RU88022U1

RU88022U1 - CARRIER FOR CULTIVATION OF CELLS

Info

Publication number: RU88022U1
Application number: RU2009119150/22U
Authority: RU
Inventors: Сергей Константинович Гордеев; Светлана Борисовна Корчагина; Олег Иванович Киселев; Александр Валентинович Слита
Priority date: 2009-05-20
Filing date: 2009-05-20
Publication date: 2009-10-27

Abstract

1. Носитель для культивирования клеток, состоящий из углеродсодержащего материала, отличающийся тем, что носитель выполнен из материала, состоящего из частиц алмаза детонационного синтеза, связанных углеродным связующим, полученным термическим разложением газообразных углеводородов, при этом массовое соотношение углеродного связующего и алмаза детонационного синтеза составляет 0,1-0,4. ! 2. Носитель по п.1, отличающийся тем, что его пористость составляет 40-60 об%.1. A carrier for cell cultivation, consisting of a carbon-containing material, characterized in that the carrier is made of a material consisting of detonation synthesis diamond particles bonded by a carbon binder obtained by thermal decomposition of gaseous hydrocarbons, wherein the mass ratio of the carbon binder and detonation synthesis diamond is 0 , 1-0.4. ! 2. The carrier according to claim 1, characterized in that its porosity is 40-60 vol.%.

Description

Полезная модель относится к биотехнологии, а более конкретно к устройствам для культивирования животных и растительных клеток, получения клеточной биомассы, образцов тканей и производства биологически активных веществ для их использования в медицине, ветеринарии, фармакологии, вирусологии, клеточной биологии, животноводстве и растениеводстве.The utility model relates to biotechnology, and more particularly to devices for culturing animal and plant cells, obtaining cellular biomass, tissue samples and producing biologically active substances for their use in medicine, veterinary medicine, pharmacology, virology, cell biology, animal husbandry and crop production.

Методы клеточной биологии находят все большее распространение в различных областях современных фундаментальных и прикладных исследований. Одним из наиболее используемых является метод культивирования клеток человека, животных и растений. В настоящее время можно культивировать клетки практически всех тканей и органов человека, животных и растений. Культивирование клеток становится основой современных наукоемких технологий в биотехнологии и медицине, например, в биотехнологии - получение биологически активных веществ растительного и животного происхождения, вакцин, диагностикумов; в медицине - заместительная клеточная терапия, позволяющая восстанавливать поврежденные ткани путем трансплантации нормальных здоровых клеток человека, выращенных in vitro, производство моноклональных антител из гибридомных клеток.Cell biology methods are becoming increasingly common in various fields of modern fundamental and applied research. One of the most used is the method of culturing human, animal and plant cells. Currently, it is possible to cultivate cells of almost all tissues and organs of man, animals and plants. Cell cultivation is becoming the basis of modern high technology in biotechnology and medicine, for example, in biotechnology - the production of biologically active substances of plant and animal origin, vaccines, diagnostics; in medicine, cell replacement therapy, which allows the repair of damaged tissues by transplantation of normal healthy human cells grown in vitro, the production of monoclonal antibodies from hybridoma cells.

Выращивание фрагментов органов и тканей с определенными свойствами для нужд медицины, получение клеточной биомассы для производства биомедицинской продукции, накопление каллусной ткани для микроклонального размножения растений является сложным процессом, требующим обеспечения и поддержания в течение длительного времени условий, необходимых для роста клеток. Одной из важных задач является правильный выбор носителя (субстрата). Клетки, размещенные на носителе, живут в организме значительно дольше, чем клетки, просто введенные в ткань, эффективность трансплантации при этом возрастает. Для создания носителей используют разные материалы: графит, полимеры, керамику, металлы и их сплавы, в частности, пористый никелид титана, нержавеющую сталь, кобальт-хромовые сплавы. При всех своих достоинствах, эти материалы могут вызывать сильное воспаление и некроз клеток, ионы никеля обладают канцерогенной активностью, а ионы хрома проникают в клетки и повреждают ДНК. Кроме того, к субстрату предъявляются комплексные требования по биосовместимости, способности выдерживать внешние воздействия, связанные со стерилизацией, температурными и влажностными условиями в которых происходит рост клеток, а также воздействию различного рода облучений (рентгеновского, ультрафиолетового и др.), которые используются в экспериментальных и технологических работах. Поэтому задача создания эффективных носителей для роста клеток является на сегодняшний день весьма актуальной.Growing fragments of organs and tissues with certain properties for medical needs, obtaining cell biomass for the production of biomedical products, accumulating callus tissue for microclonal propagation of plants is a complex process that requires providing and maintaining for a long time the conditions necessary for cell growth. One of the important tasks is the correct choice of carrier (substrate). Cells placed on the carrier live in the body much longer than cells simply inserted into the tissue, while the efficiency of transplantation increases. Different materials are used to create supports: graphite, polymers, ceramics, metals and their alloys, in particular, porous titanium nickelide, stainless steel, cobalt-chromium alloys. For all its merits, these materials can cause severe inflammation and cell necrosis, nickel ions have carcinogenic activity, and chromium ions penetrate cells and damage DNA. In addition, the substrate has complex requirements for biocompatibility, the ability to withstand external influences associated with sterilization, temperature and humidity conditions in which cell growth occurs, as well as the effects of various kinds of irradiation (x-ray, ultraviolet, etc.), which are used in experimental and technological work. Therefore, the task of creating effective carriers for cell growth is very relevant today.

Известен носитель для роста клеток, описанный в патенте США №7358029 (2008 г., кл. C12N 5/00), который выполнен из комбинации гидрофобных и гидрофильных полимерных смол, т.е. органических полимеров на основе углерода. В качестве таких смол могут быть использованы полиакриламиды, в том числе модифицированные ультрафиолетовым облучением.A carrier for cell growth is known, described in US Pat. No. 7,358,029 (2008, class C12N 5/00), which is made from a combination of hydrophobic and hydrophilic polymer resins, i.e. carbon-based organic polymers. As such resins, polyacrylamides, including those modified by ultraviolet irradiation, can be used.

Недостатками известного способа является недостаточно высокая биосовместимость используемых смол: как известно, все полимеры претерпевают процессы деструкции с выделением низкомолекулярных продуктов, воздействующих на рост клеточных структур, что не обеспечивает адекватность получаемых биологических материалов, особенно в условиях, сопряженных с внешними воздействиями при росте клеток. Кроме того, относительно невысокая температурная стабильность и низкая прочность полимеров создают сложности при их использовании в качестве носителя, т.к. требуют поддержания жестко контролируемых условий при стерилизации и условий роста клеток для недопущения деструкции полимера.The disadvantages of this method is the insufficient biocompatibility of the resins used: as is known, all polymers undergo degradation processes with the release of low molecular weight products that affect the growth of cellular structures, which does not ensure the adequacy of the biological materials obtained, especially under conditions associated with external influences during cell growth. In addition, the relatively low temperature stability and low strength of polymers make it difficult to use them as a carrier, because require maintaining strictly controlled conditions during sterilization and cell growth conditions to prevent polymer degradation.

Задачей полезной модели является создание носителя, обладающего хорошей биосовместимостью в сочетании с высокой термической стабильностью и устойчивостью к воздействию внешних факторов.The objective of the utility model is to create a carrier with good biocompatibility combined with high thermal stability and resistance to external factors.

Поставленная задача решается тем, что носитель для культивирования клеток выполнен из материала, состоящего из частиц алмаза детонационного синтеза, связанных углеродным связующим, полученным термическим разложением газообразных углеводородов. Массовое соотношение углеродного связующего и алмаза детонационного синтеза составляет 0,1-0,4.The problem is solved in that the carrier for culturing cells is made of a material consisting of detonation synthesis diamond particles bonded by a carbon binder obtained by thermal decomposition of gaseous hydrocarbons. The mass ratio of carbon binder and diamond detonation synthesis is 0.1-0.4.

Носители с массовым соотношением углеродного связующего и алмаза детонационного синтеза менее 0,1 не обладают достаточной прочностью, получение носителей с массовым соотношением углеродного связующего и алмаза детонационного синтеза более 0,4 технологически сложно.Carriers with a mass ratio of carbon binder and diamond detonation synthesis of less than 0.1 do not have sufficient strength, obtaining media with a mass ratio of carbon binder and diamond of detonation synthesis of more than 0.4 is technologically difficult.

Является предпочтительным наличие в носителе пористости 40-60% об., которая обеспечивает возможность передачи через пористую структуру питательной среды, необходимой для культивирования клеток.It is preferable that the carrier has a porosity of 40-60% vol., Which allows the transmission through the porous structure of the nutrient medium necessary for cell culture.

Сущность полезной модели состоит в следующем. Носитель, предлагаемый в данном техническом решении, полностью состоит из углерода, а именно - из углерода двух кристаллохимических форм - алмаза детонационного синтеза и графитоподобной углеродной связки. Высокая биосовместимость углерода определяет высокую биосовместимость носителя, что позволяет культивировать на нем различные типы клеток. Высокая химическая инертность - абсолютная устойчивость углеродного носителя в кислотах, щелочах, органических средах - позволяет клеткам формировать трехмерные тканеподобные структуры, гарантируя отсутствие воздействия на рост клеток каких-либо химических компонентов, выделяющихся на поверхности субстрата под воздействием внешних факторов или продуктов метаболизма клеток. Сам носитель имеет гетерогенную структуру, которая сформирована частицами алмаза детонационного синтеза и углеродной связкой, связывающей частицы алмаза в единый композит. Порошки алмаза детонационного синтеза получают взрывом взрывчатых веществ. Они имеют размер частиц 4-5 нм. Массовое соотношение углеродного связующего и алмаза детонационного синтеза составляет 0,1-0,4.The essence of the utility model is as follows. The carrier proposed in this technical solution consists entirely of carbon, namely, carbon of two crystallochemical forms - detonation synthesis diamond and graphite-like carbon binder. High biocompatibility of carbon determines the high biocompatibility of the carrier, which allows you to cultivate various types of cells on it. High chemical inertness - the absolute stability of the carbon carrier in acids, alkalis, organic media - allows cells to form three-dimensional tissue-like structures, guaranteeing that any chemical components released on the surface of the substrate under the influence of external factors or cell metabolism products are not affected by cell growth. The carrier itself has a heterogeneous structure, which is formed by detonation synthesis diamond particles and a carbon bond linking the diamond particles into a single composite. Detonation synthesis diamond powders are produced by an explosion of explosives. They have a particle size of 4-5 nm. The mass ratio of carbon binder and diamond detonation synthesis is 0.1-0.4.

Гетерогенная структура материала обеспечивает хорошую адгезию растущих клеток на поверхности материала. Это связано с возможностью клеток к локализации на поверхности тех или иных фрагментов структуры, а также на границе раздела углеродных фаз. Пористость носителя может быть использована для подачи растущим клеткам необходимой питательной среды.The heterogeneous structure of the material ensures good adhesion of growing cells to the surface of the material. This is due to the ability of cells to localize on the surface of certain fragments of the structure, as well as at the interface of carbon phases. The porosity of the carrier can be used to supply the growing cells with the necessary nutrient medium.

Следующий пример характеризует сущность предлагаемой полезной модели:The following example characterizes the essence of the proposed utility model:

Носитель для культивирования клеток состоит из частиц детонационного алмаза (объемное содержание 20% об.) и углеродного связующего. Массовое соотношение углеродного связующего и алмаза детонационного синтеза составляет 0,26. Пористость носителя - 58% об. Носитель получен путем формования заготовки в виде диска диаметром 20 мм и толщиной 1 мм из порошка детонационного алмаза и последующего формирования в заготовки углеродного связующего. Формирование связующего проводят из газообразных углеводородов - метана - при температуре 700°С до обеспечения указанного массового соотношения фаз.The carrier for cell culture consists of detonation diamond particles (volume content of 20% vol.) And a carbon binder. The mass ratio of carbon binder and diamond detonation synthesis is 0.26. The porosity of the carrier is 58% vol. The carrier was obtained by molding a preform in the form of a disk with a diameter of 20 mm and a thickness of 1 mm from detonation diamond powder and then forming a carbon binder into the preform. The formation of the binder is carried out from gaseous hydrocarbons - methane - at a temperature of 700 ° C to ensure the specified mass phase ratio.

Носитель использовали для культивирования человеческих фибробластов. Образцы стерилизовали автоклавированием при 121°С в течение 20 мин и помещали в полистироловые чашки Петри диаметром 35 мм ("Nunc", Дания). В чашки вносили суспензию фибробластов с концентрацией 105 кл/мл в среде DMEM ("Gibco", Англия) с 10% сыворотки плода коровы ("Gibco", Англия), 50 мкг/мл гентамицина и инкубировали в СO₂-инкубаторе с содержанием СO₂ 5% в течение 5 суток до формирования конфлуентного монослоя в контроле.The carrier was used to cultivate human fibroblasts. Samples were autoclaved at 121 ° C for 20 minutes and placed in polystyrene Petri dishes with a diameter of 35 mm (Nunc, Denmark). A suspension of fibroblasts with a concentration of 105 cells / ml in DMEM medium (Gibco, England) with 10% bovine serum (Gibco, England), 50 μg / ml of gentamicin was added to the plates and incubated in a CO ₂ incubator containing CO ₂ 5% for 5 days until the formation of a confluent monolayer in the control.

По окончании инкубации из чашек удаляли питательную среду, клетки отмывали 0,15 М NaCl и фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида в течение 10 мин при температуре +4°С. После фиксации клетки трижды отмывали дистиллированной водой и в течение 10 мин инкубировали в растворе бромистого этидия. Клетки изучали в ультрафиолете с помощью люминесцентного микроскопа Leica DM 1000.At the end of the incubation, the nutrient medium was removed from the plates, the cells were washed with 0.15 M NaCl and fixed with 2.5% glutaraldehyde solution for 10 min at a temperature of + 4 ° С. After fixation, the cells were washed three times with distilled water and incubated for 10 min in a solution of ethidium bromide. Cells were studied in ultraviolet light using a Leica DM 1000 luminescent microscope.

Было показано, что фибробласты равномерно распределяются по всей поверхности, легко прикрепляются к субстрату и, проникая в микропоры, образуют трехмерные структуры. Фибробласты сохраняли жизнеспособность на протяжении всего периода культивирования.It was shown that fibroblasts are evenly distributed over the entire surface, easily attach to the substrate and, penetrating into micropores, form three-dimensional structures. Fibroblasts remained viable throughout the cultivation period.

Таким образом, применение предлагаемого технического решения обеспечивает возможность эффективного культивирования клеток различного типа, использовать носитель для формирования тканеподобных трехмерных клеточных структур.Thus, the application of the proposed technical solution provides the ability to efficiently cultivate cells of various types, use a carrier to form tissue-like three-dimensional cell structures.

Claims

1. A carrier for cell cultivation, consisting of a carbon-containing material, characterized in that the carrier is made of a material consisting of detonation synthesis diamond particles bonded by a carbon binder obtained by thermal decomposition of gaseous hydrocarbons, wherein the mass ratio of the carbon binder and detonation synthesis diamond is 0 , 1-0.4.

2. The carrier according to claim 1, characterized in that its porosity is 40-60 vol.%.