, ribonukleaser, desoxiribonukleaser osv. De bundna enzymernas höga aktivitet i förhållande till högmole- kylära substrat är särskilt påtaglig.Among the biologically active substances which can be bound to the beaded carriers according to the invention, the enzymes, in particular hydrolase, are of particular importance. Examples of suitable enzymes are mainly proteases, such as fungal and bacterial processes, trypsin, chymotrypsin, pancreatin and amylases, ribonucleases, deoxyribonucleases, etc. The high activity of the bound enzymes in relation to high molecular weight substrates is particularly noticeable.
Medelst bundna enzymsubstrater eller -inhibitorer kan i vattenhaltiga media lösta eller i biologiska material in- gående enzymer selektivt avlägsnas eller göras overksamma.By means of bound enzyme substrates or inhibitors, enzymes dissolved in aqueous media or enzymes contained in biological materials can be selectively removed or rendered inactive.
Genom ändring av pH-värdet eller elektrolythalten hos det obundna mediet kan de upptagna enzymerna åter skiljas från de bärarbundna substraten och på detta sätt renisoleras. De talrika ytterligare möjligheterna att påverka biologiska sys- tems reaktioner på bärarbundna hormoner, såsom insulin eller hypertensin, eller entibiotika, såsom ampicillin eller anti- kroppar, antigener, biogena aminer och diverse peptider, må här omnämnas. Även blandningar av olika biologiskt aktiva substanser kan samtidigt bindas. Biologiskt aktiva substan- ser, som i fritt tillstånd skulle störa varandras verkan, kan skilda från varandra bindas vid bärarsubstanser enligt uppfinningen, varefter de erhållna produkterna blandas och blandningen användes. , De med biologiskt aktiva substanser reagerade bärarna innehåller i typiska fall 5 till 50, företrädesvis 10 till 30 viktprocent bundet material, räknat på torrsubstansen av bärare och biologiskt material. Produkterna föreligger i vatten som gelëartade, kulformade partiklar med vanligen 1 till 5 mm diameter. Till följd av sin starka svällning har 10 15 20 25 30 35 7310177-6 13 de en från vattenhaltigt.medium endast obetydligt avvikande täthet, så att de genom endast svag omrörning kan hållas i suspension. Vid användningen som kolonn- eller reaktorfyll- ning begränsas substratlösningens genomloppshastighet endast genom substratets diffusionshastighet.By changing the pH or electrolyte content of the unbound medium, the taken up enzymes can be separated from the carrier-bound substrates again and in this way re-insulated. The numerous additional possibilities for influencing biological system reactions to carrier-bound hormones, such as insulin or hypertensin, or antibiotics, such as ampicillin or antibodies, antigens, biogenic amines and various peptides, may be mentioned here. Mixtures of different biologically active substances can also be bound at the same time. Biologically active substances, which in the free state would interfere with each other's action, can be bound separately from each other to carrier substances according to the invention, after which the products obtained are mixed and the mixture is used. The carriers reacting with biologically active substances typically contain 5 to 50, preferably 10 to 30% by weight of bound material, based on the dry matter of carriers and biological material. The products are present in water as gel-like, spherical particles, usually 1 to 5 mm in diameter. Due to their strong swelling, they have a density which differs from the aqueous medium only slightly, so that they can be kept in suspension by only slight stirring. When used as a column or reactor filling, the flow rate of the substrate solution is limited only by the diffusion rate of the substrate.
Det bundna, biologiskt aktiva materialets aktivitets- förlust vid användning och lagring är klart mindre än vid lagring av de icke bundna substanserna under samma betingel- ser. Därigenom är genom ofta upprepad återanvändning vid an- vändning beskickningsvis eller genom läng livslängd vid kon- tinuerlig användning en väsentligt högre utnyttjning av den biologiska aktiviteten möjligt än vad som är fallet vid an- vändningen av de obundna substanserna.The loss of activity of the bound, biologically active material during use and storage is clearly less than when storing the unbound substances under the same conditions. As a result, through frequent repeated re-use during use or through long service life during continuous use, a significantly higher utilization of the biological activity is possible than is the case with the use of the unbound substances.
Som exempel på den förenkling av förfarandet, som är möjlig genom bärarbundna enzymer, kan isoleringen av nuklein- syror ur biologiskt material nämnas. Som svâravskiljbara följdämnen uppträder framför allt proteiner. De har hit- tills måst bortskaffas genom besvärliga extraktionsförfaran- den med fenol. De kan visserligen även nedbrytas med lösli- ga proteolytiska enzymer, men dessa enzymer är själva protei- ner, som likaså i sin tur måste avlägsnas genom fenolextrak- tion. Med en bärarbunden proteas kan proteinerna lätt och fullständigt nedbrytas. Efter avfiltrering av det bärarbund- na enzymet innehåller substratlösningen förutom nukleinsyror- na ej längre nâgra högmolekylära beståndsdelar. Själva nu- kleinsyrorna uppdelas vanligen enligt kända förfaranden 1 ribonukleinsyra och desoxitibonukleinsyra. Även därvid för- orsakade det restlösa bortskaffandet av de andra komponen- terna ett avsevärt arbete. Medelst bärarbunden ribonukleas kan nu rester av ribonukleinsyra avlägsnas från desoxiribo- nukleinsyrefraktionen. Omvänt kan man utvinna ribonuklein- syra av desoxiribonukleinsyra om man behandlar den med bärar- bunden desoxiribonukleas.As an example of the simplification of the process, which is possible by carrier-bound enzymes, the isolation of nucleic acids from biological material can be mentioned. Proteins in particular are difficult to separate. They have hitherto had to be disposed of by cumbersome phenol extraction procedures. Although they can also be degraded with soluble proteolytic enzymes, these enzymes are proteins themselves, which in turn must also be removed by phenol extraction. With a carrier-bound protease, the proteins can be easily and completely degraded. After filtering off the carrier-bound enzyme, in addition to the nucleic acids, the substrate solution no longer contains any high-molecular constituents. The nucleic acids themselves are usually divided according to known methods into ribonucleic acid and deoxythibonucleic acid. Even then, the residual disposal of the other components caused considerable work. By means of carrier-bound ribonuclease, residues of ribonucleic acid can now be removed from the deoxyribonucleic acid fraction. Conversely, ribonucleic acid can be recovered from deoxyribonucleic acid if treated with carrier-bound deoxyribonuclease.
Framställning av pärlformiga bärarpolymerisat Exempel l I en rundkolv (500 ml) införes 87 g n-heptan, 55 g perkloretylen och 0,1 g av emulgator (statist. kopolymerisat n-butylmetakrylat/metakryloylkolinklorid 95/5). Efter av- kylning 1-.111 2o°c tillsättes följande lösning:Preparation of beaded carrier polymers Example 1 Into a round bottom flask (500 ml) are introduced 87 g of n-heptane, 55 g of perchlorethylene and 0.1 g of emulsifier (statistical copolymer of n-butyl methacrylate / methacryloylcholine chloride 95/5). After cooling to -111 ° C, the following solution is added:
Claims (6)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2237316A DE2237316C3 (en) | 1972-07-29 | 1972-07-29 | Process for the production of bead-shaped, crosslinked, water-insoluble copolymers and their use |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SE410737B true SE410737B (en) | 1979-10-29 |
Family
ID=5852062
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SE7310177A SE410737B (en) | 1972-07-29 | 1973-07-20 | PEARLY, IN THE WATER SWELLABLE COPOLYMERISAT AS CARRIER FOR BIOLOGICAL ACTIVE SUBSTANCES, WHICH COPOLYMERISAT CONTAINS EPOXY GROUPS |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5625921B2 (en) |
CH (1) | CH587866A5 (en) |
FR (1) | FR2194726B1 (en) |
GB (1) | GB1431940A (en) |
SE (1) | SE410737B (en) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3306009C2 (en) * | 1983-02-22 | 1994-02-17 | Roehm Gmbh | Process for the preparation of protein hydrolyzates |
GB2184732B (en) * | 1985-12-26 | 1990-07-11 | Showa Denko Kk | Active support substance and adsorbent for chromatography |
US5310786A (en) * | 1987-01-08 | 1994-05-10 | Hoechst Aktiengesellschaft | Reversibly precipitable, water-soluble polymer conjugates |
DE3827867A1 (en) * | 1988-08-17 | 1990-02-22 | Hoechst Ag | METHOD FOR PRODUCING CYCLIC UREAS |
DE4142319A1 (en) * | 1991-12-20 | 1993-06-24 | Henkel Kgaa | wound antiseptic |
CN100494233C (en) * | 2005-12-14 | 2009-06-03 | 中国科学院大连化学物理研究所 | Porous integrated substrate of carrying protein solid and its preparation |
CN101470052B (en) * | 2007-12-28 | 2012-04-18 | 中国科学院大连化学物理研究所 | Protein collection and enzymolysis integrated sample pretreatment apparatus and its production |
AU2021395708A1 (en) * | 2020-12-07 | 2023-07-06 | Allarta Life Science Inc. | Reactive microparticles and their use to prepare functional hydrogel particles |
-
1973
- 1973-07-17 CH CH1040473A patent/CH587866A5/xx not_active IP Right Cessation
- 1973-07-20 SE SE7310177A patent/SE410737B/en unknown
- 1973-07-27 FR FR7327590A patent/FR2194726B1/fr not_active Expired
- 1973-07-30 JP JP8576273A patent/JPS5625921B2/ja not_active Expired
- 1973-07-30 GB GB3621873A patent/GB1431940A/en not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS5625921B2 (en) | 1981-06-16 |
FR2194726B1 (en) | 1978-09-15 |
CH587866A5 (en) | 1977-05-13 |
FR2194726A1 (en) | 1974-03-01 |
GB1431940A (en) | 1976-04-14 |
JPS4953678A (en) | 1974-05-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4070348A (en) | Water-swellable, bead copolymer | |
US4208309A (en) | Pearl polymer containing hollow pearls | |
US5914367A (en) | Polymer protein composites and methods for their preparation and use | |
US7381552B2 (en) | Macroporous material in the form of plastic pearls | |
US6291582B1 (en) | Polymer-protein composites and methods for their preparation and use | |
US4044196A (en) | Crosslinked copolymers of α,β-olefinically unsaturated dicarboxylic anhydrides | |
US4190713A (en) | Pearl polymer containing hollow pearls | |
US4568706A (en) | Macroporous bead polymers, a process for their preparation and their use | |
CA1036745A (en) | Water-insoluble preparations of peptide materials, their production and their use | |
EP0335703B1 (en) | Hydrophilic fine gel particles and process for production thereof | |
US5079156A (en) | Carrier bonded enzymes and a process for their preparation | |
US7011963B1 (en) | Process for synthesis of bead-shaped cross-linked hydrophilic support polymer | |
Turková | [6] Immobilization of enzymes on hydroxyalkyl methacrylate gel | |
US4542069A (en) | Vinylene carbonate polymers, a process for their preparation and their use | |
SE410737B (en) | PEARLY, IN THE WATER SWELLABLE COPOLYMERISAT AS CARRIER FOR BIOLOGICAL ACTIVE SUBSTANCES, WHICH COPOLYMERISAT CONTAINS EPOXY GROUPS | |
JPH0816135B2 (en) | Carrier for immobilization of biologically active substances | |
US3910825A (en) | Water-insoluble peptide materials | |
US20070259968A1 (en) | Macroporous Plastic Bead | |
JP2604339B2 (en) | Hydrophilic gel fine particles and method for producing the same | |
Kitano et al. | Isothiocyanato‐substituted hydrophilic polymer beads for immobilization of enzymes | |
CA1063296A (en) | Water-insoluble preparations of peptide material their production and their use | |
JPS59232102A (en) | Hydrophilic crosslinked copolymer | |
JPS59232104A (en) | Bead polymer and production thereof | |
MXPA00007605A (en) | Device for producing polymer support materials in the form of porous polymer beads | |
JPS58116683A (en) | Immobilized microbial cell or immobilized enzyme and its preparation |