Claims (51)
1. Аналог фактора X, отличающийся тем, что он модифицирован в области естественно встречающегося места расщепления для активирования фактора Xa, причем модификация представляет собой сайт процессирования протеазой, естественно не расщепляющей в этой области последовательности фактора X.1. An analogue of factor X, characterized in that it is modified in the region of a naturally occurring cleavage site to activate factor Xa, the modification being a protease processing site that naturally does not cleave the sequence of factor X in this region.
2. Аналог фактора X по п. 1, отличающийся тем, что модифицирована, по крайней мере, одна аминокислота внутри аминокислотной последовательности активирующего пептида. 2. An analogue of factor X according to claim 1, characterized in that at least one amino acid is modified within the amino acid sequence of the activating peptide.
3. Аналог фактора X по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что модификация представляет собой замену, по крайней мере, одной из аминокислот между Gly228 и Arg234, и, в случае необходимости, Ile235, относительно нумерации аминокислот согласно фигуре 1. 3. An analogue of factor X according to any one of paragraphs. 1 or 2, characterized in that the modification is a replacement of at least one of the amino acids between Gly228 and Arg234, and, if necessary, Ile235, relative to the numbering of amino acids according to figure 1.
4. Аналог фактора X по любому из пп. 1 - 3, отличающийся тем, что он содержит последовательность фактора X с Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1, причем: a) R1 означает аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Ile, Val, Ser, Thr или Ala; б) R2 означает аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Pro, Gly, Lys или Arg; в) R3 означает аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Phe, Lys, Met, Gln, Glu, Ser, Val, Arg или Pro; г) R4 означает аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Asp, Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Arg или Lys; д) R5 означает аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Asn, Lys, Ser, Glu, Ala, Gln, His или Arg; и e) R6 означает аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Asp, Phe, Thr, Arg, Leu или Ser. 4. An analogue of factor X according to any one of paragraphs. 1 to 3, characterized in that it contains a sequence of factor X with Gly228-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1, wherein: a) R1 is an amino acid selected from the group consisting of Ile, Val, Ser, Thr or Ala; b) R2 is an amino acid selected from the group consisting of Pro, Gly, Lys or Arg; c) R3 is an amino acid selected from the group consisting of Phe, Lys, Met, Gln, Glu, Ser, Val, Arg or Pro; d) R4 is an amino acid selected from the group consisting of Asp, Ile, Ser, Met, Pro, Thr, Arg or Lys; e) R5 is an amino acid selected from the group consisting of Asn, Lys, Ser, Glu, Ala, Gln, His or Arg; and e) R6 is an amino acid selected from the group consisting of Asp, Phe, Thr, Arg, Leu or Ser.
5. Аналог фактора X по любому из пп. 1 - 4, отличающийся тем, что модификация представляет собой сайт процессирования протеазой, выбранной из группы эндопротеаз, как кексин/Кех2, фурин/РАСЕ, РС1/РСЗ, РС2, РС4, РАСЕ4, LPC/PC7; серинпротеаз, как фактор IIа, фактор XIIa, фактор ХIа, фактор Xa, или калликреина, или производного этих протеаз. 5. An analogue of factor X according to any one of paragraphs. 1 to 4, characterized in that the modification is a protease processing site selected from the group of endoproteases, such as Keksin / Kekh2, furin / PACE, PC1 / PCZ, PC2, PC4, PACE4, LPC / PC7; serine proteases, such as factor IIa, factor XIIa, factor XIa, factor Xa, or kallikrein, or a derivative of these proteases.
6. Аналог фактора X по любому из пп. 1 - 5, отличающийся тем, что далее он модифицирован в области С-концевой аминокислотной последовательности фактора X. 6. An analogue of factor X according to any one of paragraphs. 1 to 5, characterized in that it is further modified in the region of the C-terminal amino acid sequence of factor X.
7. Аналог фактора X по п. 6, отличающийся тем, что он модифицирован в С-концевой области места расщепления β-пептида. 7. An analogue of factor X according to claim 6, characterized in that it is modified in the C-terminal region of the β-peptide cleavage site.
8. Аналог фактора X по п. 7, отличающийся тем, что модификация представляет собой мутацию, делецию или инсерцию в области аминокислотной последовательности фактора X между положениями аминокислот Arg469 и Ser476. 8. An analogue of factor X according to claim 7, characterized in that the modification is a mutation, deletion or insertion in the region of the amino acid sequence of factor X between the positions of amino acids Arg469 and Ser476.
9. Аналог фактора X по любому из пп. 6 - 8, отличающийся тем, что модификация предотвращает отщепление β-пептида. 9. An analogue of factor X according to any one of paragraphs. 6 to 8, characterized in that the modification prevents the removal of the β-peptide.
10. Аналог фактора X по п. 6, отличающийся тем, что он делетирован за счет β-пептида фактора X. 10. An analogue of factor X according to claim 6, characterized in that it is deleted due to the β-peptide of factor X.
11. Аналог фактора X по п. 6, отличающийся тем, что он имеет стоп-сигнал трансляции в С-концевой области последовательности фактора X. 11. An analogue of factor X according to claim 6, characterized in that it has a broadcast stop signal in the C-terminal region of the factor X sequence.
12. Аналог фактора X по п. 11, отличающийся тем, что он имеет стоп-сигнал трансляции в положении аминокислоты 470 последовательности фактора X. 12. An analogue of factor X according to claim 11, characterized in that it has a translation stop signal at the amino acid position 470 of the factor X sequence.
13. Аналог фактора X по любому из пп. 1 - 12, отличающийся тем, что модификация в области активирующего пептида способствует активированию ин витро аналога фактора X до нативного фактора Xa или, соответственно, аналога фактора Xa. 13. An analogue of factor X according to any one of paragraphs. 1 - 12, characterized in that the modification in the region of the activating peptide promotes the in vitro activation of an analogue of factor X to native factor Xa or, accordingly, an analogue of factor Xa.
14. Аналог фактора X по п. 13, отличающийся тем, что модификация способствует активированию протеазой, выбранной из группы эндопротеаз, как кексин/Кех2, фурин/РАСЕ, РС1/РСЗ, РС2, РС4, РАСЕ4, LPC/PC7; группы серинпротеаз, как фактор IIа, фактор XIIa, фактор ХIа, фактор Xa, или с помощью калликреина, или с помощью производного этих протеаз. 14. An analogue of factor X according to claim 13, characterized in that the modification promotes activation by a protease selected from the group of endoproteases, such as Keksin / Kekh2, furin / PACE, PC1 / PCZ, PC2, PC4, PACE4, LPC / PC7; groups of serine proteases, such as factor IIa, factor XIIa, factor XIa, factor Xa, either with kallikrein or with a derivative of these proteases.
15. Аналог фактора X по любому из пп. 1 - 12, отличающийся тем, что модификация способствует активированию ин виво аналога фактора X до нативного фактора Xa или, соответственно, аналога фактора Xa. 15. An analogue of factor X according to any one of paragraphs. 1 - 12, characterized in that the modification promotes the in vivo activation of an analogue of factor X to native factor Xa or, correspondingly, an analogue of factor Xa.
16. Аналог фактора X по п. 15, отличающийся тем, что модификация способствует активированию с помощью протеазы, выбранной из группы серинпротеаз, как фактор XIIa, фактор ХIа, фактор IIа, фактор Xa, или с помощью калликреина. 16. An analogue of factor X according to claim 15, characterized in that the modification promotes activation using a protease selected from the group of serine proteases, such as factor XIIa, factor XIa, factor IIa, factor Xa, or with kallikrein.
17. Аналог фактора X по любому из пп. 1 - 16, отличающийся тем, что он представляет собой аналог фактора X с интактным β-пептидом или С-концевой укороченный аналог фактора. 17. An analogue of factor X according to any one of paragraphs. 1 to 16, characterized in that it is an analogue of factor X with an intact β-peptide or a C-terminal truncated analogue of factor.
18. Аналог фактора X по любому из пп. 1 - 17, отличающийся тем, что он представляет собой одноцепочечную молекулу. 18. An analogue of factor X according to any one of paragraphs. 1 to 17, characterized in that it is a single chain molecule.
19. Рекомбинантная ДНК, кодирующая аналог фактора X по любому из пп. 1 - 18, содержащаяся в векторе для рекомбинантной экспрессии, кодированного протеина. 19. Recombinant DNA encoding an analogue of factor X according to any one of paragraphs. 1-18, contained in the vector for recombinant expression of the encoded protein.
20. Препарат, содержащий очищенный аналог фактора X или его протеин-предшественник, модификацированный в области естественно встречающегося сайта активирования фактора X, причем модификация представляет собой сайт процессирования протеазой, естественно не расщепляющей в этой области последовательности фактора X. 20. A preparation containing a purified analogue of factor X or its protein precursor, modified in the region of a naturally occurring activation site of factor X, wherein the modification is a protease processing site that does not naturally cleave the factor X sequence in this region.
21. Препарат по п. 20, отличающийся тем, что модификация представляет собой место расщепления протеазой, выбранной из группы двухосновных эндопротеаз, как кексин/Кех2, фурин/РАСЕ, РС1/РСЗ, РС2, РС4, РАСЕ4, LPC/PC7; серинпротеаз, как фактор IIа, фактор XIIa, фактор ХIа, фактор Xa, или калликреином. 21. The drug according to p. 20, characterized in that the modification is a cleavage site with a protease selected from the group of dibasic endoproteases, such as Keksin / Kekh2, furin / PACE, PC1 / PCZ, PC2, PC4, PACE4, LPC / PC7; serine protease, such as factor IIa, factor XIIa, factor XIa, factor Xa, or kallikrein.
22. Препарат по любому из пп. 20 или 21, отличающийся тем, что он содержит аналог фактора Х в виде аналога фактора Xα. 22. The drug according to any one of paragraphs. 20 or 21, characterized in that it contains an analogue of factor X in the form of an analogue of factor Xα.
23. Препарат по любому из пп. 20 или 21, отличающийся тем, что аналог фактора Х представляет собой С-концевой укороченный аналог фактора X. 23. The drug according to any one of paragraphs. 20 or 21, characterized in that the analogue of factor X is a C-terminal truncated analogue of factor X.
24. Препарат по любому из пп. 20 - 23, отличающийся тем, что он содержит аналог фактора Х в виде одноцепочечной молекулы в изолированной форме. 24. The drug according to any one of paragraphs. 20 - 23, characterized in that it contains an analogue of factor X in the form of a single chain molecule in isolated form.
25. Препарат по любому из пп. 20 - 24, отличающийся тем, что он содержит одноцепочечный аналог фактора Х в ферментативно инактивной форме с чистотой, по крайней мере, 80%, предпочтительно 90%, особенно предпочтительно 95%, и лишен инактивных, протеолитических промежуточных продуктов аналога фактора Х/Ха. 25. The drug according to any one of paragraphs. 20-24, characterized in that it contains a single chain analogue of factor X in an enzymatically inactive form with a purity of at least 80%, preferably 90%, particularly preferably 95%, and is devoid of inactive, proteolytic intermediates of the factor X / Xa analogue.
26. Препарат по любому из пп. 20 - 25, отличающийся тем, что он содержит аналог фактора Х в виде двухцепочечной молекулы в изолированной форме. 26. The drug according to any one of paragraphs. 20 - 25, characterized in that it contains an analogue of factor X in the form of a double-stranded molecule in isolated form.
27. Препарат по любому из пп. 20-26, отличающийся тем, что он содержит аналог фактора Х с модификацией, способствующей осуществлению ин витро активирования аналога фактора Х до нативного фактора Ха или, соответственно, аналога фактора Ха. 27. The drug according to any one of paragraphs. 20-26, characterized in that it contains an analogue of factor X with a modification that facilitates the in vitro activation of an analogue of factor X to native factor Xa or, accordingly, an analogue of factor Xa.
28. Препарат по любому из пп. 20 - 27, отличающийся тем, что он приготовлен в виде фармацевтической препаративной формы. 28. The drug according to any one of paragraphs. 20 to 27, characterized in that it is prepared in the form of a pharmaceutical formulation.
29. Препарат по любому из пп. 20 - 28, отличающийся тем, что он находится в пригодном устройстве, предпочтительно в устройстве для введения, в комбинации с протеазой, выбранной из группы эндопротеаз, как кексин/Кех2, фурин/РАСЕ, РС1/РСЗ, РС2, РС4, РАСЕ4, LPC/PC7; группы серинпротеаз, как фактор XIIa, фактор ХIа, фактор Ха, фактор IIа, или с калликреином, или с производным этих протеаз. 29. The drug according to any one of paragraphs. 20 - 28, characterized in that it is in a suitable device, preferably in a device for administration, in combination with a protease selected from the group of endoproteases, such as Keksin / Kekh2, furin / PACE, PC1 / PCZ, PC2, PC4, PACE4, LPC / PC7; groups of serine proteases, such as factor XIIa, factor XIa, factor Xa, factor IIa, or with kallikrein, or with a derivative of these proteases.
30. Препарат по п. 29, отличающийся тем, что компоненты находятся пространственно разделенными друг от друга. 30. The drug according to p. 29, characterized in that the components are spatially separated from each other.
31. Препарат по любому из пп. 20 - 26, отличающийся тем, что он содержит аналог фактора Х с модификацией, способствующей активированию ин виво аналога фактора Х до нативного фактора Ха или, соответственно, аналога фактора Ха. 31. The drug according to any one of paragraphs. 20 - 26, characterized in that it contains an analogue of factor X with a modification that facilitates the in vivo activation of an analogue of factor X to native factor Xa or, accordingly, an analogue of factor Xa.
32. Препарат, содержащий аналог фактора Ха с высокой стабильностью и структурной целостностью, который в особенности свободен от инактивных промежуточных продуктов аналога фактора Х/Ха и аутопротеолитических продуктов деструкции фактора X, получаемых вследствие активирования аналога фактора Х по любому из пп. 1 - 19. 32. A preparation containing a factor Xa analog with high stability and structural integrity, which is especially free from inactive intermediate products of the factor X / Xa analog and autoproteolytic factor X destruction products obtained by activating the factor X analog according to any one of paragraphs. 1 - 19.
33. Препарат по любому из пп. 20 - 32, отличающийся тем, что он содержит физиологически приемлемый носитель и находится в устойчивой при хранении форме. 33. The drug according to any one of paragraphs. 20 to 32, characterized in that it contains a physiologically acceptable carrier and is in storage-stable form.
34. Препарат по любому из пп. 20 - 33, отличающийся тем, что, в случае необходимости, в качестве следующей составной части он содержит фактор крови или активированную форму фактора крови. 34. The drug according to any one of paragraphs. 20 to 33, characterized in that, if necessary, as the next component, it contains a blood factor or an activated form of a blood factor.
35. Препарат по п. 34, отличающийся тем, что в качестве следующей составной части он содержит, по крайней мере, один компонент с байпас-активностью фактора VIII. 35. The drug according to p. 34, characterized in that as the next component it contains at least one component with bypass activity of factor VIII.
36. Препарат по любому из пп. 20 - 35, отличающийся тем, что он приготовлен в виде фармацевтической препаративной формы и, в случае необходимости, представляет собой многокомпонентный препарат. 36. The drug according to any one of paragraphs. 20 to 35, characterized in that it is prepared in the form of a pharmaceutical formulation and, if necessary, is a multicomponent preparation.
37. Препарат по любому из пп. 20 - 36 для получения лекарственного средства. 37. The drug according to any one of paragraphs. 20 - 36 to obtain the drug.
38. Нуклеиновая кислота по п. 19 для получения лекарственного средства. 38. The nucleic acid of claim 19 for the manufacture of a medicament.
39. Способ получения препарата, содержащего очищенный рекомбинантный аналог фактора X, отличающийся тем, что полученный путем рекомбинантного способа приготовления аналог фактора Х выделяют и очищают с помощью хроматографического способа. 39. A method for producing a preparation containing a purified recombinant factor X analog, characterized in that the factor X analog obtained by the recombinant preparation method is isolated and purified using a chromatographic method.
40. Способ по п. 39, отличающийся тем, что он включает следующие стадии: приготовление нуклеиновой кислоты, по п. 19; трансформацию пригодной клетки; экспрессию аналога фактора X; в случае необходимости, инкубирование аналога фактора X с протеазой; выделение аналога фактора X; и очистку аналога фактора Х с помощью хроматографического способа. 40. The method according to p. 39, characterized in that it includes the following stages: preparing a nucleic acid according to p. 19; transformation of a suitable cell; expression of an analogue of factor X; if necessary, incubation of the factor X analog with a protease; isolation of an analogue of factor X; and purification of the analogue of factor X using a chromatographic method.
41. Способ по п. 40, отличающийся тем, что аналог фактора Х выделяют в виде двухцепочечной молекулы. 41. The method according to p. 40, characterized in that the analogue of factor X is isolated in the form of a double-stranded molecule.
42. Способ по любому из пп. 39 - 41, отличающийся тем, что двухцепочечный аналог фактора Х вводят в контакт с протеазой, выбранной из группы эндопротеаз, как кексин/Кех2, фурин/РАСЕ, РС1/РСЗ, РС2, РС4, РАСЕ4, LPC/PC7; группы серинпротеаз, как фактор IIа, фактор XIIa, фактор ХIа, фактор Ха, или с калликреином, или с производным этих протеаз, в условиях, при которых аналог фактора Х расщепляется до нативного фактора Ха или аналога фактора Ха. 42. The method according to any one of paragraphs. 39 - 41, characterized in that the double-stranded analogue of factor X is brought into contact with a protease selected from the group of endoproteases, such as Keksin / Kekh2, furin / PACE, PC1 / PCZ, PC2, PC4, PACE4, LPC / PC7; groups of serine proteases, such as factor IIa, factor XIIa, factor XIa, factor Xa, or with kallikrein, or with a derivative of these proteases, under conditions in which the analogue of factor X splits into native factor Xa or analogue of factor Xa.
43. Способ по п. 42, отличающийся тем, что в качестве клетки используют клетку, которая не выражает протеазу, способную осуществлять расщепление одинарной цепи на легкую и тяжелую цепь фактора X, соответственно, аналога фактора X, и, при известных условиях, имеет дефицит протеазы. 43. The method according to p. 42, characterized in that the cell is a cell that does not express a protease capable of cleaving a single chain into the light and heavy chains of factor X, respectively, of an analogue of factor X, and, under certain conditions, has a deficiency proteases.
44. Способ по п. 43, отличающийся тем, что клетка не выражает эндопротеазы, как кексин, фурин, РАСЕ или их производное. 44. The method according to p. 43, characterized in that the cell does not express endoproteases, like keksin, furin, PACE or their derivative.
45. Способ по любому из пп. 43 или 44, отличающийся тем, что аналог фактора Х выделяют в виде одноцепочечной молекулы. 45. The method according to any one of paragraphs. 43 or 44, wherein the factor X analog is isolated as a single chain molecule.
46. Способ по п. 45, отличающийся тем, что одноцепочечный, в случае необходимости, выделенный аналог фактора Х вводят в контакт с протеазой, выбранной из группы эндопротеаз, как кексин/Кех2, фурин/РАСЕ, РС1/РСЗ, РС2, РС4, РАСЕ4, LPC/PC7, или с производным этих протеаз, в условиях, в которых одноцепочечный аналог фактора Х расщепляется с образованием двухцепочечной формы фактора X. 46. The method according to p. 45, characterized in that the single-chain, if necessary, isolated analogue of factor X is brought into contact with a protease selected from the group of endoproteases, such as Keksin / Kekh2, furin / PACE, PC1 / PCZ, PC2, PC4, PACE4, LPC / PC7, or a derivative of these proteases, under conditions in which the single-stranded analog of factor X cleaves to form the double-stranded form of factor X.
47. Способ по п. 46, отличающийся тем, что одноцепочечный аналог фактора X, при известных условиях, путем введения в контакт с протеазой активируют непосредственно до фактора Ха, соответственно, аналога фактора Ха. 47. The method according to p. 46, characterized in that the single-chain analogue of factor X, under certain conditions, by contacting with a protease is activated directly up to factor Xa, respectively, of the factor Xa analog.
48. Способ по п. 46, отличающийся тем, что двухцепочечный аналог фактора Х вводят в контакт с другой, отличающейся от первой, протеазой и активируют до аналога фактора Ха или нативного фактора Ха. 48. The method according to p. 46, characterized in that the double-stranded analogue of factor X is brought into contact with another protease different from the first and activated to an analogue of factor Xa or native factor Xa.
49. Способ по любому из пп. 39 - 48, отличающийся тем, что протеаза иммобилизована. 49. The method according to any one of paragraphs. 39 - 48, characterized in that the protease is immobilized.
50. Способ по любому из пп. 39 - 46, отличающийся тем, что полученный аналог фактора Х подвергают стадии активирования. 50. The method according to any one of paragraphs. 39 - 46, characterized in that the obtained factor X analog is subjected to an activation step.
51. Способ по п. 50, отличающийся тем, что получают очищенный аналог фактора Ха или нативный фактор Ха с высокой стабильностью и структурной целостностью, который в особенности свободен от инактивных промежуточных продуктов фактора Х/Ха. 51. The method according to p. 50, characterized in that a purified analogue of factor Xa or native factor Xa is obtained with high stability and structural integrity, which is especially free from inactive intermediate products of factor X / Xa.