RU2855503C1 - Штамм бактериофага Ph_15 (Ph-198), обладающий литической активностью в отношении Pseudomonas aeruginosa - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской вирусологии и микробиологии. Предложен штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa. Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ГКПМ) Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) под регистрационным номером № Ph-198. Штамм обладает литической активностью в отношении бактерий синегнойной палочки и диспергирующей активностью в отношении экзополисахаридного матрикса биологических пленок P. aeruginosa. Изобретение позволяет осуществить производство медицинских биологических антибактериальных лекарственных средств - препаратов бактериофагов, предназначенных для профилактики и лечения гнойно-воспалительных и энтеральных инфекций, ассоциированных с бактериями P. aeruginosa в форме биопленки. 3 ил., 3 пр.

Description

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии и касается штамма бактериофага Pseudomonas aeruginosa Ph_15, который может быть использован для создания новых диагностических и лечебно-профилактических препаратов. Штамм обладает литической активностью в отношении бактерий синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa, а также диспергирующей активностью в отношении экзополисахаридного матрикса биологических пленок P. aeruginosa.

Бактерии синегнойной палочки могут быть причиной широкого спектра острых инфекций, таких как внутрибольничная пневмония, ожоговые и раневые инфекции, а также причиной хронической инфекции у пациентов с муковисцидозом.

Бактерии Pseudomonas aeruginosa относятся к условно-патогенным микроорганизмам, обладающим естественной множественной лекарственной устойчивостью. Кроме того, данные микроорганизмы способны формировать приобретенную резистентность (50-100%) к большинству антибиотиков [Vohra, 2024]. Поэтому серьезной угрозой для общественного здравоохранения является появление и распространение антибиотикоустойчивых изолятов P. aeruginosa [Rakshit, 2024]. Лекарственно-устойчивая P. aeruginosa ежегодно приводит к 559000 смертей, что ставит ее в ряд наиболее смертоносных бактериальных патогенов во всем мире [GBD Lancet 2022]. Лекарственно-устойчивые P. aeruginosa, по оценкам, вызывают около 7% всех инфекций в мире, связанных с оказанием медицинской помощи, и почти четверть всех инфекций приобретается в отделениях интенсивной терапии [Folic 2021]. Бактерии P. aeruginosa обладают потенциалом повреждать все ткани и органы макроорганизма больного: вызывают острую или хроническую инфекцию у лиц с ослабленным иммунитетом, страдающих хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), муковисцидозом, раком, травмами, ожогами, сепсисом и вентилятор-ассоциированной пневмонией (ВАП), включая вызванные COVID-19 [Jurado-Martin 2021]. Лечение инфекции P. aeruginosa чрезвычайно затруднено из-за ее быстрых мутаций и адаптации для приобретения устойчивости к антибиотикам [Blomquist 2021]. Вышеупомянутая статистика требует идентификации лекарственных мишеней и разработки новых методов лечения и эффективных вакцин против P. aeruginosa для улучшения здоровья человека. Однако обе попытки столкнулись с огромными трудностями из-за всплеска случаев со штаммами с множественной лекарственной устойчивостью. Синегнойная палочка является четвертым по частоте встречаемости патогеном, вызывающим около 8% хронических раневых инфекций, и седьмым по значимости, вызывающим до 6% инфекций кровотока [Vetrivel 2021]. Быстрое распространение и высокая смертность от заболеваний, вызванных P. aeruginosa, обусловлена большим набором факторов вирулентности, высокой природной резистентностью, а также способностью этих бактерий образовывать биопленки. Хронические инфекции, вызванные P. aeruginosa, могут быть связаны со способностью данного патогена образовывать биопленки. Биопленка характеризуется наличием внеклеточного вещества - матрикса, который обеспечивает прикрепление клеток к поверхности, их коммуникацию, а также защиту от внешних воздействий. Наличие биопленки обуславливает устойчивость данного микроорганизма к широкому спектру антибиотиков и дезинфицирующих средств, а также к компонентам иммунной системы макроорганизма [da Cruz Nizer 2024]. В связи с этим чрезвычайно актуальной является проблема поиска и разработки новых средств против инфекций, ассоциированных с биопленками бактерий P. aeruginosa.

Известен патент RU 2186574, 2002 г., в котором заявленный препарат Combiphage, состоящий из смеси 4 штаммов бактериофагов, предлагается для лечения инфекций, вызванных P. aeruginosa.

Недостатками изобретения являются:

- отсутствуют генетические характеристики запатентованных штаммов бактериофагов, определяющих их таксономическое положение;

- не описано наличие генов лекарственной устойчивости, токсигенности и лизогенности.

Известен патент ЕР 2248890, 2010 г., в котором предлагается использование 6 штаммов бактериофагов P. aeruginosa для разработки фаговых коктейлей, предназначенных для профилактики или лечения муковисцидоза.

Недостатками изобретения являются:

- не описано наличие генов лекарственной устойчивости, токсигенности и лизогенности;

- данным бактериофагам свойственна узкая специфичность (30-40%) в отношении штаммов бактерий P. aeruginosa, наличие активность только в отношении штаммов бактерий P. aeruginosa РАК и СНА, вызывающих муковисцидоз;

- отсутствуют данные о широте спектра антибактериальной активности предлагаемых бактериофагов в отношении внутрибольничных штаммов бактерий P. aeruginosa, поскольку для данной характеристики использовались только бактерии P. aeruginosa РАК и СНА в количестве 40 штаммов.

Известен патент RU 2455355, 2012 г., в нем предложено использование штамма бактериофага P. aeruginosa ph57 в качестве компонента антисептического средства в ветеринарии.

Недостатками изобретения являются:

- отсутствуют генетические характеристики бактериофага ph57, приведена только его родовая принадлежность и тип нуклеиновой кислоты;

- не описано наличие генов лекарственной устойчивости, токсигенности и лизогенности;

- не достоверно охарактеризован спектр антибактериальной активности данного штамма бактериофага в отношении внутрибольничных штаммов бактерий P. aeruginosa, потому что для данной характеристики использовалось 10 штаммов бактерий P. aeruginosa, согласно приведенным примерам.

Известен патент WO 2015059298, 2015 г., описывающий применение 13 штаммов бактериофагов P. aeruginosa в качестве антимикробных препаратов в комбинациях от 2 до 13 бактериофагов.

Недостатками изобретения являются:

- не приведены убедительные данные о характеристике спектра антибактериальной активности предлагаемых бактериофагов в отношении внутрибольничных штаммов бактерий P. aeruginosa, поскольку для данной характеристики использовалось всего 20 коллекционных эталонных лабораторных штаммов бактерий P. aeruginosa из международной коллекции LMG (ВССМ LMG /бактерий Collection);

- не описано наличие генов лекарственной устойчивости, токсигенности и лизогенности.

Известен патент RU 2717973, 2020 г., описывающий применение штамма бактериофага P. aeruginosa N 322 для приготовления моно- и поливалентных лечебно-профилактических препаратов бактериофагов.

Известен патент RU 2831173, 2024 г., описывающий применение штамма бактериофага Pseudomonas phage Ка2 предлагаемого для профилактики и лечения инфекционных заболеваний, вызываемых P. aeruginosa.

Недостатками изобретения являются:

- отсутствуют данные о специфичности и широте спектра антибактериальной активности предлагаемого бактериофага в отношении штаммов бактерий.

Общие недостатки всех вышеперечисленных изобретений:

- не описан положительный эффект воздействия бактериофагов и их белков на биопленку P. aeruginosa;

- не описано наличие генов, определяющих структуры белков, способных оказывать деструктивное воздействие на экзополисахаридный матрикс биопленок P. aeruginosa.

На сегодняшний день в Российской Федерации известны моно- и поливалентные лечебно-профилактические препараты бактериофагов, содержащие штаммы бактериофагов P. aeruginosa: «Бактериофаг синегнойной палочки», «Пиобактериофаг поливалентный очищенный», «Интести-бактериофаг», которые наряду с антибиотиками применяются для лечения и профилактики синегнойных инфекций. Однако не существует запатентованных изобретений, описывающих применение бактериофагов для разрушения экзополисахаридного матрикса биологических пленок P. aeruginosa.

Задача, решаемая изобретением, состоит в получении штамма литического бактериофага P. aeruginosa, обладающего широким спектром антибактериальной активности в отношении эпидемиологически значимых выделенных от больных клинических и госпитальных штаммов бактерий P. aeruginosa и отвечающего российским и международным требованиям, предъявляемым к бактериофагам в составе лечебно-профилактических препаратов.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является расширение арсенала штаммов бактериофагов P. aeruginosa, не содержащих гены лекарственной устойчивости, лизогенности и токсигенности, способых разрушать экзополисахаридный матрикс биологических пленок P. aeruginosa.

Технический результат достигается тем, что предложен штамм бактериофага P. aeruginosa обладающий литической активностью в отношении Pseudomonas aeruginosa, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, под № Ph-198.

Штамм бактериофага P. aeruginosa Ph_15 характеризуется следующими свойствами:

1. Источник выделения бактериофага P. aeruginosa Ph_15.

Штамм бактериофага P. aeruginosa Ph_15 найден в 2021 году в естественных условиях в сточной воде п. Оболенск Московской области.

2. Спектр литической активности бактериофага P. aeruginosa Ph_15.

Широта спектра антибактериальной активности штамма бактериофага P. aeruginosa Ph_15, определенная в тесте Аппельмана, составляет 67% в отношении 85 выделенных от больных с различной патологией и госпитальных штаммов P. aeruginosa эпидемиологически значимых, типичных по своим культуральным, морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам, в 100% резистентных к одному или более антибиотикам, полученных из госпиталей и стационаров регионов России. Генетическая характеристика бактериофага P. aeruginosa Ph_15.

3. Генетические свойства штамма бактериофага P. aeruginosa Ph_15.

Геном бактериофага Ph_15 представлен линейной двухцепочечной ДНК размером 43260 п.н. и GC-составом 45,37%. В результате аннотации генома выявлены 52 белок-кодирующие последовательности (CDSs). Для 36,5% кодируемых белков определены предполагаемые функции. Оставшуюся часть генома (33CDSs) составляют гипотетические полипептиды с неизвестной функцией. В геноме выявлены гены, кодирующие такие ферменты как ДНК-полимераза и хеликаза, а также 2 гена, кодирующих белки с экзонуклеазной активностью. Аннотированы геномные последовательности белков-упаковщиков ДНК (терминаза и Rz-like белок), основного и внутренних белков капсида и портального белка. Выявлен ген, кодирующий белок, обладающий эндопептидазной активностью в отношении структурных элементов клеточной стенки P. aeruginosa, что определяет активность фага в отношении компонентов экзополисахаридного матрикса биологических пленок Pseudomonas aeruginosa. В геноме штамма бактериофага отсутствуют гены лизогении, токсигенности, лекарственной устойчивости.

4. Биологические свойства бактериофага P. aeruginosa Ph_15.

Штамму свойственны: литический характер взаимодействия с бактериальными клетками, высокая степень (90%) и скорость адсорбции (20 мин), длительность латентного периода (30 мин), урожайность (64 фаговых вирионов/бакт.кл), морфологии негативных колоний.

5. Морфология негативных колоний штамма бактериофага Ph_15.

При высеве штамма фага двухслойным методом Грациа на газоне тест-штамма бактерии P. aeruginosa ATCC 27853 образуются негативные колонии диаметром (5,0±1,0) мм с наличием зон неполного лизиса (Фиг. 2).

6. Морфология фаговых вирионов и таксономия штамма бактериофага P. aeruginosa Ph_15.

По данным электронной микроскопии, штамм бактериофага P. aeruginosa Ph_15 имеет размер капсида 40 нм с хвостовым отростком размером 40 нм (Фиг. 1). По морфологии вирионов и генетическим свойствам относится к литическим бактериофагам семейства Fredfastierviridae, рода Jamesmcgillvirus.

В отличие от большинства аналогов существенными отличительными признаками штамма бактериофага P. aeruginosa Ph_15 являются:

- наличие данных о широком спектре антибактериальной активности штамма фага Ph_15 (67%) в отношении 85 эпидемиологически значимых госпитальных и выделенных от больных клинических штаммов патогенных бактерий P. aeruginosa в 100% резистентных к одному или более антибиотикам, полученных из госпиталей и стационаров регионов России.

- наличие в геноме L-Ala-D-Glu-пептидазы, обладающей эндопептидазной активностью в отношении полимерных структур капсулы P. aeruginosa, что определяет активность фага в отношении компонентов экзополисахаридного матрикса биологических пленок.

Предлагаемая совокупность существенных признаков изобретения является новой.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:

Фиг 1. Электронные микрофотографии бактериофага P. aeruginosa Ph_15. Просвечивающая электронная микроскопия.

Фиг 2. Негативные колонии бактериофага P. aeruginosa Ph_15.

Фиг 3. Комплексное применение бактериофага P. aeruginosa Ph_15 и дезинфицирующих веществ для разрушения биопленки, сформированной P. aeruginosa.

Для лучшего понимания идеи изобретения предлагаются следующие примеры.

Пример 1. Условия выделения и размножения штамма бактериофага P. aeruginosa Ph_15

Штамм бактериофага Ph_15 выделен методом клонирования уколом из негативной колоний, полученной по рассеве двухслойным методом Грациа на 0,7%-1,5% агаровой среде пробы сточной воды г. Оболенска Московской области и тест-штамма бактерии P. aeruginosa ATCC 27853 (В-3416). Для размножения штамма фага используют питательные среды - стерильный мясо-пептонный бульон или бульоны с основами роста в виде панкреатических гидролизатов мяса или казеина. Для размножения штамма фага - штамм бактерии P. aeruginosa ATCC 27853 (18-24 часовую культуру) вносят в стерильный бульон в исходной концентрации бактерий (4,0-5,0)×10 бакт.кл/мл и одномоментно вносят бактериофаг Ph_15 в соотношении фаг/бактерия 1/50. Инкубирование проводят в течение 18-24 часов при температуре 37°С в условиях периодического статического культивирования. Об окончании процесса размножения фага свидетельствует визуальное просветление культуральной жидкости (фаголизата).

Пример 2. Условия хранения штамма бактериофага P. aeruginosa Ph_15

Штамм фага Ph_15 не чувствителен к хлороформу, поэтому фаголизат консервируют добавлением хлороформа (5-10)%. Концентрация фагов в фаголизате после окончания культивирования определяется методом Грациа и составляет (0,5-5,0)×10 фаговых вирионов в 1 мл. Штамм фага Ph_15 сохраняет литическую активность при хранении в виде фаголизата, содержащего 5-10% хлороформа, при температуре от +2°С до +8°С в МПБ в течение 5 лет.

Пример 3. Использование штамма бактериофага P. aeruginosa Ph_15 для оценки его совместного действия с противомикробными препаратами в отношении биопленок

Для оценки эффективности комплексного применения бактериофага P. aeruginosa Ph_15 и дезинфицирующих веществ тест-объекты с биопленкой погружали в суспензию бактериофагов (1×10⁹ БОЕ/мл) на 30 минут. После обработки тест-объекты переносили в растворы дезинфицирующих веществ на 15 мин. Для нейтрализации дезинфицирующих веществ при проведении экспериментов применяли 0,5% раствор тиосульфата натрия, 0,5% раствор лаурилсульфата натрия или универсальный нейтрализатор (твин-80 - 3%, сапонин - 3%, гистидин - 0,1%, цистеин солянокислый - 0,1%) в зависимости от вида дезинфицирующего вещества. Далее тест-объект отмывали трехкратно в SM-буфере, переносили в пробирки с жидкой питательной средой и инкубировали при температуре 37°С в течение 48 ч. Критерием эффективности разрушения биопленки считали 100% инактивацию бактериальных клеток в ее составе, о чем судили по отсутствию роста в жидкой питательной среде. В качестве контроля вместо дезинфицирующего вещества использовали стерильную воду.

Полученные результаты представлены на Фиг. 3, где приведены данные экспериментов по изучению эффективности комплексного применения тестируемого фага и дезинфицирующих веществ в отношении биопленки P. aeruginosa. Показано, что предварительная обработка биопленки бактериофагами позволяет снизить значения показателей минимальных бактерицидных концентраций (МБК) дезинфицирующих веществ, необходимых для разрушения биологических пленок P. aeruginosa, от 2 до 25 раз в зависимости от вида применяемого дезинфицирующего вещества.

В отличие от большинства представленных аналогов штамм бактериофага P. aeruginosa Ph_15 обладает широким спектром литической активности в отношении эпидемиологически значимых госпитальных штаммов P. aeruginosa и выраженной диспергирующей активностью в отношении экзополисахаридного матрикса биологических пленок, его применение позволяет значительно повысить эффективность проведения профилактики и терапии инфекционных заболеваний.

Claims (1)

1. Штамм бактериофага Ph_15, обладающий литической активностью в отношении Pseudomonas aeruginosa, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, под № Ph-198.