SE1450612A1 - Assay för bestämning av antikoagulanter i blod eller blodplasma - Google Patents

Abstract

Analysmetod för bestämning av antikoagulanter i ett blod- eller blodplasmaprov, varvid analysmetoden innefattar analyser med minst två våtkemiska protrombintid (PT)-metoder. Analysmetoden innefattar att mäta PT i en första reaktionsblandning med en första PT-metod och att mäta PT i en andra reaktionsblandning med en andra PT-metod, varvid koncentrationerna av blod eller blodplasma i den andra reaktionsblandningen skiljer sig från koncentrationen av blod eller blodplasma i den första reaktionsblandningen. PT-metoderna är kalibrerade att ge samma eller ungefär samma PT-resultat för referensprov som saknar antikoagulanter av intresse för analysmetoden. Vidare beräknas en skillnad i PT från mätningarna, varvid om skillnaden i PT är 1) signifikant, tyder detta på en närvaro av antikoagulanter i provet, eller 2) icke-signifikant, tyder detta på en frånvaro av antikoagulanter i en halt över detekterbar nivå i provet.

Description

Tekniskt omrade Detta dokument avser en analysmetod f6r bestamning av antikoagulanter i ett blod- eller blodplasmaprov.

Bakgrund Antikoagulanter är amnen som dampar, minskar eller upphaver blodets, eller blodplasmats, formaga att koagulera — antikoagulanter nninskar hastigheten med vilken fibrinogen omvandlas till fibrin.

En del antikoagulanter är naturligt forekommande, endogena, och spelar viktiga fysiologiska roller for att begransa insattandet, utbredningshastigheten och den rumsliga utvidgningen av blodkoagulation in vivo. Andra antikoagulanter upptrader under patologiska forhallanden. Det finns antikoagulanter som hittats i ormgifter och i exkretioner fran myggor, 15 iglar, fladdermoss och fast ingar. En vaxande grupp av antikoagulanter är tillverkade av manniskor i syfte att behandla och f6rhindra tromboemboliska sjukdomar.

Blodkoagulation är ett komplext fenomen som involverar en mangd interagerande nnolekyler som forekommer i blodplasma eller pa ytan av 20 involverade celler. Det finns manga cellulara och molekylara interaktioner, inkluderande manga enzymatiskt katalyserade reaktioner, som kan nedregleras eller avbrytas genom inverkan av antikoagulanter.

De direkt verkande antikoagulanterna hammar, hindrar eller upphaver den enzymatiska aktiviteten hos en eller bada av de kritiska enzymerna i 25 koagulationsprocessen, tronnbin (FIla) eller aktiverad koagulationsfaktor X (FXa). Indirekt verkande antikoagulanter arbetar pa ett nagot annat satt, varav ett satt är att forstarka kraften hos direkt verkande inhibitorer. Antikoagulanter som anvands terapeutiskt, heparin och vitamin-K antagonister ses som indirekt verkande antikoagulanter. Direkt verkande 30 antikoagulanter är hirudin (ett protein fran igeln) och de nyligen framtagna 2 inhibitorerna av Flla eller FXa. Det är dessa nya direkt verkande antikoagulanter, sarskilt de som kan administreras oralt, DOACs, som orsakar en djupgaende forandring inom klinisk- och laboratoriemedicin.

Det faktum att antikoagulanter har olika verkningssatt utgor en 5 utmaning for laboratoriemedicin att hitta pa metoder genom vilka antikoagulanterna kan bestammas. Till en viss grad har denna utmaning forvarrats av nyligen intraffade farmakologiska framgangar i att framstalla nya substanser for att behandla tromboemboliska sjukdomar, se t.ex. J. Harenburg, S. Marx och R. Kramer, Determination of the anticoagulation 10 effects of the new oral anticoagulants: an unmet need, Expert Review of Haematology, February 2012, Vol. 5, No. 1, Sid. 107-113.

Vid centrala sjukhuslaboratorier dar det finns en mangd olika tester tillgangligt och kvalificerad personal for att tolka resultaten ter sig detektion och bestamning av DOAC relativt okomplicerat — Flla-inhibitorer och FXa- 15 inhibitorer kan analyseras med respektive trombintid (TT)-tester eller FXatester. Om standardvarianter av dessa tester inte uppfyller behoven kommer flagon forandring eller "utspadning" av standardvarianten att g6ra det. Vid primarvardsenheter och pa platser inom sjukhus men pa avstand fran centrallaboratoriet, "off-site", är situationen annorlunda. Kannetecknande for 20 laboratoriemedicin vid vardenheter är att antalet olika laboratorietester är begransat eftersom det fysiska utrymmet for sadana laboratorier är begransat och eftersom tillgangen pa kvalificerad laboratoriepersonal är begransad. !nom koagulation är det mest tillgangliga testet vid ett primarvardscenter protrombintestet (PT-testet) med resultat uttryckta i INR (internationell 25 normaliserad kvot, en kvot mellan PT hos provet och en normal-PT normaliserad genom att upph6jas med normal iseringsexponent, ett kanslighetsindex). Andra "ordinarie" eller "vanliga" koagulationstester är aktiverad partiell tromboplastintid (APTT), aktiverad koagulationstid (ACT) och namnda TT. Det är forhoppningen hos visionara experter inom 30 koagulationsomradet att dessa "ordinarie" eller "vanliga" koagulationstester kan anpassas, modifieras, "spadas ut", for att uppfylla primarvardenheternas behov av att analysera de "nya" antikoagulanterna, sarskilt DOACS. Sadana tankar/forhoppningar uttrycks till exempel av E.J. Favaloro och G. Lippi, The 3 new oral anticoagulants and the future of haennostasis laboratory testing, Biochemia Medica 2012; 22(3):329-41.

Eftersom PT-INR är det vanligaste tillgangliga primarvardsenhetstestet for koagulationsmatningar är ett modifierat PT-test eller "utspadd PT" med 5 vilket DOAC kan bestammas mycket onskvart. Det finns arbete i sadan riktning rapporterat. Den laga kansligheten hos de fiesta PT-tester for direkta FXa-inhibitorer, sasom rivaroxaban, är 'Kant. C. Kluft visar i EP 2 405 274 Al att PT-tester som paverkas av ett visst ormgift, RVV-V, ocksa uppvisar kanslighet f6r rivaroxaban, och visar anvandningen av ett PT-test som 10 anvander sadana tromboplastiner.

F6rhoppningarna att finna ett satt att bestamma DOAC genom nagot PT-test, mod ifierat eller inte, har under de senaste aren minskat. I januari 2014 rapporterade T. Lindahl, en medlem av en expertgrupp i koagulation hos den externa kvalitetsorganisationen i Sverige, EQUALIS, studier utf6rda 15 av expertgruppen pa en FXa-inhiberande substans apixaban. Slutsatsen var att ingen av de manga kommersiellt tillgangliga PT eller APTT-testerna kunde anvandas f6r att bestamma apixaban vid kliniskt relevanta koncentrationer i blod plasma. FXa-tester fungerade a andra sidan bra for detta andarnal.

Anstrangningar for att korrigera PT-resultat for den variabla 20 antikoagulanteffekten hos icke-fungerande koagulationsfaktorer, pivka, som finns i blodet hos patienter som behandlas med vitamin-K antagonister, är berattigade att nannnas. US 7,767,459 B2 (J. Horsti) nnojliggor detta genom att mata PT i blodplasma med standardprotokollen hos vilken som heist given PT-metod, och mater ocksa detsamnna efter en for-spadning av plasmat med 25 en fysiologisk buffert sa som 9 g/I NaCI. PT-resultaten, uttryckt antingen i sekunder eller INR, plottas sedan mot graden av slutlig spadning av plasmat och extrapoleras till noll. PT hos plasmat vid slutlig spadning pa noll, minskat med det samma for ett normalplasma, tas som ett matt pa pivka-effekten och anvands for att korrigera det ursprungliga PT-resultatet.

Nya koagulationstester har tag its fram med syftet att bestamma flera olika typer av antikoagulanter, sarskilt hepariner och DOACs.

Dessa anstrangningar visar pa den kliniska betydelsen av att bestamma dessa antikoagulanter. 4 Se Calatzis A, Peletz D, Haas S, Spannagl M, Rudin K, Wilmer M, Prothrombinase-induced Clotting Time Assay for Determination of the Anticoagulant Effects of UFH and LMWH, Fondaparinux, och Thrombin Inhibitors, Am J Clin Pathol 2008; 130: 446-454, och Samanna MM, Martinoli 5 JL, LeFlem L, Guinet C, Plu-Bureau G, Depasse F, Assessment of laboratory assays to measure rivaroxaban — an oral, direct factor Xa inhibitor, Thromb Haemost 2010; 103/4: 815-825.

Relevant bakgrund till den aktuella uppfinningen är skillnaden mellan vatkemiska metoder och torrkemiska metoder. Vatkemi definieras genom 10 blandandet av en volym av provet, blod eller blodplasma i en koagulationsanalys, och en volym av reagens. Provet spads saledes till en viss grad i reaktionsblandningen. !nom torrkemi sker inte sadan spadning. Provet blandas, eller kontakteras, med reagenssubstans i torr form och dar sker ingen spadning av provet. De fiesta tester vid narsjukvardsenheter är 15 torrkemiska tester eftersom dessa ofta kan presenteras i ett latthanterligt format, t.ex. en remsa eller ett chip. Anvandaren behover typiskt satt bara tillsatta en liten volym av provet. En nackdel med torrkemiska metoder är att testerna är svarare att modifiera. En dimension av den frihet som erbjuds med vatkemiska forfaranden, graden av spadning av provet, är inte tillganglig 20 med torrkemi. Varje omnamnande av en "spadnings"-forandring av ett "reguljart" test har vatkemi som en nodvandig forutsattning.

Sammanfattning Ett andarnal är saledes att astadkomma en analysmetod f6r att 25 bestamma antikoagulanter i ett blod- eller blodplasmaprov, varvid analysmetoden involverar analyser med minst tva vatkemiska protrombintid (PT)-metoder, och vilken analysmetod är utformad att kunna tillampas for bestamning av bade direkta och indirekta antikoagulanter i blod- eller blodplasmaprover.

Uppfinningen definieras av det bifogade sjalvstandiga patentkravet.

Utforingsformer finns i de osjalvstandiga kraven, i de bifogade ritningarna och den foljande beskrivningen Enligt en forsta aspekt tillhandahalls en analysnnetod for bestannning av antikoagulanter i ett blod- eller blodplasnnaprov, varvid analysmetoden innefattar analyser med minst tva vatkenniska protronnbintid (PT)-metoder. Analysmetoden innefattar stegen att: a) i en forsta PT-analys med en forsta 5 PT-metod mata PT i en forsta reaktionsblandning innefattande en forsta volym blod eller blodplasma spadd i en forsta volym av ett vatskereagens, b) i en andra PT-analys med en andra PT-metod mata PT i en andra reaktionsblandning innefattande en andra volym av blodet eller blodplasmat spadd i en andra volym av vatskereagenset, varvid koncentrationen av blod 10 eller blodplasma i den andra reaktionsblandningen skiljer sig Than koncentrationen av blod eller blodplasma i den f6rsta reaktionsblandningen. De minst tva PT-metoderna är kalibrerade att ge samma eller ungefar samma PT-resultat nar de anvands f6r att analysera referensblod eller blodplasma som saknar antikoagulanter av intresse fOr analysmetoden. Analysmetoden 15 innefattar vidare steget att c) berakna en skillnad i PT Than matningarna i steg a) och b), varvid om skillnaden i PT är 1) signifikant, tyder detta pa en narvaro av antikoagulanter i blod- eller blodplasmaprovet, eller 2) icke-signifikant, tyder detta pa en franvaro av antikoagulanter i en halt over detekterbar niva i blod- eller blodplasmaprovet.

Med analyser med minst tva PT-metoder nnenas har att analysmetoden kan innefatta analyser med 2, 3, 4, 5 eller upp till 6 PT-metoder.

De minst tva PT-metoderna som anvands i analysmetoden kan vara fundamentalt olika PT-metoder, t.ex. skulle en PT-metod kunna vara en PTmetod av Quick-typ och den andra PT-metoden eller alternativt en eller flera 25 av de andra PT-metoderna skulle kunna vara av Owren-typ.

Aven om det inte ter sig praktiskt i nulaget skulle en av PT-metoderna till och med kunna vara en torrkemisk metod, men detta tanjer pa granserna f6r den aktuella uppfinningen.

De tva PT-metoderna som anvands i analysmetoden kan vara 30 fundamentalt samma PT-metod, men med nagon skillnad som kan uppfattas som icke-signifikant. Sadana skillnader, forutom skillnaden som tillhandahalls av uppfinningen, dvs. skillnad i kvot mellan provvolynn och reagensvolym, kan 6 vara skillnader i temperaturen vid vilken nnatningarna utfors och skillnader i jonstyrka eller pH hos reaktionsblandningen.

Med vatkemisk PT-metod avses har PT-metoder av Quick-typ eller Owren-typ.

Kvoten mellan volymen blod eller blodplasma och volymen vatskereagens i reaktionsblandningen kan variera beroende pa vilken typ av PT-metod som anvands i analysnnetoden, dvs. PT-metod av Quick-typ eller Owren-typ, och koncentrationen i provet av antikoagulanten som ska detekteras. Ett vatskereagens f6r PT-metoden av Quick-typ innehaller inget 10 fibrinogen och har darfor en inbyggd begransning i hur mycket provet kan spadas ut. Detta eftersom koagulationen som ska registreras är omvandlingen av provfibrinogen, dispergerad i reaktionsblandningen, till fibrin. F6r att denna omvandling ska vara markbar maste fibrinogenet i reaktionsblandningen vara Over flagon praktisk grans, sag Over cirka 0,1 g/L. 15 Foljaktligen kan inte blod- eller blodplasmaprovet spadas mer an cirka tio ganger i vatskereagens, da blod och blodplasma ofta innehaller fibrinogenkoncentrationer pa 1 g/L eller mindre.

Vid utforande av uppfinningen med PT-metoder av Quick-typ, kan den tillatna kvoten mellan volymen blod eller blodplasma och volymen 20 vatskereagens i reaktionsblandningen varieras mellan 1:2 och 1:10.

Dessutom sa satts liknande begransningar som de som satts av narvaro av fibrinogen ocksa av FV (faktor V). FV nnaste forekonnnna i reaktionsblandningen i verksamma nivaer. Eftersom FV inte ingar i PTvatskereagenset for en PT-metod av Quick-typ maste FV komma fran sjalva 25 blod- eller blodplasmaprovet.

Nar en PT-metod av Owren-typ anvands f6r att utf6ra analysmetoden satts inga begransningar av fibrinogen eller FV eftersom vatskereagenset, f6rutom tromboplastin, ocksa innehaller verksamma nivaer av dessa. Emellertid finns det praktiska begransningar i slutlig spadning av provet med 30 vatskereagenset som anvands i PT-metoder av Owren-typ pa grund av reaktionshastigheter. Vid mycket sma volymer av blod- eller blodplasmaprov i reaktionsblandningen kommer halterna av FVII, FX och Fll vara sa laga att koagulationstiden (PT) blir sa lang att detektion blir svart eller omOjligt. Med 7 PT-nnetoden av Owren-typ är den lagre nivan av blod- eller blodplasmaprovspadning i ett vatskereagens cirka 1:2, vilket är samma som med PT-metoden av Quick-typ, men den hogsta mojliga spadningen kommer att vara betydligt hogre, cirka 1:200. Foljaktligen kan, nar uppfinningen 5 praktiseras med PT-metoden av Owren-typ, kvoten mellan volymen blod eller blodplasma och volymen vatskereagens i reaktionsblandningen varieras mellan 1:2 och 1:200. Ett foredraget kvotomrade kan vara mellan 1:5 och 1:100 eller mellan 1:10 och 1:50.

I den aktuella analysmetoden analyseras PT i minst tva 10 reaktionsblandningar som har olika koncentrationer av blod eller blodplasma i reaktionsblandningarna. Skillnaden i koncentration i blod eller blodplasma i reaktionsblandningarna nar PT-metoden av Owren-typ anvands i analysmetoden kan vara cirka 1,5 till 100 ganger, 1,5 till 50 ganger, 1,5 till 25 ganger, 1,5 till 10 ganger eller 1,5 till 5 ganger. En skillnad i koncentration pa 15 1,5 till 5 ganger är praktiskt att uppna och är med den aktuella analysmetoden visat att mojliggora bestamning av antikoagulanter i kliniskt relevanta koncentrationsomraden.

Skillnaden i koncentration av blod eller blodplasma i reaktionsblandningen nar PT-metoden av Quick-typ anvands kan vara cirka 1,5 till 5 ganger, 1,5 till 4 ganger, 1,5 till 3 ganger eller 1,5 till 2 ganger.

Trots skillnaden i blod- eller blodplasmakoncentration i reaktionsblandningen är alla tva eller flera olika PT-nnetoder i analysmetoden kalibrerade for att ge, med relevanta referensblod- eller referensblodplasmaprover som saknar antikoagulanten av intresse, samma 25 eller ungefar samma PT-resultat. PT uttrycks pa ett sadant satt att detta är mojligt. Uttryck i van liga tidsenheter kommer inte att fungera da dessa kommer att variera. En reaktionsblandning med en lag koncentration av blod eller blodplasma visar langa PT och vice versa. Ett naturligt satt att uttrycka PT är i INR (internationaliserad normaliserad kvot), men andra uttryckssatt, 30 olika syntetiska tidsliknande enheter, eller kvoter av sadana, är mojliga. Viktigt är att ett givet relevant prov som saknar antikoagulant/antikoagulanter, analyserat med tva eller flera PT-metoder, kommer att ge sa nara som mojligt samma resultat. Ett naturligt satt att jamfOra resultaten Than en PT-metod med 8 en annan är nned nnedel-PT-resultat och nned CV (variationskoefficient) for jamforelsen. Kalibreringen är sadan att det genomsnittliga PT-resultatet for flera relevanta prov som saknar antikoagulant sa nara som mojligt ska vara samma for alla de tva eller flera PT-metoderna, och CV for jamforelsen ska 5 vara sa lagt som mojligt.

De minst tva PT-metoderna kan kalibreras sa att PT-metoderna ger samma eller ungefar samma PT-resultat nar de anvands for att analysera referensblod eller referensblodplasma fran en normal individ och spadningar av sadant referensblod eller referensblodplasma. Med blod eller blodplasma 10 fran en normal individ avses har blod eller blodplasma tan en eller flera normala personer eller en pool av nornnala individer som inte star under flagon antikoagulationsbehandling.

De minst tva PT-metoderna kan kalibreras fOr att visa samma eller ungefar samma PT-resultat nar de anvands fOr att analysera blod eller 15 blodplasma (fran en eller flera individer eller pool av prover Than olika individer) som saknar antikoagulanter av intresse fOr den aktuella analysmetoden och vilket blod eller blodplasma har ett PT-varde h6gre an normalt vilket faststallts med en eller flera etablerade PT-nnetoder.

I steg c) av analysmetoden beraknas en skillnad i PT mellan PT- 20 matningarna. Termerna "signifikant" och "icke-signifikant" ges har deras vedertagna statistiska definition. En signifikant skillnad är da en relativ skillnad pa 2 ganger CV eller nner, och en icke-signifikant skillnad är nnindre an 2 ganger CV.

Om skillnaden i PT beraknad i steg c) är signifikant och identiteten av 25 antikoagulanten är kand, kan koncentrationen av antikoagulanten i blod- eller blodplasmaprovet beraknas.

Om skillnaden i PT beraknad i steg c) är icke-signifikant och identiteten av antikoagulanten är kand, sa kan nivan Over vilken antikoagulanten inte forekommer i nannnda blod- eller blodplasmaprov bestammas.

Om skillnaden i PT beraknad i steg c) ar signifikant, är en uppskattad PT for blod- eller blodplasmaprovet i franvaro av antikoagulanter mojlig att berakna. 9 Berakning av antikoagulantkoncentrationen i ett blod- eller blodplasmaprov kan bara utforas om identiteten pa antikoagulanten är kand eller kan antas.

Om analyser med tva PT-metoder har utforts kan det vara lampligt att 5 anvanda skillnaden i PT-resultat och PT-resultatet Than analysen med den hogsta provspadningen for denna berakning. PT-resultatet vid den hogsta spadningen kommer att vara narmast PT-resultatet om det inte skulle forekomma nagra antikoagulanter. Genom att anvanda INR-formalism betecknas detta tankta PT-resultat INRo. INRo kan erhallas genom att 10 subtrahera en fraktion av skillnaden, eller subtrahera en funktion av skillnaden, beroende pa om dos-responsen for antikoagulantnivan är linjar eller ej. Eftersom dos-responsen kan bero pa denna INRo och pa temperaturen vid vilken bestamningarna har gjorts, kan omvandlingen av storleken pa skillnaden till antikoagulantkoncentration krava en mangd av sa 15 kallade standardkurvor. Alternativt kan en multidimensionell funktion anvandas for att berakna INRo och antikoagulantnivan.

Om analyser med mer an tva PT-metoder har utf6rts f6r att praktisera analysmetoden enligt uppfinningen kan mer an en skillnad beraknas och dessa flertalet skillnader, och PT-vardet erhallet vid den hogsta 20 provspadningen, kan anvandas f6r att berakna INRo och de mojliga antikoagulantnivaerna beroende pa identiteten av antikoagulanten. Det är ocksa nnojligt att favorisera en av skillnaderna som varande nnest anvandbar da den är i ett fordelaktigt omrade for bestamningarna.

Vatskereagenset kan innefatta tromboplastin, fibrinogen och 25 koagulationsfaktor V.

Vilket som heist PT-reagens kan anvandas for att utf6ra uppfinningen, men ett vatskereagens av Owren-typ, ett reagens innehallande tromboplastin, fibrinogen och FV, är att f6redra eftersom det mojliggor en kraftigare slutspadning av provet an nar ett PT-vatskereagens av Quick-typ anvands. 30 Detta är en egenskap som är vardefull vid applikationer vid narvardsenheter eftersom en mindre provvolym kan anvandas, t.ex. volymstorleken som latt erhallas vid ett fingerstick, dvs. blodvolymer i omradet 2 till 50 mikroliter.

PT-nnatningarna kan utforas vid en onngivningstemperatur fran 17°C till 45°C, foretradesvis fran 18°C till 30°C, mer foretradesvis fran 21 °C till 30 °C och mest foretradesvis Than 25 °C till 30 °C.

Antikoagulanterna som kan bestammas i den aktuella analysmetoden 5 är medlemmar av en grupp innefattande direktverkande inhibitorer av aktiverade koagulationsfaktorer Ila och Xa, vilka kan valjas ur en grupp innefattande dabigatran, apixaban, rivaroxaban eller hirudin, eller är medlemmar av en grupp innefattande indirekt verkande inhibitorer av aktiverade koagulationsfaktorer Ila och Xa, vilka kan valjas ur en grupp 10 innefattande fraktionerade eller ofraktionerade hepariner, lupusantikoagulanter eller antikroppar som hindrar aktiviteten av FVIII.

Den fOrsta volymen av vatskereagenset i den fOrsta reaktionsblandningen kan vara lika stor som den andra volymen av vatskereagenset i den andra reaktionsblandningen.

Volymen blod eller blodplasma som spads i vatskereagenset kan vara mellan 1 och 20 pl.

Volymen blod eller blodplasma kan tillsattas vatskereagenset med en ande till ande-kapillar.

Kort beskrivning av ritningarna Fig. 1 är en graf som visar apixabaninnehall matt med den aktuella analysmetoden i nornnalblodplasma.

Fig. 2 är en forstoring av en del av grafen i Fig. 1.

Fig. 3 är en graf som visar apixabaninnehall matt med den aktuella 25 analysmetoden in normalblodplasma (primardata: PT i sekunder) Fig. 4 är en f6rstoring av en del av grafen i Fig. 3.

Fig. 5 är en graf som visar apixabaninnehall matt med den aktuella analysmetoden i normalblod.

Fig. 6 är en forstoring av en del av grafen i Fig.5. 30 Fig. 7 är en graf som visar dabigatraninnehall matt med den aktuella analysmetoden i normalblod.

Fig. 8 är en forstoring av en del av grafen i Fig. 7 11 Fig. 9 är en graf sonn visar heparininnehall matt med den aktuella analysmetoden i normalblodplasma.

Fig. 10 är en f6rstoring av en del av grafen i Fig. 9.

Detaljerad beskrivning Exemplen nedan ges, inte for att beg ransa omfattningen av uppfinningen, utan for att ytterligare forklara och beskriva uppfinningen, och for att stimulera utvecklingen inom detta viktiga medicinsk-diagnostiska omrade. Experimentellt arbete utf6rdes med det kommersiellt tillgangliga 10 koagulationsinstrumentet Simple Simon PT Zafena AB, Borensberg, Sverige, f6r anvandning i omgivningsrumstemperatur med funktioner beskrivna i EP 1 636 595 B2. Ett instrument eller lasare anyandes for varje PT-metod. Alternativt kunde samma instrument anvandas f6r alla PT-metoder. Omgivningsrumstemperaturen varierade mellan 21°C och 26°C i det 15 laboratorium dar arbetet utf6rdes. Ett sadant temperaturinteryall, lagre men inte avlagset Than 30°C, är att foredra da temperaturen knappast paverkar PT, darmed forbattras precisionen hos den tillhandahallna PT-analysen. Dar till okar en lagre temperatur analysmetodens kanslighet fOr antikoagulanter i exemplen nedan. Analysmetoden är, emellertid, mojlig att utfora vid en 20 omgivningstemperatur Than 17 till 45°C.

PT-reagenset var det som levererades tillsammans med parti N233M av Simple Simon PT-produkten, ett reagens av Owren-typ sonn saledes innehaller verksamma mangder av tromboplastin, fibrinogen och FV (tromboplastinet med ursprung fran kaninhjarna och fibrinogenet och FV fran 25 blodplasma tan notkreatur). Andra reagenser av Owren-typ kunde ocksa anyandas.

Reagenset var i portioner pa 200 pl till vilket provet, citrerat blod eller citrerad plodplasma, tillsattes och blandades. Tillsatsen gjordes med en ande till ande-plastkapillar monterad pa ena anden av en tubular kropp med en 30 f6rskjutningsmekanism i den andra anden for att mojliggora behandig blandning av prov och reagens, sadana Mixxocaps med 10 pl-kapillarer tillhandahalls med Simple Simon PT-produkten. F6r att utfora de beskrivna experimenten var en del Mixxocaps utrustade med 20 pl-kapillarer, eller 5 pl- 12 kapillarer istallet for 10 pl-kapillarer med vilka de tillhandahalls av tillverkaren. Alternativt kan standardpipetter eller liknande anvandas for att blanda blodeller blodplasmaprovet med vatskereagenset.

Kvoterna mellan volymen blod eller blodplasma och vatskereagenset 5 som anvandes i experimenten var 1:11, 1:21 och 1:41. Andra kvoter som ligger mellan 1:5 och 1:100 kan anvandas.

Skillnaden i koncentration av blod eller blodplasma mellan de olika reaktionsblandningarna som anvandes i analysema i experimenten var mellan 1,5 till 5 ganger. Skillnaden i koncentration kan emellertid vara cirka 1,5 till 100 ganger.

Antikoagulerad normalplasma var NKP-produkten GHI-163 parti 10188, MediRox AB, Nykoping, Sverige. StamlOsningar av dabigatran (Pradaxa, Boehringer-lngelheim) och apixaban (Eliquis, Bristol-Myers Squibb) innehallande 100 mg/L var vanliga gavor -Iran Professor Tomas Lindahl vid 15 avdelningen for experimentell medicin vid Linkopings universitet. Ofraktionerat heparin var Heparin Leo pat A6888B, Leo Pharma A/S, Ballerup, Danmark.

Exempel 1 Apixaban är en direktverkande inhibitor av aktiverad koagulationsfaktor X (FXa). Det är den aktiva foreningen i den antitrombotiska medicinen Eliquis, Bristol-Myers Squibb. Det är av kliniskt intresse att mata apixaban i blodplasma i onnradet 50 till 1000 pg/L. For att forbereda lampliga prover tillsattes sma volymer av stamlosningen av apixaban till normalplasma, 25 kontrollplasmat NKP, for att ge normalplasma med apixabaninnehall i omradet 0 till 1000 pg/L. Dessa normalplasmor med apixaban, inkluderande det oblandade normalplasmat (NKP) och det samma spatt 1:2 i 9 g/L NaCL (NKP 1:2) analyserades alla med Simple Simon PT med provtillsatser pa 20 iut, 10 iut och 5 tL i 2001LEL reagens, och darmed med tre PT-metoder med 30 olika provinnehall i reaktionsblandningarna, i enlighet med uppfinningen. Det var vidare relevant att alla tre PT-metoder kalibrerades, i enlighet med uppfinningen, f6r att visa INR 1,000 for oblandat NKP, och INR 1,357 for NKP 1:2. Alla primara INR-varden, de resultat som visades pa 13 instrunnentskarnnarna (ett instrument eller lasare anyandes for varje PTmetod), var darfor onnvandlade till korrigerat/kalibrerat INRc med formeln a*INRexp(b) dar a och b valdes for att ge NKP och NKP 1:2 deras respektive onskade varden 1,000 och 1,357. INR-vardet for NKP 1:2 beraknades med 5 Lindahl et als formel for INR korresponderande med PT-aktivitet pa 50% (halften av 100% som likstalls med INR 1,000). Databehandlingen visas i tabell 1. Ovanfor de INR-kalibrerade kolumnerna (INRc) finns det ett ovre tal och ett nedre tal, vilka är de ovan namnda a respektive b. 31.P*012.11 1NR NR 1.31 W.Rc 0,94 1 .21 .!NRc 0237 NR.c., 111NR AM 0334 wait.

.J0 prov .19p4.proprov • 2.01.1..proy, 15;11 proy SLprov 2,17 appL_Iilii. 18,90 101..5p L. 3,12 N.R.a, 0,70 13.1:1 11,01,94 1,01 2.70223 3.00 7,14 1,21 1,0 000 77 22.2 5,07 1,02 1,07 3,70 0.07 1,01 .3 2,0,561,0 '2'1.39 0234 1,01 3. 1.67 1 24 1239 0, 0. 1,01 SC,t 1,2 1,:...1. ,.. 1.... 1.t.fs 0,24 0,07 1,02 1,0.0 0.00 0,00 1,00 NK.P 3:2 1 .0S0 .31.000 3.37 i 1237$ 3 27 12123( 11S7 Tabell 1 Tva matningar av apixabaninnehallet i normalplasmat visas, en mer kanslig matning, dar skillnaden i INRc ges av PT-metoder med 20p1 prov och 15 5p1 pray, och en mindre kanslig matning, INRc-skillnaden mellan 10p1 och med 5p1. Dessa INRc-skillnader plottas mot apixabaninnehallet hos normalplasnnat sasom visas i grafen i Fig. 1. De kvadratiska symbolerna är skillnaden i INRc mellan resultaten med 20p1-metoden och 5p1-metoden, och de runda symbolerna skillnaden i INRc mellan lOpl-metoden och 5p1- 20 metoden.

Det ska papekas att det är mojligt att uppskatta INR hos normalplasnnat i franyaro av antikoagulant, INRo. Ovan är detta gjort pa ett nnindre sofistikerat satt. En del (56%) av den nnindre INRc-skillnaden subtraheras fran INRc-resultatet fran 5p1-proymetoden, det resultat som 25 uppenbarligen ligger namnast INRo. Dessa enkla INRo-uppskattningar är 14 forvanansvart bra, da endast den med hogst apixaban-innehall (1000 pg/L) avviker med mer an en tiondel av en INR-enhet.

Fig. 1 och 2 visar grafer i vilken 6kningstakten vid matningarna av apixabaninnehall okar med innehallet. For de som emellertid 5 uppskattar/favoriserar linjara dos-respons-forhallanden, visas sadana forhallanden har av apixabanmatningar som är under en INR-enhet sasom visas i grafen i Fig. 2, dar Fig. 2 visar en f6rstoring av en del av grafen i Fig. 1.

Databehandlingen som visas i Fig. 1 och 2 skulle kunna vara 10 forbryllande for de som inte är fortrogna med bestamning av INR vid omgivningsrumstemperatur. IstaIlet for ett primart INR-resultat som har korrigerats fOr temperatureffekt genom berakningarna med instrumentet/lasaren, skulle vi istallet kunna titta pa PT i sekunder. Detta Ors fOr att Oka tydligheten vid beskrivningen av uppfinningen trots att ett fel 15 introduceras pa grund av att temperaturen inte är strikt konstant under tidsperioden under vilken analysmetoden utfordes (temperaturer varierade fran 22,3°C till 24,2°C). Trots denna paverkan är resultaten fortfarande tillrackligt bra for att vara overtygande, och forklarar mer tydligt, dã det mojliggor en databehandling som är kand for alla med kunskap inom 20 omradet, det vill saga berakning av INR genom att dividera PT (i sekunder) med ett normal-PT och upphoja kvoten med en normaliseringskonstant ekvivalent med ISI.

I tabell 2 visas resultaten fran analysmetoden for normalplasma (NKP) med tillsatt apixaban, men primardata är har i PT, i sekunder, och data 25 omvandlas till INRc genom division med PT hos nornnalplasma och genom att upphoja kvoten med en ISI, owe respektive och undre tal, visas ovanfor INRc-kolumnerna. Sonn bedornts relevant valjs det ovre talet sa att NKP 1:2 ska visa INRc 1,357.

OR!,-9121.F.1 WO: PT(' 20pt. prov PT (s) 1;.31 prov.! PT..$) 1s.a. prov 52.2 2,03. ?5.!'3':'S 20pi prov 27.0 1;22 -10t31.. prov $533 1,0? kNi.R.5; 5L prov 241,50_ NR 10p1-5$31. 5R 1500 I i 2 2553,37 0,7 .299 2.5'4 15,05.132 000 ?.. 01.72 0,57 1,32 1.07 2 72,9 7 S4 2,04 5,021,02 1,07 E•2,0 40,3 1.64 2:1:4 1,43 4,18.00.: 1,02 309 34.0 40.4 2.42 132,3,53 1,06 200 40 7 2 1,330,31 1:03 3.00 :;t9,0 49,1 1,1,02 0,.53 0,12 3.01 47,7 1,23. 1,02 1,04 0,19 0,04 1,02 0 22,0 1;21,00 1.0,00 0,00 1.06 .7.): 4133 1,09 14:1.99 NKP 1:2 ,:32,9 61,0 1,3S1 53307 Tabell 2 I tabell 2 har data paverkats av en tennperaturgradient Than 22,3 °C i 5 toppen till 24,2 °C i botten, vilket emellertid bara stor den generella bilden lite. PT-nnetoderna sonn anvandes, Owren-nnetoder i runnstemperatur, är nner kansliga for inhibitorer an andra, men det är fortfarande uppenbart att enbart en av de valda PT-metoderna inte skulle ge mycket anvandbar information vid lagre nivaer av apixaban. Anta att man anvander den mest 10 apixabankansliga av de tre, den med 20 pl prov, och man erhaller ett PT pa 35,2 sekunder. Detta är mer an det for en normal, 32,8 sekunder, men beror denna skillnad pa antikoagulanter eller är det bara pa grund av att provet har en liten forhojd PT (PT hos NKP 1:2 är 36,9 sekunder)? Hur kan man veta? Utovande av uppfinningen genom att utfora tva eller flera PT-metoder med 15 olika provinnehall i reaktionsblandningarna ger en tydligare bild, eftersom metoderna är kalibrerade for att visa samma INR om PT varierar av andra orsaker an koagulantinnehall, skulle det vara liten eller ingen skillnad, ingen signifikant skillnad, mellan INRc-resultaten. I det aktuella exemplet är det kant att proven innehaller antikoagulanten apixaban eftersom detta har tillsatts, 20 och en skillnad i INRc-resultat uppstar. I exemplet anvandes tre PT-metoder enligt uppfinningen, och det är tre skillnader i INRc-resultat som kan undersokas (tva av dessa tre visas i tabell 2), och for analysen av normalplasma med 50 pg/L apixaban, indikerar alla tre skillnaderna narvaron av antikoagulant. Om identiteten hos antikoagulanten är kand kan dess 25 innehall uppskattas. Ocksa det forvantade INRc for provet utan inhibitor, INRo, kan uppskattas. Tabell 2 som visar PT i sekunder klargor 16 uppfinningens anvandbarhet. Temperaturens inverkan, paverkar bara till en mindre grad de med hogst INR-varden, de hogst upp overdrivs med ca 10%, annars är data nastan identiskt med de som visas i den tidigare tabellen, inkluderande INRo-uppskattningarna.

I graferna i Fig. 3 och 4 har data fran tabell 2 forts in. INRc-skillnaderna är plottade mot apixabaninnehallet hos normalplasma (skillnad i INRc som ges av PT-metoder med 20p1 prov och 5pL prov (kvadrater), och INRcskillnader mellan 10p1 och med 5p1(prickar). Grafen i Fig. 4 är en forstoring av en del av grafen i Fig. 3.

Exempel 2 Apixaban Than 0 till 1000 pg/L tillsattes citrerat normalblod. Dessa blodprov och ett blodprov med ett INR pa 2,3 analyserades med Simple Simon PT anvandande provvolymer pa 20pL, 10pL och 5pL i 200pL reagens. 15 De primara resultaten i INR, och efter relevant kalibrering, INRc, visas i tabellen nedan, tabell 3: PPI_KftlYMINRINR mit20p L bid3,0pL.131:cf INR 5pL. bki 0,87 0,96 Nyte 2411_ bki 0,9:31 1; INFO. 10111. bid 1,01 1, 5[IL bld 4_INRc 20pL-51,IL AINRe 334.1L-51.1L 1, INFO 10068,763,2,21 6,94 3.69 2,51 4.43 1,18 0.74 7143,00276 1,87 4,88 2,80 2,06 2,80 0,73 0,91 5004,582.27 L:e6 3,73 2,29 1.61 1,92 81,09 22,611,64 1,32 2,18 1,60 1,39 0,79 0,21 1,07 11,71,32 1,13 14.9 1.26 1,16 0.32 0,1.02 631,411,19 1,04 1,21 1,12 1,06 0,0,06 0,% 01_,161.06 0,00 1,00 1,00 1.0,00 -0,01 N-E.00 0,371,161,06 0,99 Loo 1.E0 1,00 0.00 -0.01 C-bbd 2,32,702,27 2,02,2,2,0,00 0,00 Tabell 3 Har beslutades det, f6r alla tre PT-metoder, att normalblod utan tillsats 20 av apixaban skulle visa INRc 1,00, och ett citrerat blod, som av det centrala sjukhuslaboratoriet rapporterades visa INR 2,3 skulle har visa INRc 2,30. Precis som i tidigare exempel ses skillnaden i INRc-resultat som uppskattning av antikoagulantinnehall, har apixabaninnehall, och tva av tre mojliga sadana skillnader plottas mot det kanda apixabaninnehallet och visas i Fig. 5 och 6. 25 Skillnaden i INRc som ges av PT-metoderna med 20pL prov och 5pL prov 17 visas som kvadrater och INRc-skillnad mellan 10pL och med 5 pL som prickar. Grafen i Fig. 6 är en forstoring av en del av grafen i Fig. 5. Dos-respons hos antikoagulationsmetoden enligt uppfinningen visar bra, positiva dos-responsegenskaper over ett kliniskt intressant intervall for 5 apixaban i blod. Dos-responsen är aterigen linjar for skillnader i INRc pa mindre an en enhet, se Fig. 6.

Exempel 3 Dabigatran är den aktiva foreningen som bildas in vivo nar den 10 farmaceutiska beredningen innehallande Dabigatran-etexilat, Pradaxa, Boehringer-lngelheim, administreras per os, dvs. oralt. Kliniskt intressanta nivaer är Than 50 till 1000 pg/L i blodplasma. Sadana prov togs fram genonn att tillsatta sma volymer av stamlosning av dabigatran till normalblodplasma NKP. Resultat och databehandling, liknande den i Exempel 1, visas i tabell 4. dasig4tran :MR $31f1 01 INRC 1.32 IN.Rc 0,96 01;13 43Niztc 1 3ts:111-. 201.A. prov 19:4L prov 31. prov gpigeprov prov Sp. prov 201.0.54. INR0 2,39 10.021,51 0.22 3:7.00 6 362112 33:: 4,64 0,91 0,51. 3:33 2,3.f0 1,4$ 2,!3•3 1.:FO 1.57 1,6.1 ;133 1,04 35143 I IS :1.90 0,27 0,1.9 1,03 3i7 1.5? 1,26 0,50,14 0>90 1,13 1 134 1.06 5323 0,06 1,02 103„11: 1,24 1357 3:3' 5,15 0,02 1,03 52 1 (39 111,3,03 1131 0;0.02 0,00 1,039 1,00 0,00 0.00 13 0.000,00 $9KP 3. 1,63 1,0,0003 Tabell 4 Nar tabell 4 jamfors med tabell 1 i Exempel 1, verkar det som att den 20 visade utforingsformen av uppfinningen är mindre kanslig for dabigatran an for apixaban i normalplasma. Intrycket forstarks nar man jamfor graferna i Fig. 7 och 8 med korresponderande figurer for Exempel 1.

De kansligare INRc-skillnaderna (20pL minus 5pL, visade som kvadrater i Fig. 7 och 8) nar i den linjara delen av grafen (se Fig. 8, en 25 forstoring av en del av grafen i Fig. 7) 0,5 vid cirka 200 pg/L av dabigatran, medan det samma nas vid cirka 80 pg/L av apixaban, se Fig. 2, dvs. en mer 18 an tvafaldig skillnad i kanslighet. Ana' verkar dabigatrannivaer pa 50 pg/L vara detekterbara.

Uppenbarligen visar analysmetoden f6r att bestamma antikoagulanter olika kanslighet for olika antikoagulanter, och dessutonn forvantas olika 5 kanslighet med olika reagens, olika relevanta kalibreringar, och olika temperaturer vid vilka PT-analyserna utfors.

Exempel 4 Heparin är en antikoagulant som är trottsam att bestamma vid 10 narvardscentraler, sasom kirurgiska vardavdelningar. Mer lampliga metoder efterfragas. Anvandbarheten av den foreliggande uppfinningen exemplifieras nedan. Exemplet är med ofraktionerat heparin, som ofta anvands som antitrombotiskt agens vid omfattande kirurgi.

Prover forbereddes genom att tillsatta sma volymer av en stamlOsning 15 av heparin till normalplasma, NKP. Vid den valda kalibreringen sattes NKP och NKP 1:2 till INR 1,000 respektive INR 1,357, vilket var samma relevanta kalibrering som valdes i Exempel 1 och 3 ovan. Experimentella detaljer är de samma som i Exempel 1 och 3 och resultaten och databehandlingen visas i tabell 5.

Tabell Genom att plotta matningen av antikoagulantinnehall i normalplasmat 25 ges skillnaden i INRc f6r tva av tre mojliga skillnader mot heparininnehallet i graferna i Fig. 9 och 10. Som ses fran tabell 5 och Fig. 9 och 10 kan heparin detekteras vid ca 0,2 U/ml och bestammas i koncentrationsintervallet 0,2 till 5 U/ml, vilket är av klinisk relevans. ' 952 prov !WS.:ttisk lQL pLprov 101.4,51.4. 11,12 1.'s1,9.afk.,57 0,91 3.11 1-.2■3 2,040,2g 1.1c11..24 0, 620,0S 1,g2 1-.22 1.-1,33 0,22..2,03 1.02 '1,4r 1.„03 0.000,00 1,043 1.5Q 1,26 1.36 NKP pin Lion i 2 L. prov prov • 5.1.1E. prov 66,47 2,2,46 1.26 .31.

Lae., $gKp21:24 MCP 1.11.31

Claims (10)

19 PATENTKRAV 1. Analysmetod for bestamning av antikoagulanter i ett blod- eller blodplasmaprov, varvid namnda analysmetod innefattar analyser med minst 5 tva vatkemiska protrombintid (PT)-metoder, varvid analysmetoden innefattar stegen att:

1. i en forsta PT-analys med en forsta PT-metod mata PT i en forsta reaktionsblandning innefattande en f6rsta volym blod eller blodplasma spadd i 10 en forsta volym av ett vatskereagens, 2. i en andra PT-analys med en andra PT-metod mata PT i en andra reaktionsblandning innefattande en andra volym av namnda blod eller blodplasma spadd i en andra volym av namnda vatskereagens, varvid koncentrationen av blod eller blodplasma i den andra reaktionsblandningen skiljer sig Iran koncentrationen av blod eller blodplasma i den forsta reaktionsblandningen; kannetecknad avatt namnda minst tva PT-metoder är kalibrerade att: - ge sannnna eller ungefar sannnna PT-resultat nar de anvands for att analysera referensblod eller blodplasma som saknar antikoagulanter av intresse for namnda analysmetod, och varvid analysmetoden vidare innefattar steget att: 3. berakna en skillnad i PT fran matningarna i steg a) och b), varvid om namnda skillnad i PT är 1) signifikant, tyder detta pa en narvaro av antikoagulanter i blod- eller blodplasmaprovet, eller 2) icke-signifikant, tyder detta pa en franvaro av antikoagulanter I en halt Over detekterbar niva i blod- eller blodplasmaprovet.

2. Analysmetod enligt krav 1, varvid om skillnaden i PT beraknad i steg c) är signifikant och identiteten av antikoagulanten är kand, är koncentrationen av antikoagulanten i blod- eller blodplasmaprovet berakningsbar.

3. Analysmetod enligt krav 1, varvid om skillnaden i PT beraknad i steg c) är icke-signifikant och identiteten av antikoagulanten är kand, sa är nivan over vilken antikoagulanten inte forekommer i namnda blod- eller blodplasmaprov bestambar.

4.

5. Analysmetod enligt nagot av krav 1 eller 2, varvid om skillnaden i PT beraknad i steg c) är signifikant, är en uppskattad PT kir blod- eller blodplasmaprovet i franvaro av antikoagulanter berakningsbar. 15 5.Analysmetod enligt nagot av foregaende krav, varvid vatskereagenset innefattar tromboplastin, fibrinogen och koagulationsfaktor V.

6. Analysmetod enligt nagot av fOregaende krav, varvid PT-analyserna utfors vid en omgivningstemperatur fran 17 °C till 45 °C, foretradesvis Than 20 18 °C till 30 °C, mer foretradesvis fran 21 °C till 30 °C och mest foretradesvis fran 25 °C till 30 °C.

7. Analysmetod enligt nagot av foregaende krav, varvid antikoagulanterna som bestams i namnda analysnnetod är medlemmar av en grupp innefattande direktverkande inhibitorer av aktiverade koagulationsfaktorer Ila och Xa, vilka valjs ur en grupp innefattande dabigatran, apixaban, rivaroxaban eller hirudin, eller av en grupp innefattande indirekt verkande inhibitorer av aktiverade koagulationsfaktorer Ila och Xa, vilka valjs ur en grupp innefattande fraktionerade eller ofraktionerade hepariner, lupusantikoagulanter eller antikroppar som hindrar aktiviteten av FVIII.

8. Analysmetod enligt nagot av foregaende krav, varvid den forsta volymen av vatskereagenset i den fOrsta reaktionsblandningen är lika stor 21 sonn den andra volymen av vatskereagenset i den andra reaktionsblandningen.

9. Analysmetod enligt nagot av foregaende krav, varvid volymen blod eller blodplasma som spads i vatskereagenset är mellan 1 och 20 pl.

10. Analysmetod enligt nagot av foregaende krav, varvid volymen blod eller blodplasma tillsatts vatskereagenset med en ande till ande-kapillar. 1/ 18 16 14 12 0r: z zi 8 6 4 2 o 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 apixaban added to normal plasma (pg/L)