JP4249407B2

JP4249407B2 - Method for measuring human thymidylate synthase mRNA and primers and kit therefor

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Publication number: JP4249407B2
Application number: JP2001300086A
Authority: JP
Inventors: 寿久富
Original assignee: SRL, INC.
Current assignee: SRL, INC.
Priority date: 2001-09-28
Filing date: 2001-09-28
Publication date: 2009-04-02
Anticipated expiration: 2021-09-28
Also published as: JP2003102480A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトチミジル酸合成酵素ｃＤＮＡの測定方法並びにそれに用いられるプライマー、プローブ及びキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
チミジル酸合成酵素(thymidylate synthase; EC2.1.1.45、以下、「TS」と言うことがある）は、デオキシウリジル酸からチミジル酸を生成する反応を触媒する酵素で、チミンの供給に不可欠なものであり、また、ＤＮＡ前駆体供給経路の律速酵素の１つである。従って、細胞増殖の盛んな癌細胞中でその生産量が多くなることが知られている。
【０００３】
一方、5-フルオロウラシル（以下、「5-FU」と言うことがある）や5-フルオロデオキシウリジン等のフルオロピリミジン系の抗癌剤は、TSを標的とするものである。例えば、5-FUは、生体内でリボシル化及びリン酸化を受け、5-フルオロ-2'-デオキシウリジン5'-リン酸となり、これがデオキシウリジル酸をチミジル酸に転換するTSを阻害することによりＤＮＡ合成を抑制する。
【０００４】
5-FU等のフルオロピリミジン系の抗癌剤は、TS量の少ない癌細胞に対してはよく効き、TS量の多い癌細胞に対してはあまりよく効かないことがわかっている。従って、癌細胞中のTSの生産量を測定することは、抗癌剤の治療効果を予測し、抗癌剤を選定することに有用である。また、これらの抗癌剤により治療効果が得られる場合には、治療期間中に癌細胞中のTSの生産が減少し又は阻止されることも知られており、癌細胞中のTSの生産量を測定することは、抗癌剤による治療効果の判定にも有用である。
【０００５】
従来、細胞中のTSの生産量の測定は、多くの場合、免疫測定により行われている。また、癌細胞中のTSのｍＲＮＡ量を測定することにより、TSの生産量を測定し、それによって抗癌剤治療の予後を予測することも行われている。ｍＲＮＡ量は、リアルタイム検出RT-PCR法やRT-PCRサザン法等の、核酸増幅過程を含む方法により測定されている。
【０００６】
しかしながら、癌細胞中のTSのｍＲＮＡの測定量が減少しないのに予後が良好であるケースがしばしば認められ、従来法によるｍＲＮＡの測定により予後を測定する方法の信頼性は必ずしも満足できなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、活性を有するTSのみを的確に測定することができる、TSのｍＲＮＡの測定方法並びにそのためのプライマー、プローブ及びキットを提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、鋭意研究の結果、ヒト胃癌組織由来セルライン及びヒト大腸癌組織由来セルライン中に、オルタナティブスプライシング(alternative splicing)により、ヒトTS遺伝子のエクソン２及びエクソン３が欠失した変異型のｍＲＮＡ並びに／又はエクソン４が欠失した変異型のｍＲＮＡが生産されていることを見出した。１個又は２個のエクソンが全部欠失した酵素は、酵素活性を有していないと考えられる。従って、これらのオルタナティブスプライシングを考慮し、これらのエクソンの欠失がない、正常なTS mRNAのみを測定することにより、活性のあるTSの生産量を測定することが可能になる。本発明は、これらのエクソンの欠失がない、正常なTS mRNAのみを測定する方法並びにそのためのプライマー、プローブ及びキットを提供するものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子の完全長ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子のエクソン２及びエクソン３を欠失した第１の変異型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしない核酸をフォワード側プライマーとして用い、ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子の完全長ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子のエクソン４を欠失した第２の変異型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしない核酸をリバース側プライマーとして用いてヒトチミジル酸合成酵素遺伝子のｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを増幅し、増幅産物を測定することを含み、前記フォワード側プライマー及びリバース側プライマーの塩基数が、それぞれ１５塩基以上である、ヒトチミジル酸合成酵素ｍＲＮＡの測定方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
ヒトTSのｃＤＮＡは既にクローニングされており、その塩基配列も報告されている。ヒトTSのｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。配列番号１に示す塩基配列中、第１番目の塩基（本明細書において、例えば、第１番目の塩基は「1nt」のように表記する）〜205ntがエクソン１、206nt〜279ntがエクソン２、280nt〜454ntがエクソン３、455nt〜556ntがエクソン４、557nt〜732ntがエクソン５、733nt〜804ntがエクソン６、805nt以降がエクソン７に対応する領域である。
【００１１】
下記実施例において詳述するように、本願発明者は、ヒト胃癌組織由来セルラインであるKATO III細胞及びMKN45細胞中で、エクソン２及びエクソン３の全領域が欠失し、他の領域は正常である変異型のｍＲＮＡ（エクソン２及びエクソン３が欠失した変異型を本明細書において「第１の変異型」と呼ぶ）、並びにエクソン４の全領域が欠失し、他の領域は正常である変異型のｍＲＮＡ（エクソン４が欠失した変異型を本明細書において「第２の変異型」と呼ぶ）が生じていることを見出した。さらに、ヒト大腸癌組織由来セルラインであるHCT15細胞でもこれらの変異型ｍＲＮＡが生じていることを確認した。これらの変異では、１個又は２個のエクソンの全領域がすっぽりと欠失し、その他の領域には欠失が生じていないことから、これらの変異は、オルタナティブスプライシングによるものであると考えられる。ヒトTS遺伝子について、これらのオルタナティブスプライシングが起きることは、本願発明者が世界で初めて見出したものであり、本発明は、この新知見に基づくものである。
【００１２】
上記した第１及び第２の変異型では、１個又は２個のエクソンの全領域がすっぽりと欠失しているのであるから、これらの変異型ｍＲＮＡが翻訳されて生成されるTSは、酵素活性を有しないものと考えられる。本発明の方法は、これらのオルタナティブスプライシングによる欠失を有さないｍＲＮＡ又はそれを鋳型として形成されたｃＤＮＡ（本明細書において、これらのオルタナティブスプライシングを有さないTS ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡをそれぞれ「正常型」ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと呼ぶ）のみを測定するものである。
【００１３】
本願発明者は、ヒトTSのｍＲＮＡ又は該ｍＲＮＡを鋳型として形成されたｃＤＮＡを測定するにあたり、正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第１の異常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしないフォワード側プライマーと、正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第２の異常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしないリバース側プライマーとを用いてヒトｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを増幅することにより、正常型ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのみを増幅することができることに想到した。なぜなら、第１の変異型ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡには、フォワード側プライマーがハイブリダイズできないので増幅が起きず、第２の変異型ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡには、リバース側プライマーがハイブリダイズできないので増幅が起きず、正常型ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのみを増幅することができるからである。
【００１４】
このような増幅の方法として、先ず、RT-PCR法を挙げることができる。なお、RT-PCR法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、このような市販のキットを用いて容易に実施することができる。RT-PCR法では、先ず、検体からｍＲＮＡを抽出し、抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを形成する。ｃＤＮＡは、目的とするｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーを用いて形成してもよいが、ランダムプライマーのような全ｍＲＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いて全ｍＲＮＡのｃＤＮＡを形成してもよい。ｃＤＮＡの形成は、プライマー及び逆転写酵素の存在下でｍＲＮＡを鋳型としてＤＮＡの相補鎖を形成し、次いで、形成された相補鎖ＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡを形成することにより行うことができる。このようにして二本鎖ｃＤＮＡを得ることができる。
【００１５】
次に、形成された二本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅する。この際、フォワード側プライマーとして、正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第１の異常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしないプライマーを用い、リバース側プライマーとして、正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第２の異常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしないプライマーを用いる。フォワード側プライマー及びリバース側プライマーの両者が鋳型ｃＤＮＡにハイブリダイズしないと増幅が起きないので、これらのフォワード側プライマー及びリバース側プライマーを用いて増幅を行うことにより第１の異常型及び第２の異常型ｃＤＮＡはいずれも増幅されず、正常型ｃＤＮＡのみが増幅される。
【００１６】
正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第１の異常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしないフォワード側プライマーとしては、エクソン２及びエクソン３の領域内、すなわち、配列番号１で示す塩基配列を有するＤＮＡの206nt〜454ntの領域内に少なくともその一部がハイブリダイズするものを用いることができる。なお、フォワード側プライマーは、センスプライマーであり、実際には、配列番号１に現実に記載されている塩基配列の相補鎖にハイブリダイズするものである。配列表には、ルールにより、二本鎖のうちのセンス鎖の塩基配列を記載することになっているので、一本鎖の塩基配列のみが記載されているが、実際には、二本鎖を表示している場合もある。従って、本明細書において、配列表に示される塩基配列中の特定の領域にハイブリダイズするとは、その領域の二本鎖のいずれかの鎖にハイブリダイズするということを意味する。ただし、上記の通り、フォワード側プライマーは、アンチセンス鎖（配列表に実際に記載されている配列の相補鎖）にハイブリダイズするものである。フォワード側プライマーは、その全体が、エクソン２及びエクソン３の領域内（配列番号１の206nt〜454ntの領域内）にハイブリダイズすることが好ましいが、エクソン１又はエクソン４の領域に跨るものであってもよい。この場合、少なくともプライマーの３’末端がエクソン２又はエクソン３の領域内の塩基に対合するものであることが好ましく、及び／又は、プライマーの領域のうち、２０％以上、さらに好ましくは５０％以上の領域がエクソン２又はエクソン３の領域にハイブリダイズするものであることが好ましい。このようなプライマーを採用することにより、たとえ、エクソン１又はエクソン４の領域に跨る領域にハイブリダイズするものであっても、プライマーの３’末端にミスマッチがある場合にはプライマーがハイブリダイズしても増幅が起きにくく、また、プライマーの領域のうち、２０％以上、さらに好ましくは５０％以上の領域がエクソン２又はエクソン３の領域にハイブリダイズするものである場合には、第１の変異型ｃＤＮＡにはハイブリダイズしないことを確保することができる。また、フォワード側プライマーは、配列番号１に示される塩基配列の対応領域（プライマーがハイブリダイズする領域）と完全に同一の塩基配列を有していることが好ましいが、正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第１の異常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしない又は増幅が起きないという要件が満たされる限り、少数の塩基が置換した配列を有していてもよい。この場合、相補鎖の塩基に対して非相補的な、置換した塩基の数は、プライマーの全塩基数の１０％以下であることが好ましい。また、プライマーの３’末端は、このような置換塩基ではないことが好ましい。なお、ヒトTS遺伝子として、配列番号１に示す塩基配列の一部が点突然変異した遺伝子も知られているが、このような点突然変異型遺伝子と同一の塩基配列を有するフォワード側プライマーも、上記要件を満足する限り、本発明の方法に用いることができる。
【００１７】
正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第２の異常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしないリバース側プライマーとしては、エクソン４の領域内、すなわち、配列番号１で示す塩基配列を有するＤＮＡの455nt〜556ntの領域内に少なくともその一部がハイブリダイズするものを用いることができる。なお、リバース側プライマーは、アンチセンスプライマーであり、配列番号１に現実に記載されている塩基配列にハイブリダイズするものである。リバース側プライマーは、その全体が、エクソン４の領域内（配列番号１の455nt〜556ntの領域内）にハイブリダイズすることが好ましいが、エクソン３又はエクソン５の領域に跨るものであってもよい。この場合、少なくともプライマーの３’末端がエクソン４の領域内の塩基に対合するものであることが好ましく、及び／又は、プライマーの領域のうち、２０％以上、さらに好ましくは５０％以上の領域がエクソン４の領域にハイブリダイズするものであることが好ましい。このようなプライマーを採用することにより、たとえ、エクソン３又はエクソン５の領域に跨る領域にハイブリダイズするものであっても、プライマーの３’末端にミスマッチがある場合にはプライマーがハイブリダイズしても増幅が起きにくく、また、プライマーの領域のうち、２０％以上、さらに好ましくは５０％以上の領域がエクソン４の領域にハイブリダイズするものである場合には、第２の変異型ｃＤＮＡにはハイブリダイズしないことを確保することができる。また、リバース側プライマーは、配列番号１に示される塩基配列の対応領域（プライマーがハイブリダイズする領域）と完全に同一の塩基配列を有していることが好ましい（なお、リバース側プライマーは、アンチセンスプライマーであり、実際には、配列番号１に現実に記載されている塩基配列にハイブリダイズするものであるが、上記の通り、配列表に記載された配列は、二本鎖を示している場合も包含されるので、本明細書において、配列表に示される塩基配列中の特定の領域と同一の塩基配列を有するとは、その領域の二本鎖のいずれかの鎖に同一の塩基配列を有するということを意味する。ただし、この場合、上記の通り、リバース側プライマーは、アンチセンス鎖（配列表に実際に記載された配列の相補鎖）と同一の塩基配列を有する）。もっとも、正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第２の異常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしない又は増幅が起きないという要件が満たされる限り、少数の塩基が置換した配列を有していてもよい。この場合、相補鎖の塩基に対して非相補的な、置換した塩基の数は、プライマーの全塩基数の１０％以下であることが好ましい。また、プライマーの３’末端は、このような置換塩基ではないことが好ましい。なお、ヒトTS遺伝子として、配列番号１に示す塩基配列の一部が点突然変異した遺伝子も知られているが、このような点突然変異型遺伝子と同一の塩基配列を有するリバース側プライマーも、上記要件を満足する限り、本発明の方法に用いることができる。
【００１８】
上記フォワード側プライマー及びリバース側プライマーの塩基数は、特に限定されないが、それぞれ好ましくは１５〜３０である。また、上記説明において、「ハイブリダイズする」とは、例えば下記実施例に具体的に記載するような、ＰＣＲにおける通常の反応溶液中で、そのアニーリング工程に採用される温度（必ずしも限定されないが通常、５０〜６５℃程度）でハイブリダイズすることを意味する。
【００１９】
本願発明者は、配列番号１に示す塩基配列と相同性を有する偽遺伝子が存在するか否か、National Center for Biotechnology Information (NCBI)のデータベースからTS 遺伝子の偽遺伝子を検索した。検索の結果、ACCESSION No. D16517に2454bpからなるTS 遺伝子の偽遺伝子が存在した。TS 遺伝子とTS 偽遺伝子の相同性は図１及び図２に示すように79.29 %と高かった。本発明の方法では、細胞からｍＲＮＡを抽出し、上記した増幅方法を行うことが好ましいが、その場合でも、偽遺伝子ＤＮＡが混入する恐れを完全に排除することは困難である。従って、この偽遺伝子ＤＮＡが増幅されて偽陽性を生じることがないようにフォワード側プライマー又はリバース側プライマーを設定することが好ましい。
【００２０】
この偽遺伝子の塩基配列を、配列番号１に示す配列と整列させたものを図１及び図２に示す。図１及び図２に示されるように、エクソン２及びエクソン３領域では、両者の塩基は、配列番号１に示すTSのｃＤＮＡの210nt、213nt、230nt、231nt、233nt〜243nt、246〜248nt、269nt、289nt、295nt、300nt、313nt、324nt、327nt、332nt、335nt、340nt、343nt〜347nt、359nt、361nt、375nt、376nt、430nt、439nt及び450ntにおいて不一致となっている。従って、フォワード側プライマーは、これらの不一致の部位を少なくとも１つ含む領域にハイブリダイズするものであることが好ましい。すなわち、フォワード側プライマーは、上記した種々の部位の塩基から成る群から選ばれる少なくとも１つの塩基を含む領域にハイブリダイズするものであることが好ましい。この場合、フォワード側プライマーは、これらの群から選ばれる塩基に対応する塩基の数が、プライマー全体の塩基数の１０％を超えるものであることが好ましく、及び／又は、前記群から選ばれる塩基に対応する塩基を３’末端に有するものが好ましい。これらの場合には、フォワード側プライマーが偽遺伝子にハイブリダイズしないか、又は、プライマー３’末端にミスマッチがある場合には、プライマーがハイブリダイズしても増幅が起きにくい。
【００２１】
同様に、エクソン４領域では、両者の塩基は、配列番号１に示すTSのｃＤＮＡの464nt、468nt、473nt、474nt、482nt、488nt、500nt、507nt、509nt、510nt、512nt、513nt、515nt、517nt、519nt〜521nt、525nt、527nt〜529nt、531nt〜538nt、540nt〜544nt、547nt〜552nt及び554nt〜557ntにおいて不一致となっている。従って、リバース側プライマーは、これらの不一致の部位を少なくとも１つ含む領域にハイブリダイズするものであることが好ましい。すなわち、リバース側プライマーは、上記した種々の部位の塩基から成る群から選ばれる少なくとも１つの塩基を含む領域にハイブリダイズするものであることが好ましい。この場合、リバース側プライマーは、これらの群から選ばれる塩基に対応する塩基の数が、プライマー全体の塩基数の１０％を超えるものであることが好ましく、及び／又は、前記群から選ばれる塩基に対応する塩基を３’末端に有するものが好ましい。これらの場合には、リバース側プライマーが偽遺伝子にハイブリダイズしないか、又は、プライマー３’末端にミスマッチがある場合には、プライマーがハイブリダイズしても増幅が起きにくい。
【００２２】
フォワード側プライマー及びリバース側プライマーのいずれか一方が、上記偽遺伝子とハイブリダイズしない又は増幅が起きないものであれば、偽遺伝子が増幅されないので、偽遺伝子に起因する偽陽性を防止することができる。もっとも、念のために、フォワード側プライマーとリバース側プライマーの両者共が、上記偽遺伝子とハイブリダイズしない又は増幅が起きないものであることが好ましい。
【００２３】
ＰＣＲ自体は、周知の方法で行うことができ、下記実施例にも詳細な条件の例が記載されている。また、必要な試薬類や装置は全て市販されているので、これらの市販品を用いて容易に行うことができる。
【００２４】
ｍＲＮＡを正確に定量する場合には、ＰＣＲを、リアルタイム検出ＰＣＲで行うこともできる。リアルタイム検出ＰＣＲ法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp.7276-7280, August 1991, Biochemistry; 特表平６−５０００２１号公報）は、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のようなレポーター蛍光色素と、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）のようなクエンチャー蛍光色素とを１つのプローブに結合したプローブ(TaqMan（登録商標）プローブ）の存在下でＰＣＲを行うことにより、増幅産物が生成されるに従って、反応液中の蛍光強度が増加し、ＰＣＲの各サイクル後の蛍光強度をリアルタイムで測定することにより、試料中の被検核酸の量を測定する方法である。蛍光強度は、あるサイクル数の後に急に増加するが、この蛍光が急に増加するサイクル数が試料中の被検核酸の量と直線的な相関を有するため、蛍光強度をリアルタイムで測定することにより、試料中の被検核酸の量を正確に測定することができる。リアルタイム検出RT-PCRは、上記したRT-PCRのＰＣＲ工程を、TaqMan（登録商標）プローブの存在下で行うことにより容易に行うことができる。この場合のプローブは、ＰＣＲ増幅産物にハイブリダイズする（但し、プライマーがハイブリダイズする領域とは重複しない領域にハイブリダイズする）配列を有する核酸であれば何ら限定されない。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ法自体は周知であり、このためのキットも市販されているので、市販のキットを用いて容易に実施することができる。
【００２５】
ＰＣＲ増幅産物をリアルタイムで測定することにより、試料中の被検核酸の量を測定する方法として、リアルタイム検出ＰＣＲ法以外に、インターカレーションモニタリングPCR法、モレキュラービーコンプローブ法、ハイブリダイゼーションプローブ法、サンライズプライマー法などが挙げられるが、これらのいずれも本発明の方法に適用することができる。本発明の方法は、フォワード側プライマー及びリバース側プライマーの配列に特徴があるが、それ以外は、常法に従ってこれらの各種方法を容易に実施することができる。
【００２６】
本願発明の方法をRT-PCR法により行う場合について説明したが、本願発明の方法は、上記したフォワード側プライマー及びリバース側プライマーを用いてヒトTSのｃＤＮＡ又はｍＲＮＡの増幅を行う方法であればRT-PCR法に限定されるものではなく、他のいずれの核酸増幅法を採用することができる。例えば、NASBA法（3SR法、TMA法）によりｍＲＮＡを増幅することもできる。NASBA法では、リバース側プライマーの5'末端にT7プロモーター配列を付加したものをリバース側プライマーとして、AMT-RT等の逆転写酵素の存在下で、ｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を形成する。得られたRNA/DNA二本鎖ハイブリッドのＲＮＡ鎖をRNase Hにより分解して一本鎖ｃＤＮＡ（アンチセンス鎖）とする。次に、この一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、フォワード側プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素としてAMT-RTを用いる場合には、AMT-RTがＤＮＡポリメラーゼ活性を有するのでこれで兼用する）の存在下で相補鎖を形成して、二本鎖ｃＤＮＡとする。この二本鎖ｃＤＮＡは、T7プロモーター配列を含んでいるので、これにT7 RNAポリメラーゼを作用させると、転写によりＲＮＡ（アンチセンス鎖）が次々に形成される。さらに、形成された二本鎖ｃＤＮＡについて、変性工程、上記フォワード側プライマー及びリバース側プライマーとのアニーリング工程、相補鎖の伸長工程を繰り返すことにより、二本鎖ｃＤＮＡが増幅され、これを鋳型とした転写によりさらにＲＮＡ（アンチセンス鎖）が形成される。このようなNASBA法においても、フォワード側プライマー及びリバース側プライマーとして、上記したフォワード側プライマー及びリバース側プライマーを用いることにより、正常型TSのｍＲＮＡのみを増幅することができる（ただし、生成物は上記の通りアンチセンス鎖であるが、この場合にも本明細書では、「ｍＲＮＡを増幅する」と呼ぶ）。なお、NASBA法自体は周知であり、このためのキットも市販されているので、市販のキットを用いて容易に実施することができる。
【００２７】
以上のようにして正常型のｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのみを増幅することができる。
【００２８】
次に、増幅産物を測定する。本明細書において、「測定」には、検出と定量の両者が包含される。さらに、増幅産物の電気泳動バンドの蛍光強度測定や、太さの目視判定のような、簡易定量又は半定量も「測定」に包含される。増幅産物の測定は、上記の通り、正確な定量を行う場合には、リアルタイム検出RT-PCR法等のように、ＰＣＲを行いながらリアルタイムで蛍光を測定することにより行うことができる。また、増幅産物を電気泳動にかけ、増幅バンドを検出することにより行うことができる。また、増幅バンドの蛍光強度を測定することによっても行うことができる。さらに、電気泳動パターンをナイロンやニトロセルロースのメンブレンに転写し、増幅産物にハイブリダイズする標識プローブをハイブリダイズさせて、標識を検出又は定量する(PCR-Southern法）によっても行うことができる。さらには、増幅産物にハイブリダイズするプローブを固相化し、上記増幅工程を標識ヌクレオチドトリフォスフェートの存在下に行い、固相化プローブに増幅産物を結合させ、固相に結合された増幅産物を測定することによっても行うことができる。これらはいずれも常法であり、周知の方法により行うことができる。
【００２９】
本発明の第２の方法では、ヒトTS遺伝子の完全長ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第１の変異型ｃＤＮＡ及び第２の変異型ｃＤＮＡとはハイブリダイズしない核酸をフォワード側プライマー又はリバース側プライマーとして用いてヒトTS遺伝子のｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを増幅し、増幅産物を測定する。正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第１の変異型及び第２の変異型ｃＤＮＡのいずれともハイブリダイズしない核酸は、エクソン３とエクソン４の領域に跨る領域にハイブリダイズする核酸である。この場合、プライマーの全長の２０％以上８０％以下、さらに好ましくは４０％以上６０％以下がエクソン３の領域にハイブリダイズし、残りがエクソン４の領域にハイブリダイズするものであることが好ましい。このプローブは、第１の変異型ｃＤＮＡではエクソン３が欠失しているので、ハイブリダイズすることができず、第２の変異型ｃＤＮＡではエクソン４が欠失しているのでやはりハイブリダイズすることができず、正常型のｃＤＮＡ又はｍＲＮＡとのみハイブリダイズする。上記領域にハイブリダイズするプライマーは、フォワード側プライマーであってもリバース側プライマーであってもよく、増幅に用いるもう一方のプライマーは、正常型ｃＤＮＡの任意の領域にハイブリダイズするものであってよい。もっとも、フォワード側プライマーは、リバース側プライマーよりも上流の領域にハイブリダイズするものである。
【００３０】
第２の方法に用いられるプライマーも、偽遺伝子による偽陽性を排除するために、配列番号１で示される塩基配列中の210nt、213nt、230nt、231nt、233nt〜243nt、246〜248nt、269nt、289nt、295nt、300nt、313nt、324nt、327nt、332nt、335nt、340nt、343nt〜347nt、359nt、361nt、375nt、376nt、430nt、439nt、450nt、464nt、468nt、473nt、474nt、482nt、488nt、500nt、507nt、509nt、510nt、512nt、513nt、515nt、517nt、519nt〜521nt、525nt、527nt〜529nt、531nt〜538nt、540nt〜544nt、547nt〜552nt及び554nt〜557ntから成る群から選ばれる少なくとも１つの塩基を含む領域にハイブリダイズするものが好ましい。
【００３１】
第２の方法に用いられるプライマーについての他の説明、すなわち、種々の好ましい又は許容できる態様等については、上記したフォワード側プライマー又はリバース側プライマーについての説明を適用できる。また、増幅方法や増幅産物の測定方法は、プライマーの種類とは関係がないので、上記した本願発明の方法についての説明を適用できる。
【００３２】
本発明は、また、上記フォワード側プライマー及びリバース側プライマーを少なくとも含むヒトTS ｍＲＮＡの測定用キットをも提供する。また、本発明は、上記第２の方法に用いられるフォワード側プライマー又はリバース側プライマーを少なくとも含むヒトTS ｍＲＮＡの測定用キットをも提供する。キットに含まれる試薬類は、本発明のプライマー以外は周知のものであり、例えば、下記実施例に記載されているように、M-MLV逆転写酵素、Taq DNAポリメラーゼ、dNTP、ランダムプライマー、RNase阻害剤、緩衝液等を含めてキットにすることができる。あるいは、キットは、フォワード側プライマー及びリバース側プライマーのみを含むものとし、他の試薬類は、市販のRT-PCR用キット等を利用するようにしても良い。
【００３３】
本発明は、さらに、ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子の完全長ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡとはハイブリダイズするが、上記第１の変異型ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ又は上記第２の変異型ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡとはハイブリダイズしない核酸から成るヒトTSのｃＤＮＡ又はｍＲＮＡの測定用プローブをも提供する。このようなプローブとしては、上記したフォワード側プライマー及びリバース側プライマーとして用いることができる核酸を本発明のプローブとして用いることができる。プローブは、上記本発明の方法により増幅される増幅産物にハイブリダイズするものが好ましい。なお、プローブの好ましい塩基数は、１０〜増幅産物の全長、さらには１５〜増幅産物の全長である。
【００３４】
さらに、本発明は、正常型ｃＤＮＡとはハイブリダイズするが、第１の変異型ｃＤＮＡ及び第２の変異型ｃＤＮＡのいずれにもハイブリダイズしない核酸から成るプローブをも提供する。このようなプローブは、エクソン３及びエクソン４に跨る領域にハイブリダイズするものである。この場合、プローブの全長の２０％以上８０％以下、さらに好ましくは４０％以上６０％以下がエクソン３の領域にハイブリダイズし、残りがエクソン４の領域にハイブリダイズするものであることが好ましい。このプローブは、第１の変異型ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡではエクソン３が欠失しているので、ハイブリダイズすることができず、第２の変異型ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡではエクソン４が欠失しているのでやはりハイブリダイズすることができず、正常型のｃＤＮＡ又はｍＲＮＡとのみハイブリダイズする。このプローブの場合、プローブのサイズは、特に限定されないが、１０〜１００程度が好ましく、さらに好ましくは１５〜５０程度である。また、プライマーの場合と同様、プローブがハイブリダイズする領域と完全に同一の塩基配列を有することが最も好ましいが、プローブ全長の１０％以下の塩基が置換していてもよい。なお、本明細書において、プローブが「ハイブリダイズする」とは、サザンブロット等の、核酸プローブをハイブリダイズさせて被検核酸を検出する方法において採用される一般的な条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【００３５】
プローブは、上記核酸に蛍光標識、ビオチン標識、放射標識、酵素標識等の周知の標識を結合して標識プローブとすることもでき、このような標識プローブも言うまでもなく本発明のプローブに包含される。また、プローブは、例えば固相化プローブとして用いる場合に、固相に結合させる領域や、分枝プローブにおける標識を結合させるための分枝のような、被検核酸とは無関係な任意の核酸が結合されたものであってもよい。
【００３６】
本発明のプローブは、上記した本発明の方法により増幅された増幅核酸の測定に用いることができる。上記した、本発明の方法をリアルタイム検出RT-PCRにより行う場合のTaqMan（登録商標）プローブ等も本発明のプローブである。また、本発明のプローブは、本発明の方法による増幅を経ていない（すなわち、全く増幅されていないか、本発明の方法以外の方法で増幅された）、ヒトTSのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの測定にも用いることができる。とりわけ、上記した、正常型とはハイブリダイズするが第１及び第２の変異型のいずれともハイブリダイズしないプローブを用いると、正常型ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのみを測定することができる。また、第１及び第２の変異型のいずれか一方とはハイブリダイズするプローブであっても、エクソン２及び３から成る領域にハイブリダイズする第１の変異型用プローブと、エクソン４領域にハイブリダイズする第２の変異型用プローブを用い、いずれのプローブでも測定されるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡが正常型という判定を行うことは可能である。増幅せずにプローブで正常型ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを測定する場合には、プローブとしては、１つのプローブに多数の分枝を形成し、各分枝に標識を結合させることにより多数の標識を結合させた、いわゆる分枝型プローブを用いることにより測定感度を向上させることができる。
【００３７】
なお、本発明により、第１及び第２の変異型が発見されたので、正常型ヒトTSのみと反応する抗体を提供することも可能になった。すなわち、エクソン３とエクソン４に跨る領域によってコードされるペプチド領域をエピトープとする抗体は、第１及び第２の変異型のいずれとも免疫反応せず、正常型ヒトTSとのみ免疫反応する。このような抗体は、常法により、ヒトTSを免疫原としてモノクローナル抗体を作製し、ELISA等の免疫測定により、エクソン３とエクソン４に跨る領域によってコードされるペプチドと免疫反応するものをスクリーニングすることによって得ることができる。あるいは、エクソン３とエクソン４に跨る領域によってコードされるペプチドを、単独で、あるいはキーホールリンペットヘモシアニンやウシ血清アルブミンのような担体に結合した該ペプチドを免疫原とした常法により抗体（モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい）を得ることもできる。
【００３８】
本発明の方法を適用する試料は、特に限定されず、いかなる組織由来の細胞中のｍＲＮＡであってよい。胃癌、大腸癌等の各種固形癌細胞や血液癌細胞由来のｍＲＮＡが好ましい。細胞からｍＲＮＡを抽出して本発明の方法を適用することが好ましいが、ｍＲＮＡの抽出は必須的ではない。なお、細胞からのｍＲＮＡの抽出は、市販のｍＲＮＡ抽出用試薬を用いる常法により容易に行うことができる。
【００３９】
本発明の方法により、正常型のヒトTSｍＲＮＡのみを測定することにより、従来のｍＲＮＡの測定方法を用いる場合と比較して、より正確に、抗癌剤治療による予後を予測することができる。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４１】
(I)TS mRNA スプライシング変異体（バリアント）の発見
(1)プライマーの合成
TS遺伝子のエクソン１領域に設定したプライマー5'-gtc ggt att cgg cat gca gg-3'を化学合成し、フォワードプライマーとし、TS遺伝子のエクソン５領域に設定したプライマー5'-aga act ggc aga ggg cat gg-3'を化学合成し、リバースプライマーとした。
【００４２】
(2)核酸抽出およびcDNA合成
胃癌組織由来セルラインKATO III、MKN45 (入手先：American Type Culture Collection (ATCC))および健常人末梢血細胞 10⁶個からDNAをGENOMIX(TALENT社製)を用いて抽出した。10⁶個の細胞に溶液１(GENOMIX)を1.5mL加え、15分間65℃で保温後、クロロホルム３mL加え、転倒混和した。3000×g 10分間遠心し、上層に溶液２(GENOMIX)を３mL加え、3000×g 10分間遠心した。遠心後、沈澱に1.5mLの溶液３(GENOMIX)を加え溶解し、溶解後、100%エタノールを加え、3000×g 10分間遠心した。遠心後、５mLの70%エタノールで洗浄し、50μLのTE溶液(2M Tris-HCl, 0.2M EDTA (pH8.5))で溶解した。
【００４３】
また、10⁶個の細胞にRNA抽出試薬 Isogen (日本ジーン社製)１mLを添加し、30秒攪拌した。攪拌後、200μLのクロロホルムを添加し、再度30秒攪拌した。攪拌後、12000×g 15分間遠心し、水相に等量のイソプロパノールを加え、12000×g 15分間遠心した。遠心後、１mLの75%エタノールで２回洗浄し、50μLのRNase阻害剤添加DEPC処理水で溶解した。溶解したRNA溶液から、以下のcDNA合成溶液を用いてcDNAを合成した。cDNA合成は１時間実施した。反応溶液の組成は次の通りであった。
【００４４】

*Gibco BRL社製M-MLV逆転写酵素に付属
【００４５】
(3)PCR反応
(1)で合成したプライマーを用いてPCR反応を実施した。

* rTaq DNAポリメラーゼに付属
【００４６】
PCR反応は95℃/30秒、60℃/30秒、72℃/30秒を１サイクルとし、40サイクル実施した。増幅産物は2.5%アガロースゲル電気泳動により、目的増幅産物の確認(437bp)をした。
【００４７】
上記(1)、(2)、(3)の操作により、胃癌セルラインにおいて、目的増幅産物(437bp)の他に、335bp付近、188bp付近に増幅産物が確認された。健常人末梢血からは、目的増幅産物(437bp)のみが確認された。また、DNA由来増幅産物は確認されなかった。
【００４８】
胃癌セルラインから検出された335bp付近および188bp付近の増幅産物をアガロースゲルから切り出し、ゲルから核酸を抽出するためにSUPREC-01(宝酒造製)にセットした。セット後、5000×gで５分間遠心し、SUPREC-01の下層に溶出した溶液を回収した。
【００４９】
(4)PCR反応
(1)で合成したプライマーを用いてPCR反応を実施した。

* rTaq DNAポリメラーゼに付属
【００５０】
PCR反応は95℃/30秒、60℃/30秒、72℃/30秒を１サイクルとし、40サイクル実施した。増幅産物は2.5%アガロースゲル電気泳動により、目的増幅産物の確認(335bpおよび188bp)をした。
【００５１】
(5)塩基配列の決定
上記操作により、増幅した335bp付近および188bp付近のPCR産物をシーブカラムにセットし、2500×gで１分間遠心し、増幅産物を精製した。精製した２種類の増幅産物をダイレクトシークエンス法によって、塩基配列を決定した。
【００５２】
(1)で合成したプライマーを用いてサイクルシークエンス反応を実施した。

【００５３】
ダイレクトシークエンス反応は96℃/10秒、50℃/5秒、60℃/4分を１サイクルとし、25サイクル実施した。

*ABI PRIZM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit
(Applied Biosystems社製)。
【００５４】
ダイレクトシークエンス反応は96℃/10秒、50℃/5秒、60℃/4分を１サイクルとし、25サイクル実施した。
【００５５】
反応終了後、ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems、HITACHI社製)にて塩基配列を得た。得られたフォワードプライマー側からの塩基配列(センス鎖)とリバースプライマー側からの塩基配列(アンチセンス鎖)を比較し、最終的に塩基配列を決定した。
【００５６】
上記(5)の操作により、２種類の増幅産物の塩基配列を決定した。決定された塩基配列はTS 遺伝子(Full length isoform)に対し、エクソン２およびエクソン３が欠失し、他はTS遺伝子と同じもの(バリアント 1（第１の変異型）)、エクソン４が欠失し、他はTS遺伝子と同じもの（バリアント 2)（第２の変異型））の２種類であった。バリアント１及びバリアント２の塩基配列及び推定アミノ酸配列を配列表の配列番号２及び３にそれぞれ示す。
【００５７】
(II) TS バリアント1およびバリアント2の特異的検出
(6)プライマーの合成
バリアント1を検出するために、TS遺伝子のエクソン１およびエクソン４領域にオーバーラップしたプライマー5'-cgc gct aca gcc tga gag att att ca-3'を化学合成し、フォワードプライマーとし、TS遺伝子のエクソン７領域に設定したプライマー5'-gga aag gtc tgg gtt ctc gct-3'を化学合成し、リバースプライマーとした。
【００５８】
バリアント2を検出するために、TS遺伝子のエクソン３およびエクソン５領域にオーバーラップしたプライマー5'-aga ata cag aga tat gga atc aga tct tcc-3'を化学合成し、フォワードプライマーとし、TS遺伝子のエクソン７領域に設定したプライマー5'-gga aag gtc tgg gtt ctc gct-3'を化学合成し、リバースプライマーとした。
【００５９】
(7)RNA抽出およびcDNA合成
胃癌組織由来セルラインKATO III、MKN45 (入手先：ATCC)、大腸癌組織由来セルラインHCT15(入手先：ATCC)および健常人末梢血細胞 10⁶個からDNAをGENOMIX (TALENT社製)を用いて抽出した。10⁶個の細胞に溶液１(GENOMIX)を1.5mL加え、15分間65℃で保温後、クロロホルム３mL加え、転倒混和した。3000×g 10分間遠心し、上層に溶液２(GENOMIX)を３mL加え、3000×g 10分間遠心した。遠心後、沈澱に1.5mLの溶液３(GENOMIX)を加え溶解し、溶解後、100%エタノールを加え、3000×g 10分間遠心した。遠心後、５mLの70%エタノールで洗浄し、50μLのTE溶液(2M Tris-HCl, 0.2M EDTA (pH8.5))で溶解した。
【００６０】
また、10⁶個の細胞にRNA抽出試薬 Isogen (日本ジーン社製)１mLを添加し、30秒攪拌した。攪拌後、200μLのクロロホルムを添加し、再度30秒攪拌した。攪拌後、12000×g 15分間遠心し、水相に等量のイソプロパノールを加え、12000×g 15分間遠心した。遠心後、１mLの75%エタノールで２回洗浄し、50μLのRNase阻害剤添加DEPC処理水で溶解した。溶解したRNA溶液から、以下のcDNA合成溶液を用いてcDNAを合成した。cDNA合成は１時間実施した。反応溶液の組成は次の通りであった。
【００６１】

*Gibco BRL社製M-MLV逆転写酵素に付属
【００６２】
(8)PCR反応
(6)で合成したプライマーを用いてPCR反応を実施した。

* rTaq DNAポリメラーゼに付属
【００６３】
PCR反応は95℃/30秒、60℃/30秒、72℃/30秒を１サイクルとし、40サイクル実施した。増幅産物は2.5%アガロースゲル電気泳動により、目的増幅産物の確認(393bp)をした。
【００６４】

* rTaq DNAポリメラーゼに付属
【００６５】
PCR反応は95℃/30秒、60℃/30秒、72℃/30秒を１サイクルとし、40サイクル実施した。増幅産物は2.5%アガロースゲル電気泳動により、目的増幅産物の確認(296bp)をした。
【００６６】
上記(6)、(7)、(8)の操作により、胃癌および大腸癌セルラインにおいて、TS バリアント1 mRNA由来増幅産物が確認された。健常人末梢血からは、増幅産物は確認されなかった。また、DNA由来増幅産物は確認されなかった。
【００６７】
上記(6)、(7)、(8)の操作により、胃癌および大腸癌セルラインにおいて、TS バリアント2 mRNA由来増幅産物が確認された。健常人末梢血からは、増幅産物は確認されなかった。また、DNA由来増幅産物は確認されなかった。
【００６８】
(III) TS full length isoform mRNAの特異的検出
(9)偽遺伝子の検索
TS 遺伝子のfull length isoform mRNAを特異的に検出するために、抽出したRNAに混入したDNA由来の増幅を排除する必要がある。このため、National Center for Biotechnology Information (NCBI)のデータベースからTS 遺伝子の偽遺伝子を検索した。検索の結果、ACCESSION No. D16517に2454bpからなるTS 遺伝子の偽遺伝子が存在した。TS 遺伝子とTS 偽遺伝子の相同性は図１及び図２に示すように79.29 %と高かった。
【００６９】
(10)プライマーの合成
バリアント1およびバリアント2を検出しないために、エクソン２あるいは３にフォワードプライマーを、エクソン４にリバースプライマーを設定し、一方、偽遺伝子を検出しないプライマーを設定した。すなわち、TS遺伝子のエクソン３領域に設定したプライマー5'-cag cct ggg att ctc cac ca-3'を化学合成し、フォワードプライマーとし、TS遺伝子のエクソン４領域に設定したプライマー5'-atg atg att ctt ctg tcg tca ggg-3'を化学合成し、リバースプライマーとした。
【００７０】
(11)RNA抽出およびcDNA合成
胃癌組織由来セルラインKATO III、MKN45 (入手先：ATCC)、大腸癌組織由来セルラインHCT15(入手先：ATCC)および健常人末梢血細胞 10⁶個からDNAをGENOMIX (TALENT社製)を用いて抽出した。10⁶個の細胞に溶液１(GENOMIX)を1.5mL加え、15分間65℃で保温後、クロロホルム３mL加え、転倒混和した。3000×g 10分間遠心し、上層に溶液２(GENOMIX)を３mL加え、3000×g 10分間遠心した。遠心後、沈澱に1.5mLの溶液３(GENOMIX)を加え溶解し、溶解後、100%エタノールを加え、3000×g 10分間遠心した。遠心後、５mLの70%エタノールで洗浄し、50μLのTE溶液(2M Tris-HCl, 0.2M EDTA (pH8.5))で溶解した。
【００７１】
また、10⁶個の細胞にRNA抽出試薬 Isogen (日本ジーン社製)１mLを添加し、30秒攪拌した。攪拌後、200μLのクロロホルムを添加し、再度30秒攪拌した。攪拌後、12000×g 15分間遠心し、水相に等量のイソプロパノールを加え、12000×g 15分間遠心した。遠心後、１mLの75%エタノールで２回洗浄し、50μLのRNase阻害剤添加DEPC処理水で溶解した。溶解したRNA溶液から、以下のcDNA合成溶液を用いてcDNAを合成した。cDNA合成は１時間実施した。反応溶液の組成は次の通りであった。
【００７２】

*Gibco BRL社製M-MLV逆転写酵素に付属
【００７３】
(12)PCR反応
(10)で合成したプライマーを用いてPCR反応を実施した。

* rTaq DNAポリメラーゼに付属
【００７４】
PCR反応は95℃/30秒、60℃/30秒、72℃/30秒を１サイクルとし、40サイクル実施した。増幅産物は2.5%アガロースゲル電気泳動により、目的増幅産物の確認(170bp)をした。
【００７５】
上記(10)、(11)、(12)の操作により、胃癌、大腸癌セルラインおよび末梢血において、目的増幅産物(170bp)が確認された。DNA由来増幅産物は確認されなかった。
【００７６】
【発明の効果】
本発明により、ヒトTS遺伝子の新たなオルタナティブスプライシングが見出され、これらのスプライシングバリアント以外の正常型のヒトTS mRNAのみを測定する方法が提供された。本発明の方法により癌細胞中のヒトTS ｍＲＮＡを測定することにより、従来の方法を用いる場合に比較して、抗癌剤治療による予後をより正確に判定することが可能になる。
【００７７】
【配列表】

【００７８】

【００７９】

【００８０】

【００８１】

【００８２】

【００８３】

【００８４】

【００８５】

【００８６】

【００８７】

【００８８】

【００８９】

【図面の簡単な説明】
【図１】正常型ヒトTSｃＤＮＡと偽遺伝子の塩基配列を整列させて示す図である。
【図２】図１の続きである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for measuring human thymidylate synthase cDNA, and primers, probes and kits used therefor.
[0002]
[Prior art]
Thymidylate synthase (EC2.1.1.45, hereinafter referred to as “TS”) is an enzyme that catalyzes the reaction of producing thymidylate from deoxyuridylate, which is essential for the supply of thymine. And one of the rate-limiting enzymes in the DNA precursor supply pathway. Therefore, it is known that the amount of production increases in cancer cells with high cell proliferation.
[0003]
On the other hand, fluoropyrimidine anticancer agents such as 5-fluorouracil (hereinafter sometimes referred to as “5-FU”) and 5-fluorodeoxyuridine target TS. For example, 5-FU undergoes ribosylation and phosphorylation in vivo to form 5-fluoro-2'-deoxyuridine 5'-phosphate, which inhibits TS that converts deoxyuridylic acid to thymidylate. Suppresses DNA synthesis.
[0004]
Fluoropyrimidine-based anticancer agents such as 5-FU are known to work well against cancer cells with a small amount of TS, but not so well against cancer cells with a large amount of TS. Therefore, measuring the production amount of TS in cancer cells is useful for predicting the therapeutic effect of an anticancer agent and selecting an anticancer agent. It is also known that TS production in cancer cells is reduced or prevented during the treatment period when therapeutic effects are obtained with these anticancer agents, and the production of TS in cancer cells is measured. It is also useful for determining the therapeutic effect of an anticancer agent.
[0005]
Conventionally, measurement of TS production in cells is often performed by immunoassay. In addition, TS production is measured by measuring the amount of TS mRNA in cancer cells, thereby predicting the prognosis of anticancer drug treatment. The amount of mRNA is measured by a method including a nucleic acid amplification process, such as a real-time detection RT-PCR method or an RT-PCR Southern method.
[0006]
However, there are often cases where the prognosis is good even though the amount of TS mRNA in cancer cells does not decrease, and the reliability of the method for measuring prognosis by measuring mRNA by conventional methods is not always satisfactory.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for measuring TS mRNA, and a primer, probe and kit therefor, capable of accurately measuring only TS having activity.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of earnest research, the inventors of the present application have found that human TS gene exon 2 and exon 3 are deleted by alternative splicing in human gastric cancer tissue-derived cell lines and human colon cancer tissue-derived cell lines. And / or a mutant mRNA lacking exon 4 was found to be produced. An enzyme in which one or two exons are all deleted is considered to have no enzyme activity. Therefore, in consideration of these alternative splicing, it is possible to measure the production of active TS by measuring only normal TS mRNA without these exon deletions. The present invention provides a method for measuring only normal TS mRNA without these exon deletions, and primers, probes, and kits therefor.
[0009]
That is, the present invention provides a nucleic acid that hybridizes with the full-length cDNA of the human thymidylate synthase gene but does not hybridize with the first mutant cDNA lacking exons 2 and 3 of the human thymidylate synthase gene. Used as a forward primer, a nucleic acid that hybridizes with the full-length cDNA of the human thymidylate synthase gene but does not hybridize with the second mutant cDNA lacking exon 4 of the human thymidylate synthase gene. Amplifying cDNA or mRNA of human thymidylate synthase gene and measuring the amplification product. The number of bases of the forward side primer and reverse side primer is 15 bases or more, respectively. A method for measuring human thymidylate synthase mRNA is provided.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Human TS cDNA has already been cloned, and its nucleotide sequence has also been reported. The nucleotide sequence of human TS cDNA is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. In the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, the first base (in this specification, for example, the first base is expressed as “1nt”) to 205 nt is exon 1, 206 nt to 279 nt is exon 2, 280nt to 454nt corresponds to exon 3, 455nt to 556nt corresponds to exon 4, 557nt to 732nt corresponds to exon 5, 733nt to 804nt corresponds to exon 6, and 805nt and subsequent areas correspond to exon 7.
[0011]
As described in detail in the Examples below, the present inventor has deleted all regions of exon 2 and exon 3 in KATO III cells and MKN45 cells, which are cell lines derived from human gastric cancer tissue, and other regions are normal. Mutant mRNAs (mutants in which exon 2 and exon 3 are deleted are referred to herein as “first mutants”), as well as the entire region of exon 4, and other regions are normal It was found that a mutant type mRNA (a mutant type in which exon 4 is deleted is referred to as “second mutant type” in the present specification). Furthermore, it was confirmed that these mutant mRNAs were also generated in HCT15 cells, which are human colon cancer tissue-derived cell lines. In these mutations, the entire region of one or two exons is completely deleted, and no deletion occurs in the other regions. Therefore, it is considered that these mutations are due to alternative splicing. . The occurrence of such alternative splicing for the human TS gene has been found for the first time in the world by the present inventors, and the present invention is based on this new finding.
[0012]
In the first and second mutants described above, the entire region of one or two exons is completely deleted. Therefore, TS generated by translating these mutant mRNAs is an enzyme. It is considered that there is no activity. The method of the present invention is applicable to mRNAs without these alternative splicing deletions or cDNAs formed using them as templates (in this specification, TS mRNAs or cDNAs without these alternative splicing are referred to as “normal type”, respectively). (Referred to as “mRNA or cDNA”).
[0013]
The inventor of the present application, when measuring human TS mRNA or cDNA formed using the mRNA as a template, hybridizes with normal cDNA but does not hybridize with the first abnormal cDNA, Only normal mRNA or cDNA can be amplified by amplifying human mRNA or cDNA using a reverse primer that hybridizes with normal cDNA but does not hybridize with the second abnormal cDNA. I came up with it. This is because the first mutant mRNA or cDNA cannot be amplified because the forward primer cannot be hybridized, and the second mutant mRNA or cDNA cannot be amplified because the reverse primer cannot be hybridized. This is because only normal mRNA or cDNA can be amplified.
[0014]
An example of such an amplification method is the RT-PCR method. The RT-PCR method itself is well known, and kits therefor are also commercially available, and can be easily carried out using such commercially available kits. In the RT-PCR method, first, mRNA is extracted from a specimen, and cDNA is formed using the extracted mRNA as a template. The cDNA may be formed using a primer that specifically hybridizes to the target mRNA, or may be formed using a primer that hybridizes to the total mRNA such as a random primer. . Formation of cDNA can be performed by forming a complementary strand of DNA using mRNA as a template in the presence of a primer and reverse transcriptase, and then forming DNA using the formed complementary strand DNA as a template. In this way, double-stranded cDNA can be obtained.
[0015]
Next, the formed double-stranded cDNA is amplified by PCR. At this time, a primer that hybridizes with the normal cDNA but does not hybridize with the first abnormal cDNA is used as the forward primer, and hybridizes with the normal cDNA as the reverse primer. Primers that do not hybridize to the abnormal cDNAs are used. Since amplification does not occur unless both the forward primer and the reverse primer are hybridized to the template cDNA, the first abnormal type and the second abnormal are obtained by performing amplification using these forward primer and reverse primer. None of the type cDNA is amplified, only the normal type cDNA is amplified.
[0016]
As a forward primer that hybridizes with normal type cDNA but does not hybridize with first abnormal type cDNA, 206 nt of DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is within exon 2 and exon 3 region. What hybridizes at least a part within a region of ˜454 nt can be used. The forward primer is a sense primer and actually hybridizes to the complementary strand of the base sequence actually described in SEQ ID NO: 1. In the sequence listing, the base sequence of the sense strand of the double strand is to be described according to the rule, so only the single strand base sequence is described, but actually the double strand May be displayed. Therefore, in this specification, hybridizing to a specific region in the base sequence shown in the sequence listing means to hybridize to any one of the double strands in the region. However, as described above, the forward primer hybridizes to the antisense strand (the complementary strand of the sequence actually described in the sequence listing). The forward primer preferably hybridizes within the exon 2 and exon 3 regions (in the region of 206 nt to 454 nt of SEQ ID NO: 1), but spans the exon 1 or exon 4 region. May be. In this case, it is preferable that at least the 3 ′ end of the primer is paired with a base in the region of exon 2 or exon 3, and / or 20% or more, more preferably 50% of the primer region. The above region is preferably one that hybridizes to the exon 2 or exon 3 region. By adopting such a primer, even if it hybridizes to a region straddling the region of exon 1 or exon 4, the primer hybridizes if there is a mismatch at the 3 ′ end of the primer. In the primer region, 20% or more, more preferably 50% or more of the primer region hybridizes to the exon 2 or exon 3 region. It can be ensured that it does not hybridize to cDNA. The forward primer preferably has the completely same base sequence as the corresponding region of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (region where the primer hybridizes), but hybridizes with normal cDNA. However, it may have a sequence in which a small number of bases are substituted as long as the requirement that it does not hybridize to the first abnormal cDNA or amplification does not occur is satisfied. In this case, the number of substituted bases that are non-complementary to the bases of the complementary strand is preferably 10% or less of the total number of bases of the primer. Further, the 3 ′ end of the primer is preferably not such a substituted base. In addition, as a human TS gene, a gene in which a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is point mutated is known, but a forward primer having the same base sequence as such a point mutated gene is also used. As long as the above requirements are satisfied, it can be used in the method of the present invention.
[0017]
As a reverse primer that hybridizes with normal type cDNA but does not hybridize with second abnormal type cDNA, exon 4 region, that is, 455nt to 556nt of DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 Those in which at least a part thereof hybridizes in the region can be used. The reverse primer is an antisense primer that hybridizes to the base sequence actually described in SEQ ID NO: 1. The reverse primer preferably hybridizes entirely within the region of exon 4 (within the region of 455 nt to 556 nt of SEQ ID NO: 1), but may extend over the region of exon 3 or exon 5. . In this case, it is preferable that at least the 3 ′ end of the primer is paired with a base in the region of exon 4, and / or 20% or more, more preferably 50% or more of the region of the primer Is preferably hybridized to the exon 4 region. By adopting such a primer, even if it hybridizes to a region straddling the region of exon 3 or exon 5, the primer hybridizes if there is a mismatch at the 3 ′ end of the primer. In the second mutant cDNA, amplification is difficult to occur, and more than 20%, more preferably 50% or more of the primer region hybridizes to the exon 4 region. It can be ensured that no hybridization occurs. Further, the reverse primer preferably has the completely same base sequence as the corresponding region of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (the region where the primer hybridizes). Although it is a sense primer and actually hybridizes to the base sequence actually described in SEQ ID NO: 1, as described above, the sequence described in the sequence listing shows a double strand In this specification, having the same base sequence as a specific region in the base sequence shown in the sequence listing means that the base sequence is the same as any one of the double strands in the region. However, in this case, as described above, the reverse primer has the same base sequence as the antisense strand (complementary to the sequence actually described in the sequence listing). To). However, it may have a sequence in which a small number of bases are substituted as long as the requirement that it hybridizes with normal cDNA but does not hybridize with second abnormal cDNA or amplification does not occur is satisfied. In this case, the number of substituted bases that are non-complementary to the bases of the complementary strand is preferably 10% or less of the total number of bases of the primer. Further, the 3 ′ end of the primer is preferably not such a substituted base. In addition, as a human TS gene, a gene in which a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is point-mutated is also known, but a reverse primer having the same base sequence as such a point-mutated gene is also used. As long as the above requirements are satisfied, it can be used in the method of the present invention.
[0018]
The number of bases of the forward side primer and the reverse side primer is not particularly limited, but is preferably 15 to 30 respectively. In the above description, “hybridize” means, for example, a temperature employed in the annealing step in a normal reaction solution in PCR as specifically described in the following examples (although it is not necessarily limited, usually , About 50-65 ° C.).
[0019]
The inventor of the present application searched the pseudogene of the TS gene from the database of National Center for Biotechnology Information (NCBI) to determine whether or not a pseudogene having homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 exists. As a result of the search, there was a pseudo gene of TS gene consisting of 2454 bp in ACCESSION No. D16517. The homology between the TS gene and the TS pseudogene was as high as 79.29% as shown in FIGS. In the method of the present invention, it is preferable to extract mRNA from cells and carry out the amplification method described above. However, even in such a case, it is difficult to completely eliminate the possibility of contamination with pseudogene DNA. Therefore, it is preferable to set a forward primer or a reverse primer so that the pseudogene DNA is not amplified and false positives are generated.
[0020]
The pseudogene base sequence aligned with the sequence shown in SEQ ID NO: 1 is shown in FIGS. As shown in FIGS. 1 and 2, in the exon 2 and exon 3 regions, both bases are 210nt, 213nt, 230nt, 231nt, 233nt to 243nt, 246 to 248nt, 269nt of the TS cDNA shown in SEQ ID NO: 1. 289nt, 295nt, 300nt, 313nt, 324nt, 327nt, 332nt, 335nt, 340nt, 343nt to 347nt, 359nt, 361nt, 375nt, 376nt, 430nt, 439nt and 450nt. Accordingly, the forward primer is preferably one that hybridizes to a region containing at least one of these mismatched sites. That is, the forward primer is preferably one that hybridizes to a region containing at least one base selected from the group consisting of the bases at the various sites described above. In this case, the forward primer preferably has a number of bases corresponding to a base selected from these groups that exceeds 10% of the total number of bases in the primer and / or a base selected from the above group. Those having a base corresponding to are at the 3 ′ end are preferred. In these cases, if the forward primer does not hybridize to the pseudogene or there is a mismatch at the primer 3 ′ end, amplification is unlikely to occur even if the primer is hybridized.
[0021]
Similarly, in the exon 4 region, both bases are 464nt, 468nt, 473nt, 474nt, 482nt, 488nt, 500nt, 507nt, 509nt, 510nt, 512nt, 513nt, 515nt, 517nt, of the TS cDNA shown in SEQ ID NO: 1. There is a discrepancy between 519nt to 521nt, 525nt, 527nt to 529nt, 531nt to 538nt, 540nt to 544nt, 547nt to 552nt and 554nt to 557nt. Therefore, the reverse primer is preferably one that hybridizes to a region containing at least one of these mismatched sites. That is, the reverse primer is preferably one that hybridizes to a region containing at least one base selected from the group consisting of bases at various sites described above. In this case, the reverse primer preferably has a number of bases corresponding to a base selected from these groups that exceeds 10% of the total number of bases in the primer, and / or a base selected from the above group. Those having a base corresponding to are at the 3 ′ end are preferred. In these cases, if the reverse primer does not hybridize to the pseudogene or there is a mismatch at the primer 3 ′ end, amplification does not easily occur even if the primer is hybridized.
[0022]
If either one of the forward side primer and the reverse side primer does not hybridize with the pseudogene or does not cause amplification, the pseudogene is not amplified, and thus false positives caused by the pseudogene can be prevented. . However, as a precaution, it is preferable that both the forward side primer and the reverse side primer do not hybridize with the pseudogene or cause amplification.
[0023]
PCR itself can be performed by a known method, and detailed examples of conditions are also described in the following examples. In addition, since all necessary reagents and devices are commercially available, it can be easily performed using these commercially available products.
[0024]
When mRNA is accurately quantified, PCR can also be performed by real-time detection PCR. Real-time detection PCR method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp. 7276-7280, August 1991, Biochemistry; JP 6-500021) discloses FAM (6-carboxy-fluorescein). PCR in the presence of a probe (TaqMan® probe) in which a reporter fluorescent dye such as) and a quencher fluorescent dye such as TAMRA (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) are bound to one probe. As the amplification product is generated, the fluorescence intensity in the reaction solution increases, and the amount of the test nucleic acid in the sample is measured by measuring the fluorescence intensity after each cycle of PCR in real time. It is. Fluorescence intensity increases rapidly after a certain number of cycles, but the number of cycles at which this fluorescence increases has a linear correlation with the amount of test nucleic acid in the sample, so fluorescence intensity can be measured in real time. Thus, the amount of the test nucleic acid in the sample can be accurately measured. Real-time detection RT-PCR can be easily performed by performing the above-described RT-PCR PCR step in the presence of a TaqMan (registered trademark) probe. The probe in this case is not limited as long as it is a nucleic acid having a sequence that hybridizes to a PCR amplification product (however, it hybridizes to a region that does not overlap with a region to which a primer hybridizes). In addition, since the real-time detection PCR method itself is well known and a kit for this purpose is also commercially available, it can be easily carried out using a commercially available kit.
[0025]
In addition to the real-time detection PCR method, the intercalation monitoring PCR method, molecular beacon probe method, hybridization probe method, sunrise can be used to measure the amount of the test nucleic acid in the sample by measuring the PCR amplification product in real time. Examples include the primer method, and any of these can be applied to the method of the present invention. The method of the present invention is characterized by the sequences of the forward primer and the reverse primer, but otherwise, these various methods can be easily carried out according to conventional methods.
[0026]
Although the case where the method of the present invention is performed by RT-PCR has been described, the method of the present invention can be performed by using the above-described forward primer and reverse primer for amplification of human TS cDNA or mRNA. It is not limited to the PCR method, and any other nucleic acid amplification method can be adopted. For example, mRNA can be amplified by NASBA method (3SR method, TMA method). In the NASBA method, a reverse-side primer with a T7 promoter sequence added to the 5 'end of the reverse-side primer, and a cDNA strand (antisense strand) using mRNA as a template in the presence of reverse transcriptase such as AMT-RT Form. The RNA strand of the obtained RNA / DNA double-stranded hybrid is decomposed with RNase H to give a single-stranded cDNA (antisense strand). Next, using this single-stranded cDNA as a template and a forward primer, a DNA polymerase (when AMT-RT is used as a reverse transcriptase, AMT-RT also has a DNA polymerase activity, so this is also used) A complementary strand is formed in the presence of double-stranded cDNA. Since this double-stranded cDNA contains a T7 promoter sequence, when T7 RNA polymerase is allowed to act on this, RNA (antisense strand) is successively formed by transcription. Furthermore, the double-stranded cDNA is amplified by repeating the denaturation step, the annealing step with the forward and reverse primers, and the complementary strand extension step for the double-stranded cDNA thus formed. RNA (antisense strand) is further formed by transcription. Even in such NASBA method, only the normal TS mRNA can be amplified by using the forward primer and the reverse primer described above as the forward primer and the reverse primer (however, the product is the above). This is also the antisense strand as described above, and in this case, it is also referred to herein as “amplifying mRNA”). The NASBA method itself is well known, and a kit for this purpose is also commercially available, and can be easily implemented using a commercially available kit.
[0027]
As described above, only normal cDNA or mRNA can be amplified.
[0028]
Next, the amplification product is measured. In the present specification, “measurement” includes both detection and quantification. In addition, simple measurement or semi-quantification such as fluorescence intensity measurement of the electrophoresis band of the amplification product and visual determination of the thickness is also included in the “measurement”. As described above, the amplification product can be measured by measuring fluorescence in real time while performing PCR, as in the real-time detection RT-PCR method, when accurate quantification is performed. Alternatively, the amplification product can be electrophoresed to detect the amplification band. It can also be performed by measuring the fluorescence intensity of the amplification band. Furthermore, the electrophoresis pattern can be transferred to a nylon or nitrocellulose membrane, and a labeled probe that hybridizes to the amplification product can be hybridized to detect or quantify the label (PCR-Southern method). Furthermore, the probe that hybridizes to the amplification product is immobilized, the amplification step is performed in the presence of labeled nucleotide triphosphate, the amplification product is bound to the immobilized probe, and the amplification product bound to the solid phase is It can also be done by measuring. These are all conventional methods and can be performed by known methods.
[0029]
In the second method of the present invention, a nucleic acid that hybridizes with the full-length cDNA of the human TS gene but does not hybridize with the first mutant cDNA and the second mutant cDNA is used as a forward primer or a reverse primer. As described above, the cDNA or mRNA of the human TS gene is amplified and the amplification product is measured. A nucleic acid that hybridizes with normal cDNA but does not hybridize with either the first mutant type or the second mutant type cDNA is a nucleic acid that hybridizes to a region spanning the region of exon 3 and exon 4. In this case, it is preferable that 20% or more and 80% or less, more preferably 40% or more and 60% or less of the total length of the primer hybridize to the exon 3 region and the rest hybridize to the exon 4 region. This probe cannot hybridize because exon 3 is deleted in the first mutant cDNA, and hybridizes because exon 4 is deleted in the second mutant cDNA. Cannot hybridize and hybridize only with normal cDNA or mRNA. The primer that hybridizes to the region may be a forward primer or a reverse primer, and the other primer used for amplification may hybridize to any region of normal cDNA. . However, the forward primer hybridizes to a region upstream of the reverse primer.
[0030]
Primers used in the second method are also 210 nt, 213 nt, 230 nt, 231 nt, 233 nt to 243 nt, 246 to 248 nt, 269 nt and 289 nt in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in order to eliminate false positives caused by pseudogenes. , 295nt, 300nt, 313nt, 324nt, 327nt, 332nt, 335nt, 340nt, 343nt to 347nt, 359nt, 361nt, 375nt, 376nt, 430nt, 439nt, 450nt, 464nt, 468nt, 473nt, 474nt, 482nt, 488nt, 500nt, 507nt 509nt, 510nt, 512nt, 513nt, 515nt, 517nt, 519nt to 521nt, 525nt, 527nt to 529nt, 531nt to 538nt, 540nt to 544nt, 547nt to 552nt and 554nt to 557nt Those that hybridize to the region are preferred.
[0031]
The description of the forward side primer or the reverse side primer described above can be applied to other explanations of the primer used in the second method, that is, various preferable or acceptable aspects. Moreover, since the amplification method and the amplification product measurement method are not related to the type of primer, the above description of the method of the present invention can be applied.
[0032]
The present invention also provides a kit for measuring human TS mRNA comprising at least the forward primer and the reverse primer. The present invention also provides a kit for measuring human TS mRNA comprising at least a forward primer or a reverse primer used in the second method. The reagents included in the kit are well-known except for the primer of the present invention. For example, as described in the following examples, M-MLV reverse transcriptase, Taq DNA polymerase, dNTP, random primer, RNase Inhibitors, buffers and the like can be used as a kit. Alternatively, the kit may include only a forward primer and a reverse primer, and a commercially available RT-PCR kit or the like may be used as the other reagents.
[0033]
The present invention further provides a nucleic acid that hybridizes with the full-length cDNA or mRNA of the human thymidylate synthase gene but does not hybridize with the first mutant cDNA or mRNA or the second mutant cDNA or mRNA. A probe for measuring cDNA or mRNA of human TS is also provided. As such a probe, the nucleic acid that can be used as the forward primer and the reverse primer described above can be used as the probe of the present invention. The probe is preferably one that hybridizes to the amplification product amplified by the method of the present invention. The preferred number of bases of the probe is 10 to the full length of the amplification product, and further 15 to the full length of the amplification product.
[0034]
Furthermore, the present invention also provides a probe comprising a nucleic acid that hybridizes with normal cDNA but does not hybridize with either the first mutant cDNA or the second mutant cDNA. Such a probe hybridizes to a region straddling exon 3 and exon 4. In this case, it is preferable that 20% or more and 80% or less, more preferably 40% or more and 60% or less of the total length of the probe hybridize to the exon 3 region and the rest hybridize to the exon 4 region. This probe cannot hybridize because exon 3 is deleted in the first mutant cDNA or mRNA, and exon 4 is also deleted in the second mutant cDNA or mRNA. It cannot hybridize and hybridizes only with normal cDNA or mRNA. In the case of this probe, the size of the probe is not particularly limited, but is preferably about 10 to 100, and more preferably about 15 to 50. Further, as in the case of the primer, it is most preferable to have the completely same base sequence as the region to which the probe hybridizes, but 10% or less of the total length of the probe may be substituted. In the present specification, the term “hybridizes” means that the probe hybridizes under a general condition employed in a method for detecting a test nucleic acid by hybridizing a nucleic acid probe such as Southern blot. Means.
[0035]
The probe can also be used as a labeled probe by binding a known label such as a fluorescent label, biotin label, radiolabel, enzyme label or the like to the nucleic acid, and such a labeled probe is of course included in the probe of the present invention. . In addition, when the probe is used as an immobilized probe, for example, any nucleic acid unrelated to the test nucleic acid, such as a region to be bound to the solid phase or a branch for binding a label in the branched probe, is used. It may be combined.
[0036]
The probe of the present invention can be used for measurement of the amplified nucleic acid amplified by the above-described method of the present invention. The TaqMan (registered trademark) probe when the above-described method of the present invention is performed by real-time detection RT-PCR is also a probe of the present invention. In addition, the probe of the present invention is not subjected to amplification by the method of the present invention (that is, not amplified at all or amplified by a method other than the method of the present invention), and is also used for measurement of mRNA or cDNA of human TS. Can be used. In particular, when a probe that hybridizes with the normal type but does not hybridize with any of the first and second mutant types, only normal cDNA or mRNA can be measured. In addition, even if the probe hybridizes to one of the first and second mutant types, the first mutant probe hybridizes to the region consisting of exons 2 and 3, and hybridizes to the exon 4 region. It is possible to determine that the mRNA or cDNA measured by any probe is a normal type using the second mutant probe that soybeans. In the case of measuring normal cDNA or mRNA with a probe without amplification, as a probe, a number of branches are formed on one probe, and a number of labels are bound to each branch. In addition, measurement sensitivity can be improved by using a so-called branched probe.
[0037]
In addition, since the 1st and 2nd variant was discovered by this invention, it also became possible to provide the antibody which reacts only with normal type human TS. That is, an antibody having a peptide region encoded by a region spanning exon 3 and exon 4 as an epitope does not immunoreact with either of the first and second mutant types, and immunoreacts only with normal human TS. For such antibodies, monoclonal antibodies are produced using human TS as an immunogen by conventional methods, and those that immunoreact with peptides encoded by the region spanning exon 3 and exon 4 are screened by immunoassay such as ELISA. Can be obtained. Alternatively, a peptide encoded by a region spanning exon 3 and exon 4 may be an antibody (monoclonal) by a conventional method using an immunogen alone or the peptide bound to a carrier such as keyhole limpet hemocyanin or bovine serum albumin. An antibody or a polyclonal antibody may be obtained.
[0038]
The sample to which the method of the present invention is applied is not particularly limited, and may be mRNA in cells derived from any tissue. MRNAs derived from various solid cancer cells such as gastric cancer and colon cancer and blood cancer cells are preferred. Although it is preferable to extract mRNA from cells and apply the method of the present invention, mRNA extraction is not essential. In addition, extraction of mRNA from cells can be easily performed by a conventional method using a commercially available reagent for mRNA extraction.
[0039]
By measuring only normal human TS mRNA by the method of the present invention, it is possible to predict the prognosis due to treatment with an anticancer drug more accurately than when using a conventional mRNA measurement method.
[0040]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
[0041]
(I) Discovery of TS mRNA splicing variants
(1) Primer synthesis
Primer 5'-aga act ggc aga ggg set in exon 5 region of TS gene by chemically synthesizing primer 5'-gtc ggt att cgg cat gca gg-3 'set in exon 1 region of TS gene Cat gg-3 'was chemically synthesized and used as a reverse primer.
[0042]
(2) Nucleic acid extraction and cDNA synthesis
Gastric cancer tissue-derived cell lines KATO III, MKN45 (available from American Type Culture Collection (ATCC)) and healthy human peripheral blood cells 10 ⁶ DNA was extracted from the pieces using GENOMIX (TALENT). Ten ⁶ 1.5 mL of solution 1 (GENOMIX) was added to each cell, kept at 65 ° C. for 15 minutes, then 3 mL of chloroform was added and mixed by inversion. The mixture was centrifuged at 3000 × g for 10 minutes, 3 mL of Solution 2 (GENOMIX) was added to the upper layer, and centrifuged at 3000 × g for 10 minutes. After centrifugation, 1.5 mL of solution 3 (GENOMIX) was added to the precipitate for dissolution, and after dissolution, 100% ethanol was added and centrifuged at 3000 × g for 10 minutes. After centrifugation, the cells were washed with 5 mL of 70% ethanol and dissolved with 50 μL of TE solution (2M Tris-HCl, 0.2M EDTA (pH 8.5)).
[0043]
Also 10 ⁶ To each cell, 1 mL of RNA extraction reagent Isogen (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) was added and stirred for 30 seconds. After stirring, 200 μL of chloroform was added and stirred again for 30 seconds. After stirring, the mixture was centrifuged at 12000 × g for 15 minutes, an equal amount of isopropanol was added to the aqueous phase, and the mixture was centrifuged at 12000 × g for 15 minutes. After centrifugation, the cells were washed twice with 1 mL of 75% ethanol and dissolved in 50 μL of RNase inhibitor-added DEPC-treated water. CDNA was synthesized from the dissolved RNA solution using the following cDNA synthesis solution. cDNA synthesis was performed for 1 hour. The composition of the reaction solution was as follows.
[0044]

* Included with Gibco BRL M-MLV reverse transcriptase
[0045]
(3) PCR reaction
PCR reaction was performed using the primer synthesized in (1).

* Included with rTaq DNA polymerase
[0046]
The PCR reaction was carried out for 40 cycles, with 95 ° C / 30 seconds, 60 ° C / 30 seconds, and 72 ° C / 30 seconds as one cycle. The amplification product was confirmed (437 bp) by 2.5% agarose gel electrophoresis.
[0047]
By the operations of (1), (2), and (3) above, in the gastric cancer cell line, amplification products were confirmed in the vicinity of 335 bp and 188 bp in addition to the target amplification product (437 bp). Only the target amplification product (437 bp) was confirmed from the peripheral blood of healthy individuals. Further, no DNA-derived amplification product was confirmed.
[0048]
Amplification products around 335 bp and around 188 bp detected from the gastric cancer cell line were cut out from the agarose gel and set in SUPREC-01 (Takara Shuzo) to extract nucleic acid from the gel. After setting, the mixture was centrifuged at 5000 × g for 5 minutes, and the solution eluted in the lower layer of SUPREC-01 was collected.
[0049]
(4) PCR reaction
PCR reaction was performed using the primer synthesized in (1).

* Included with rTaq DNA polymerase
[0050]
The PCR reaction was carried out for 40 cycles, with 95 ° C / 30 seconds, 60 ° C / 30 seconds, and 72 ° C / 30 seconds as one cycle. The amplification product was confirmed (335 bp and 188 bp) by 2.5% agarose gel electrophoresis.
[0051]
(5) Determination of nucleotide sequence
By the above operation, the amplified PCR products around 335 bp and 188 bp were set on a sieve column and centrifuged at 2500 × g for 1 minute to purify the amplified product. The nucleotide sequences of the two kinds of purified amplification products were determined by the direct sequencing method.
[0052]
A cycle sequence reaction was performed using the primer synthesized in (1).

[0053]
The direct sequencing reaction was carried out for 25 cycles, with 96 ° C / 10 seconds, 50 ° C / 5 seconds, 60 ° C / 4 minutes as one cycle.

* ABI PRIZM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit
(Applied Biosystems).
[0054]
The direct sequencing reaction was carried out for 25 cycles, with 96 ° C / 10 seconds, 50 ° C / 5 seconds, 60 ° C / 4 minutes as one cycle.
[0055]
After completion of the reaction, the base sequence was obtained with ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, manufactured by HITACHI). The obtained base sequence from the forward primer side (sense strand) was compared with the base sequence from the reverse primer side (antisense strand), and finally the base sequence was determined.
[0056]
By the above operation (5), the base sequences of two kinds of amplification products were determined. The determined base sequence is exon 2 and exon 3 deleted from the TS gene (full length isoform), the other is the same as the TS gene (variant 1 (first variant)), exon 4 is deleted. The others were the same as the TS gene (variant 2) (second variant)). The nucleotide sequences and deduced amino acid sequences of Variant 1 and Variant 2 are shown in SEQ ID NOs: 2 and 3, respectively.
[0057]
(II) Specific detection of TS variant 1 and variant 2
(6) Primer synthesis
In order to detect variant 1, a primer 5'-cgc gct aca gcc tga gag att ca-3 'overlapping with the exon 1 and exon 4 regions of the TS gene was chemically synthesized, used as a forward primer, and exon of the TS gene. Primer 5′-gga aag gtc tgg gtt ctc gct-3 ′ set in the 7 region was chemically synthesized and used as a reverse primer.
[0058]
In order to detect variant 2, primer 5'-aga ata cag aga tat gga atc aga tct tcc-3 'overlapped with exon 3 and exon 5 region of TS gene was chemically synthesized and used as a forward primer. Primer 5′-gga aag gtc tgg gtt ctc gct-3 ′ set in the exon 7 region was chemically synthesized and used as a reverse primer.
[0059]
(7) RNA extraction and cDNA synthesis
Gastric cancer tissue-derived cell lines KATO III, MKN45 (obtained from ATCC), colon cancer tissue-derived cell line HCT15 (obtained from ATCC) and healthy human peripheral blood cells 10 ⁶ DNA was extracted from the pieces using GENOMIX (TALENT). Ten ⁶ 1.5 mL of solution 1 (GENOMIX) was added to each cell, kept at 65 ° C. for 15 minutes, then 3 mL of chloroform was added and mixed by inversion. The mixture was centrifuged at 3000 × g for 10 minutes, 3 mL of Solution 2 (GENOMIX) was added to the upper layer, and centrifuged at 3000 × g for 10 minutes. After centrifugation, 1.5 mL of solution 3 (GENOMIX) was added to the precipitate for dissolution, and after dissolution, 100% ethanol was added and centrifuged at 3000 × g for 10 minutes. After centrifugation, the cells were washed with 5 mL of 70% ethanol and dissolved with 50 μL of TE solution (2M Tris-HCl, 0.2M EDTA (pH 8.5)).
[0060]
Also 10 ⁶ To each cell, 1 mL of RNA extraction reagent Isogen (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) was added and stirred for 30 seconds. After stirring, 200 μL of chloroform was added and stirred again for 30 seconds. After stirring, the mixture was centrifuged at 12000 × g for 15 minutes, an equal amount of isopropanol was added to the aqueous phase, and the mixture was centrifuged at 12000 × g for 15 minutes. After centrifugation, the cells were washed twice with 1 mL of 75% ethanol and dissolved in 50 μL of RNase inhibitor-added DEPC-treated water. CDNA was synthesized from the dissolved RNA solution using the following cDNA synthesis solution. cDNA synthesis was performed for 1 hour. The composition of the reaction solution was as follows.
[0061]

* Included with Gibco BRL M-MLV reverse transcriptase
[0062]
(8) PCR reaction
PCR reaction was performed using the primer synthesized in (6).

* Included with rTaq DNA polymerase
[0063]
The PCR reaction was carried out for 40 cycles, with 95 ° C / 30 seconds, 60 ° C / 30 seconds, and 72 ° C / 30 seconds as one cycle. The amplified product was confirmed (393 bp) by 2.5% agarose gel electrophoresis.
[0064]

* Included with rTaq DNA polymerase
[0065]
The PCR reaction was carried out for 40 cycles, with 95 ° C / 30 seconds, 60 ° C / 30 seconds, and 72 ° C / 30 seconds as one cycle. The amplified product was confirmed (296 bp) by 2.5% agarose gel electrophoresis.
[0066]
By the operations (6), (7) and (8) above, TS variant 1 mRNA-derived amplification products were confirmed in gastric cancer and colon cancer cell lines. No amplification product was confirmed from the peripheral blood of healthy individuals. Further, no DNA-derived amplification product was confirmed.
[0067]
By the operations (6), (7), and (8) above, TS variant 2 mRNA-derived amplification products were confirmed in gastric cancer and colon cancer cell lines. No amplification product was confirmed from the peripheral blood of healthy individuals. Further, no DNA-derived amplification product was confirmed.
[0068]
(III) Specific detection of TS full length isoform mRNA
(9) Search for pseudogenes
In order to specifically detect the full length isoform mRNA of the TS gene, it is necessary to eliminate amplification derived from DNA mixed in the extracted RNA. For this reason, pseudogenes of the TS gene were searched from the database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI). As a result of the search, there was a pseudo gene of TS gene consisting of 2454 bp in ACCESSION No. D16517. The homology between the TS gene and the TS pseudogene was as high as 79.29% as shown in FIGS.
[0069]
(10) Primer synthesis
In order not to detect Variant 1 and Variant 2, a forward primer was set for exon 2 or 3, and a reverse primer was set for exon 4, while a primer that did not detect a pseudogene was set. Specifically, primer 5'-cag cct ggg att ctc cac ca-3 'set in the exon 3 region of the TS gene was chemically synthesized as a forward primer and primer 5'-atg atg att set in the exon 4 region of the TS gene. ctt ctg tcg tca ggg-3 ′ was chemically synthesized and used as a reverse primer.
[0070]
(11) RNA extraction and cDNA synthesis
Gastric cancer tissue-derived cell lines KATO III, MKN45 (obtained from ATCC), colon cancer tissue-derived cell line HCT15 (obtained from ATCC) and healthy human peripheral blood cells 10 ⁶ DNA was extracted from the pieces using GENOMIX (TALENT). Ten ⁶ 1.5 mL of solution 1 (GENOMIX) was added to each cell, kept at 65 ° C. for 15 minutes, then 3 mL of chloroform was added and mixed by inversion. The mixture was centrifuged at 3000 × g for 10 minutes, 3 mL of Solution 2 (GENOMIX) was added to the upper layer, and centrifuged at 3000 × g for 10 minutes. After centrifugation, 1.5 mL of solution 3 (GENOMIX) was added to the precipitate for dissolution, and after dissolution, 100% ethanol was added and centrifuged at 3000 × g for 10 minutes. After centrifugation, the cells were washed with 5 mL of 70% ethanol and dissolved with 50 μL of TE solution (2M Tris-HCl, 0.2M EDTA (pH 8.5)).
[0071]
Also 10 ⁶ To each cell, 1 mL of RNA extraction reagent Isogen (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) was added and stirred for 30 seconds. After stirring, 200 μL of chloroform was added and stirred again for 30 seconds. After stirring, the mixture was centrifuged at 12000 × g for 15 minutes, an equal amount of isopropanol was added to the aqueous phase, and the mixture was centrifuged at 12000 × g for 15 minutes. After centrifugation, the cells were washed twice with 1 mL of 75% ethanol and dissolved in 50 μL of RNase inhibitor-added DEPC-treated water. CDNA was synthesized from the dissolved RNA solution using the following cDNA synthesis solution. cDNA synthesis was performed for 1 hour. The composition of the reaction solution was as follows.
[0072]

* Included with Gibco BRL M-MLV reverse transcriptase
[0073]
(12) PCR reaction
PCR reaction was performed using the primer synthesized in (10).

* Included with rTaq DNA polymerase
[0074]
The PCR reaction was carried out for 40 cycles, with 95 ° C / 30 seconds, 60 ° C / 30 seconds, and 72 ° C / 30 seconds as one cycle. The amplification product was confirmed (170 bp) by 2.5% agarose gel electrophoresis.
[0075]
By the operations of (10), (11), and (12) above, the target amplification product (170 bp) was confirmed in gastric cancer, colon cancer cell lines and peripheral blood. No DNA-derived amplification product was confirmed.
[0076]
【The invention's effect】
According to the present invention, a new alternative splicing of the human TS gene has been found, and a method for measuring only normal human TS mRNA other than these splicing variants has been provided. By measuring human TS mRNA in cancer cells by the method of the present invention, it becomes possible to more accurately determine the prognosis due to anticancer drug treatment as compared with the case of using a conventional method.
[0077]
[Sequence Listing]

[0078]

[0079]

[0080]

[0081]

[0082]

[0083]

[0084]

[0085]

[0086]

[0087]

[0088]

[0089]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing aligned base sequences of normal human TS cDNA and pseudogene.
FIG. 2 is a continuation of FIG.

Claims

A nucleic acid that hybridizes with the full-length cDNA of the human thymidylate synthase gene but does not hybridize with the first mutant cDNA lacking exon 2 and exon 3 of the human thymidylate synthase gene is used as a forward primer. Human thymidylate synthesis using a nucleic acid that hybridizes with the full-length cDNA of the human thymidylate synthase gene but does not hybridize with the second mutant cDNA lacking exon 4 of the human thymidylate synthase gene as a reverse primer. amplifying the cDNA or mRNA of an enzyme gene, see contains a measuring amplification product, the number of bases in the forward primer and the reverse primer is in each 15 bases or more, the measuring method of the human thymidylate synthase mRNA.

The forward primer is a nucleic acid that hybridizes at least in part within a region of 206 nt to 454 nt of DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the reverse primer is SEQ ID NO: in the sequence listing 2. The method according to claim 1, wherein the nucleic acid is a nucleic acid that hybridizes at least in part within a region of 455 nt to 556 nt of DNA having the base sequence shown in 1.

The forward primer is paired with a base in the region of 206 nt to 454 nt of DNA having at least its 3 ′ end shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the reverse primer is at least its 3 ′ end The method according to claim 2, which pairs with a base in a region of 455 nt to 556 nt of DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.

The forward primer is a nucleic acid that hybridizes within a region of 206 nt to 454 nt of DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the reverse primer is a base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing The method according to claim 3, which is a nucleic acid that hybridizes within a region of 455 nt to 556 nt of DNA comprising

The forward primer and the reverse primer each have the same base sequence as the base sequence corresponding to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or a base sequence in which 10% or less of the base sequence is substituted. Item 5. The method according to any one of Items 1 to 4.

6. The method according to claim 5, wherein the forward primer and the reverse primer each have the same base sequence as the base sequence corresponding to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.

The forward primer is 210nt, 213nt, 230nt, 231nt, 233nt to 243nt, 246 to 248nt, 269nt, 289nt, 295nt, 300nt, 313nt, 324nt, 327nt, 332nt in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing 335 nt, 340 nt, 343 nt to 347 nt, 359 nt, 361 nt, 375 nt, 376 nt, 430 nt, 439 nt, and 450 nt, which hybridizes to a region containing at least one base. The method described.

The method according to claim 7, wherein the number of bases corresponding to the base selected from the group exceeds 10% of the total number of bases of the primer.

The method according to claim 7 or 8, wherein the forward primer has a base corresponding to a base selected from the group at the 3 'end.

The reverse primer is 464 nt, 468 nt, 473 nt, 474 nt, 482 nt, 488 nt, 500 nt, 507 nt, 509 nt, 510 nt, 512 nt, 513 nt, 515 nt, 517 nt, 519 nt to 521 nt in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Or 525 nt, 527 nt to 529 nt, 531 nt to 538 nt, 540 nt to 544 nt, 547 nt to 552 nt, and 554 nt to 557 nt, which hybridizes to a region containing at least one base. The method described.

The method according to claim 10, wherein the number of bases corresponding to the base selected from the group exceeds 10% of the total number of bases in the reverse primer.

The method according to claim 10 or 11, wherein the reverse primer has a base corresponding to a base selected from the group at the 3 'end.

The method according to claim 12 , wherein the forward primer and the reverse primer each have 15 to 30 bases.

Hybridizes with the full-length cDNA of the human thymidylate synthase gene, but deletes the first mutant cDNA lacking exon 2 and exon 3 of the human thymidylate synthase gene and exon 4 of the human thymidylate synthase gene A human thymidylate synthase mRNA comprising amplifying cDNA or mRNA of a human thymidylate synthase gene using a nucleic acid that does not hybridize with the second mutant cDNA as a forward primer or reverse primer, and measuring the amplified product. Measuring method.

The forward side primer or the reverse side primer is 210nt, 213nt, 230nt, 231nt, 233nt to 243nt, 246 to 248nt, 269nt, 289nt, 295nt, 300nt, 313nt, 324nt in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. 327nt 332nt 335nt 340nt 343nt to 347nt 359nt 361nt 375nt 376nt 430nt 439nt 450nt 464nt 468nt 473nt 474nt 482nt 488nt 500nt 507nt 509nt 510nt 512nt 513nt , 515nt, 517nt, 519nt~521nt, 525nt , 527nt~529nt, 531nt~538nt, 540nt~544nt, claim hybridizing to a region including at least one base selected from the group consisting of 547nt~552nt and 554Nt～557nt 14 The method described.

The method according to any one of claims 1 to 15 , wherein the amplification is performed by an RT-PCR method.