Claims (37)
1. Последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, кодирующую белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, причем указанной нуклеиновой кислотой является ДНК или PHK.1. A nucleic acid sequence containing a sequence encoding a protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity, said nucleic acid being DNA or PHK.
2. Последовательность нуклеиновой кислоты по п. 1, отличающаяся тем, что нуклеиновой кислотой является кДНК. 2. The nucleic acid sequence according to claim 1, characterized in that the nucleic acid is cDNA.
3. Последовательность кДНК по п. 2, отличающаяся тем, что кодирующая последовательность кодирует белок A.талианы, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, и включающая последовательность нуклеотидов последовательности SEQ ID N1, приведенной на с. 3. The cDNA sequence of claim 2, wherein the coding sequence encodes A. taliana protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity, and including the nucleotide sequence of the sequence SEQ ID N1 shown in p.
а также, аллельные варианты данной последовательности. as well as allelic variants of this sequence.
4. Последовательность ДНК, кодирующая белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, которая гибридизуется с последовательностью, определенной по п. 3, при средней или повышенной температуре гибридизации, или обладающая с данной последовательностью идентичностью на 60 или более процентов. 4. A DNA sequence encoding a protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity that hybridizes to the sequence as defined in claim 3, at an average or elevated hybridization temperature, or which has a sequence identity of 60 or more percent.
5. Последовательность ДНК, кодирующая белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, имплифицированная методом PCR, с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, кодирующих консенсусную последовательность, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID N3, приведенную на с. 5. The DNA sequence encoding a protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity, PCR-implicated using oligonucleotides encoding a consensus sequence having the amino acid sequence of SEQ ID N3 shown on p.
в которой Хаа в положении 7 представляет собой аминокислоту Трп или Тир, а Хаа в положении 12 представляет собой Гис или Лиз. in which Haa at position 7 is the amino acid Trp or Tyr, and Haa at position 12 is His or Lys.
6. Белок А. талианы, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью и аминокислотной последовательностью SEQ ID N2, приведенную на с. 6. Protein A. taliana with delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity and amino acid sequence of SEQ ID N2, shown on p.
а также аллельные варианты и аналоги данной последовательности. as well as allelic variants and analogues of this sequence.
7. Белок A. талианы, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью и имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID N2, обозначаемый как дельта-7 Ред. 7. A. talian protein, having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity and having the amino acid sequence of SEQ ID N2, designated as delta-7 Ed.
8. Белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, имеющий аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью с последовательностью SEQ ID N2 по п. 7 примерно на 60 и более процентов. 8. A protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity, having an amino acid sequence that is identical to the sequence of SEQ ID N2 according to claim 7 by about 60 percent or more.
9. Белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, и перекрестной иммунореактивностью с белком A. талианы по п. 7. 9. A protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity, and cross-immunoreactivity with A. taliana protein according to claim 7.
10. Белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, полученный экспрессией в клетке-хозяине, включающей последовательность ДНК, по любому из пп. 1-5. 10. A protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity, obtained by expression in a host cell, including a DNA sequence, according to any one of paragraphs. 1-5.
11. Белок A. талианы, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, полученный экспрессией в клетке-хозяине, включающей последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID N2. 11. A. talian protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity obtained by expression in a host cell comprising a DNA sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID N2.
12. Белок по п. 10 или 11, отличающийся тем, что клеткой-хозяином являются дрожжи. 12. The protein of claim 10 or 11, wherein the host cell is yeast.
13. Антитела, против белка, обладающего дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, по любому из пп. 6-12. 13. Antibodies against a protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity, according to any one of paragraphs. 6-12.
14. Вектор экспрессии, содержащий последовательность ДНК по любому из пп. 1-5. 14. The expression vector containing the DNA sequence according to any one of paragraphs. 1-5.
15. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п. 14. 15. A host cell transformed with a vector according to claim 14.
16. Способ клонирования нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью в микроорганизме, отличающийся тем, что включает метод скрининга, выбранный среди устойчивости микроорганизма к нистатину или к аналогичному соединению, токсичность которого зависит от присутствия стеринов, содержащих ненасыщенную связь в положении C-7, гибридизации нуклеиновой кислоты с последовательностью нуклеотидов указанной выше последовательности SEQ ID N1, идентификации нуклеиновой кислоты информационным путем среди последовательностей ДНК, изолированных произвольно, прямой экспрессии белка с последующим иммунологическим обнаружением с помощью антител против белка, обладающего указанной выше аминокислотной последовательностью SEQ ID N2. 16. A method for cloning a nucleic acid encoding a protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity in a microorganism, characterized in that it includes a screening method selected among the microorganism resistance to nystatin or a similar compound, the toxicity of which depends on the presence sterols containing an unsaturated bond at position C-7, nucleic acid hybridization with the nucleotide sequence of the above sequence SEQ ID N1, nucleic acid identification information pathway among randomly isolated DNA sequences, direct protein expression followed by immunological detection with antibodies against a protein having the above amino acid sequence of SEQ ID N2.
17. Последовательность нуклеиновой кислоты, полученная методом по п.16. 17. The nucleic acid sequence obtained by the method according to clause 16.
18. Клетка-хозяин, трансформированная вектором, содержащим последовательность ДНК по п. 17. 18. A host cell transformed with a vector containing the DNA sequence of claim 17.
19. Клетка-хозяин по п. 15 или 18 отличающаяся тем, что клеткой-хозяином являются дрожжи или филаментный грибок. 19. A host cell according to claim 15 or 18, characterized in that the host cell is a yeast or filamentous fungus.
20. Способ получения белка, обладающего дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, отличающийся тем, что культивируют клетку-хозяин, трансформированную по любому из пп. 15, 18 или 19, и изолируют экспрессированный белок. 20. A method of obtaining a protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity, characterized in that the host cell is cultured, transformed according to any one of paragraphs. 15, 18 or 19, and the expressed protein is isolated.
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что клеткой-хозяином являются трансформированные дрожжи, в которых кодирующая последовательность ДНК находится под контролем промотора дрожжей. 21. The method according to p. 20, characterized in that the host cell is transformed yeast, in which the coding DNA sequence is under the control of the yeast promoter.
22. Способ восстановления ин витро стерина, ненасыщенного в положении C-7, отличающийся тем, что инкубируют стерин, подлежащий восстановлению, с белком, полученным по п. 20 или 21, после чего полученный восстановленный стерин может быть изолирован. 22. A method of reducing in vitro sterol unsaturated at position C-7, characterized in that the sterol to be reduced is incubated with the protein obtained according to claim 20 or 21, after which the resulting restored sterol can be isolated.
23. Способ восстановления ин виво стерина, ненасыщенного в положении C-7, отличающийся тем, что инкубируют стерин с клеткой-хозяином, трансформированной по любому из п. 15, 18 или 19, с возможностью изолирования полученного восстановленного стерина. 23. A method of reducing in vivo sterol unsaturated at position C-7, characterized in that the sterol is incubated with a host cell transformed according to any one of claims 15, 18 or 19, with the possibility of isolating the resulting reduced sterol.
24. Способ восстановления ин виво стерина, ненасыщенного в положении C-7, отличающийся тем, что культивируют штамм-хозяин по п. 19 с возможностью последующего изолирования накопленного восстановленного стерина. 24. A method of recovering in vivo sterol unsaturated at position C-7, characterized in that the host strain of claim 19 is cultured with the possibility of subsequent isolation of the accumulated reduced sterol.
25. Способ восстановления ин витро или ин виво по любому из пп. 22-24, отличающийся тем, что полученным восстановленным стерином является субстрат фермента расщепления боковой цепи холестерина (P450SCC).25. The method of restoration in vitro or in vivo according to any one of paragraphs. 22-24, characterized in that the obtained restored sterol is a substrate of the enzyme of the cleavage of the side chain of cholesterol (P 450 SCC).
26. Способ восстановления ин виво по п. 25, отличающийся тем, что эндогенным стерином, подлежащим восстановлению, является эргоста 5,7 диен 3-ол, эргоста 5,7,24(28) триен 3-ол или эргоста 5,7,22 триен 3-ол или их смесь. 26. The in vivo recovery method according to claim 25, characterized in that the endogenous sterol to be restored is ergost 5,7 diene 3-ol, ergost 5,7,24 (28) trien 3-ol or ergost 5,7, 22 trienes 3-ol or a mixture thereof.
27. Способ получения прегненолона, отличающийся тем, что культивируют клетки-хозяева по п. 19 с возможностью последующего изолирования накопленного восстановленного эндогенного стерина (накопленных восстановленных эндогенных стеринов) в положении C-7, инкубируют восстановленные стерины в присутствии P450SCC и, возможно, в присутствии адренодоксинредуктазы (ADR) и адренодоксина (ADX), с возможностью последующего изолирования полученного прегненолона.27. A method for producing pregnenolone, characterized in that the host cells according to claim 19 are cultured with the possibility of subsequent isolation of the accumulated reduced endogenous sterol (accumulated reduced endogenous sterols) at position C-7, reduced sterols are incubated in the presence of P 450 SCC and, possibly, in the presence of adrenodoxine reductase (ADR) and adrenodoxin (ADX), with the possibility of subsequent isolation of the resulting pregnenolone.
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что клеткой-хозяином являются дрожжи. 28. The method according to p. 27, wherein the host cell is yeast.
29. Способ получения прегненолона, отличающийся тем, что культивируют дрожжи, трансформированные одним или несколькими векторами, обеспечивающими коэкспрессию белка, обладающего дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, и P450SCC, и, возможно, ADR и ADX, с возможностью последующего изолирования свободного или эстерифицированного прегненолона.29. A method of producing pregnenolone, characterized in that the yeast is cultured, transformed with one or more vectors, providing coexpression of a protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity, and P 450 SCC, and possibly ADR and ADX, with the possibility of subsequent isolation of free or esterified pregnenolone.
30. Способ получения прегненолона по п. 29, отличающийся тем, что культивируют трансформированные дрожжи, коэкспрессирующие белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, P450SCC, ADR и ADX.30. The method of producing pregnenolone according to claim 29, characterized in that the transformed yeast is cultured, co-expressing a protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity, P 450 SCC, ADR and ADX.
31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что белком, обладающим дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, является белок A. талианы дельта-7 Ред. 31. The method according to p. 30, characterized in that the protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity, is protein A. taliana delta-7 red.
32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что дрожжевым штаммом является штамм ECO1/pCD63. 32. The method of claim 31, wherein the yeast strain is ECO1 / pCD63 strain.
33. Трансформированный дрожжевой штамм, коэкспрессирующий белок, обладающий дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, P450SCC, ADR и ADX, и накапливающий свободный или эстерифицированный прегненолон.33. A transformed yeast strain coexpressing a protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity, P 450 SCC, ADR and ADX, and accumulating free or esterified pregnenolone.
34. Дрожжевой штамм по п. 33, отличающийся тем, что белком, обладающим дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазной активностью, является белок A. талианы дельта-7 Ред. 34. The yeast strain according to claim 33, characterized in that the protein having delta-5,7 sterol, delta-7 reductase activity, is protein A. taliana delta-7 Red.
35. Дрожжевой штамм по п. 34, отличающийся тем, что обозначен ECO1/pCD63. 35. The yeast strain according to claim 34, characterized in that it is designated ECO1 / pCD63.
36. Последовательность ДНК человека по п. 17, отличающаяся тем, что используется в качестве зонда при диагностике врожденной недостаточности дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазы. 36. The human DNA sequence according to claim 17, characterized in that it is used as a probe in the diagnosis of congenital insufficiency delta-5,7 sterol, delta-7 reductase.
37. Способ выявления недостаточности дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазы, отличающийся тем, что осуществляют инкубацию пробы, содержащей геномную ДНК человека, с зондом по п. 36, в условиях стандартной гибридизации и выявление фиксации или отсутствия фиксации зонда на геномной ДНК, отсутствие фиксации или его восстановление, указывающее на врожденную нехватку дельта-5,7 стерин, дельта-7 редуктазы. 37. A method for detecting deficiency of delta-5,7 sterol, delta-7 reductase, characterized in that they incubate a sample containing human genomic DNA with a probe according to claim 36, under standard hybridization conditions and detect fixation or lack of fixation of the probe on the genomic DNA, lack of fixation or its recovery, indicating a congenital lack of delta-5,7 sterol, delta-7 reductase.