RU2852296C2 - Тест-система для выявления однонуклеотидной замены в гене tg5 крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной генетики сельскохозяйственных животных. Описан способ детекции однонуклеотидного полиморфизма гена TG5 с помощью тест-системы, включающей специфический набор реагентов: смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, буфер для постановки реакции, термостабильный фермент - Taq-полимеразу, два синтетических олигонуклеотидных праймера, специфичных к данному участку ДНК, два вида аллель-специфичных флюоресцирующих зондов, общий для обоих аллелей гасящий зонд, минеральное масло, защищающее реакционную смесь от испарения при ПЦР. Изобретение позволяет повысить надежность типирования крупного рогатого скота. Способ демонстрирует стабильную воспроизводимость результатов при анализе количества копий ДНК, превышающего порог чувствительности тест-системы. 1 ил., 1 табл.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной генетики сельскохозяйственных животных.

Тиреоглобулин - это один из ключевых белков щитовидной железы, который является предшественником тиреоидных гормонов - трийодтиронина (Т3) и тетрайодтиронина (Т4). Они высвобождаются путем гидролиза йодированного тиреоглобулина и секретируются в кровь. Гормоны щитовидной железы модулируют многие физиологические и биохимические процессы практически во всех тканях организма, влияют на рост клеток, дифференцировку тканей, принимают участие в формировании жировых клеток, метаболизме жира в организме [1].

Ген тиреоглобулина (TG5) рассматривается как функциональный ген-кандидат крупного рогатого скота, влияющий на накопление жира в организме, а также на выход молочного жира и его процентное содержание в молоке. В то же время данный ген рассматривается как ген-кандидат мраморности мяса [2-5]. Эти характеристики делают ген PRL перспективным геном-кандидатом.

Известен способ оценки селекционного уровня показателей продуктивности абердин-ангусского скота с учетов использования генетического маркера тиреоглобулина TG5^CT (патент RU 2639532 С1 от 21.12.2017). Способ основан на применении коэффициента наследственности по генотипу СТ гена TG5 у коров абердин-ангусской породы [6]. Недостатком является отсутствие последовательностей праймеров, используемых для генотипирования животных, а также узкая породная направленность способа на абердин-ангусскую породу скота. Патент не действует с 06.03.2022.

Известен способ определения генетического потенциала молочной продуктивности телок крупного рогатого скота мясных пород (патент RU 2688336 С2 от 21.05.2019). Способ основан на установлении генотипов методом ПЦР отдельно по гормону тиреоглобулину TG5 и гормону роста bGH, а затем сопряженных генотипов по обоим генам [7]. Основным отличием данного способа является то, что выявление телок производится по сочетанию генотипов гормона роста и тиреотропного гормона. Недостатком данного способа является специфика проведения полимеразных цепных реакций типа ПДРФ - необходимость выполнения дополнительных процедур после процесса амплификации ДНК (рестрикция и электрофорез), при этом анализ и интерпретация результатов не является автоматизированным, требует определенной квалификации от сотрудников, занимает значительное количество времени и плохо поддается формализации и переводу в цифровой формат. Патент не действует с 18.05.2023.

Существенным отличием приведенных способов является применимость в селекции крупного рогатого скота мясного направления продуктивности. Тогда как предлагаемый способ содержит методику определения генотипа гена TG5, применимую и воспроизводимую на крупном рогатом скоте любой породы.

Таким образом, в результате патентного поиска авторами не выявлены действующие патенты, содержащие информацию об изобретениях, аналогичных настоящему, что позволяет сделать вывод о его соответствии критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

В предлагаемой тест-системе используются праймеры, общие для «дикого» и «мутантного» вариантов нуклеотидной последовательности, аллель-специфичные FAM- и HEX-зонды и один общий для обоих аллелей BHQ-зонд, несущий гаситель флуоресценции. Тест-система адаптирована под метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Гибридизация зондов происходит после завершения амплификации, что делает возможным определять SNP-мутации, расположенные внутри областей связывания ДНК-матрицы и зонда. Генотипирование образца ДНК происходит в одной пробирке путем установления температур плавления аллель-специфичных зондов, характерных для каждого из аллелей. При анализе генотипа учитывается форма кривой плавления, что позволяет автоматизировать и формализовать процедуру интерпретации полученных данных, снизив вероятность ошибки оператора.

Цель изобретения - разработка тест-системы для выявления однонуклеотидной замены в гене TG5 крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Технический результат изобретения: разработка тест-системы для выявления однонуклеотидной замены в гене TG5 крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с целью повышения надежности типирования крупного рогатого скота.

Принцип действия: метод основан на определении температуры плавления олигонуклеотидых зондов, которая напрямую зависит от наличия или отсутствия нуклеотидных замен в матрице ДНК в области гибридизации зондов. Определение генотипа основано на проведении полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с праймерами, общими для «дикого» и «мутантного» вариантов нуклеотидной последовательности.

Для установления температуры плавления, кроме флуоресцентно-меченого типирующего зонда, в реакционную смесь добавляется тугоплавкий олигонуклеотидный зонд с гасителем флуоресценции, который гибридизуется на матрице ДНК в непосредственной близости к типирующему зонду. При низкой температуре происходит гибридизация зондов с амплифицированной в ходе ПЦР ДНК, в результате чего флуоресцентный краситель оказывается рядом с гасителем флуоресценции. По увеличению флуоресцентного сигнала при повышении температуры можно определить температуру плавления типирующего зонда и, следовательно, определить наличие однонуклеотидной замены. Для повышения надежности типирования используется одновременная гибридизация с двумя альтернативными типирующими зондами, меченными различными флуорофорами (FAM-предковый аллель, HEX-мутантный аллель). С помощью метода метод кривых плавления на основании пиков плавления (денатурации) определяется гетерозиготный и гомозиготный образец. Для гомозиготных образцов пики плавления будут отличаться, а для гетерозиготных температуры плавления будут примерно одинаковы (фиг. 1).

Амплификационная смесь содержит: ПЦР-буфер 1-кратный, смесь дезоксирибонуклеотидов - 25 мМ каждого, зонд FAM - 0,1 пм/мкл, зонд НЕХ-0,1 пм/мкл, зонд BHQ - 0,3 пм/мкл, праймер 1 - 0,6 пм/мкл, праймер 2 - 0,1 пм/мкл. В реакции используется термостабильный фермент Taq-полимераза в количестве 2,5 единицы активности на реакцию. Для предотвращения испарения амплификационной смеси поверх нее наслаивается 20 мкл минерального масла.

При апробации разработанного способа предварительно проводили отбор образцов генетического материала (периферическая кровь) у коров черно-пестрой породы (n=105) из хвостовой вены в промаркированные стерильные вакуумные пробирки с антикоагулянтом ЭДТА К2 («IMPROVE», Германия). Экстракцию ДНК из крови проводили с помощью набора ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА (ООО «НПО ДНК-технология», Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе «ДТ-48» (ООО «НПО ДНК-технология», Россия) в соответствии с протоколом, разработанным для этой тест-системы (таблица):

Для амплификации гена TG5 коров использовали праймеры:

TG5_for 5' -ggT gAA ААТ СТТ gTg gAg gCT gTA -3',

TG5_rev 5' -CAg TTC TTC CTT ggT ggC TCA gA -3'.

Для контроля качества ДНК и оценки эффективности работы праймеров продукты ПЦР анализировали методом агарозного гель-электрофореза. Для приготовления 1 л 10-кратного ТВЕ-буфера добавляли в мерную колбу 108 г TRIS (основного), 55 г борной кислоты, 40 мл 0,5М ЭДТА (рН 8,0) и довести объем mQ до 1 л. Для приготовления геля для электрофореза в мерном стакане на 50 мл смешивали 25 мл 1% ТВЕ-буфера, 0,25 г агарозы и 1 мкл бромистого этидия. Разогревали смесь в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Заливали смесь в камеру для приготовления гелей. Образцы наносили в лунки в составе 5х загрузочного буфера (бромфенол/глицерин). Условия проведения электрофореза выставляли в соответствии с инструкцией производителя камеры «Mupid-exU» (Япония).

Последовательности генотипирующих зондов:

TG5_FAM (FAM)-5'-CTT СТС CAg ggA АТС ТТ-3'-(Р),

TG5_HEX (НЕХ)-5'-СТТ СТС CAg ggg АТС ТТ-3'-(Р),

TG5_BHQ1 5'-АТА CTg gAg Tgg gTA gCC TTT CC -3'-(BHQ1).

С помощью разработанной тест-системы определены аллели и генотипы образцов ДНК коров черно-пестрой породы (n=105) по полиморфизму TG5. Частота генотипов CC, СТ, ТТ составила 69,5, 28,6 и 0,19% соответственно. Аллели TG5^C и PRL^T демонстрировали частоту 0,838 и 0,162 соответственно.

Источники информации:

1. Лемякин, А.Д. Ассоциация гена тиреоглобулина (TG5) с хозяйственно полезными признаками крупного рогатого скота (грант Президента Российской Федерации №МК-5026.2022.5) / А.Д. Лемякин, А.Н. Тяжченко, А.А. Чаицкий [и др.] // Аграрный вестник Нечерноземья. - 2022. - №4(8). - С. 39-47. - DOI 10.52025/2712-8679_2022_04_39. - EDN LMKSTI.

2. Валитов, Ф.Р. Эффективность использования современных методов маркерной селекции в молочном скотоводстве // дисс.… д-ра с. -х. наук: 06.02.07 - Разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных / Валитов Фарит Равилович. - Уфа, 2018. - 396 с.

3. Dolmatova, I. Effect of the bovine TG5 gene polymorphism on milk - And meat-producing ability / I. Dolmatova, F. Valitov, R. Gizatullin [et al.] // Veterinary World. - 2020. - Vol. 13. - No 10. - P. 2046-2052. - DOI 10.14202/vetworld.2020.2046-2052. - EDN DNLGOC.

4. Рачкова, E.H. Ассоциации генов, связанных с молочной продуктивностью и резистентностью к маститу крупного рогатого скота // дисс.… канд. биол. наук: 06.02.07 - Разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных / Рачкова Екатерина Николаевна. - Казань, 2017. - 115 с.

5. Сафина, Н.Ю. Ассоциация полиморфизма гена тиреоглобулина с интенсивностью роста и воспроизводительных качеств голштинского скота / Н.Ю. Сафина, Ш.К. Шакиров, Ф.Ф. Зиннатов [и др.] // Ветеринарный врач. - 2018. - №1. - С. 59-63. - EDN YSZKNY.

6. Патент РФ №2639532 С1, МПК A01K 67/02. Способ оценки селекционного уровня показателей продуктивности абердин-ангусского скота с учетов использования генетического маркера тиреоглобулина TG5CT: №2016135817: заявл. 05.09.2016, опубл. 21.12.2017 / В.М. Габидулин, С.А. Мирошников, С.А. Алимова [и др.]; заявитель Федеральное Государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт мясного скотоводства. - EDN YDNWRB.

7. Патент РФ №2688336 С2, МПК A01K 67/02. Способ определения генетического потенциала молочной продуктивности телок крупного рогатого скота мясных пород: №2017140152: заявл. 17.11.2017, опубл. 21.05.2019 / С.А. Мирошников, Л.Г. Сурундаева, Л.А. Маевская [и др.]; заявитель Федеральное Государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт мясного скотоводства. - EDN AYOSYO.

--->

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ

ОДНОНУКЛЕОТИДНОЙ ЗАМЕНЫ В ГЕНЕ TG5 КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С ПОМОЩЬЮ

ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2025-03-10">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023129563/10(065691)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-11-14</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>-</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023129563/10(065691)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-11-14</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего образования «Костромская государственная

сельскохозяйственная академия»</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal State Budgetary Educational Institution of Higher

Education Kostroma State Agricultural Academy</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Сабетова Ксения Дмитриевна</InventorName>

<InventorNameLatin>Sabetova Kseniya Dmitrievna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ОДНОНУКЛЕОТИДНОЙ

ЗАМЕНЫ В ГЕНЕ TG5 КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>cattle</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtgaaaatcttgtggaggctgta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q13">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>cattle</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cagttcttccttggtggctcaga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>cattle</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cttctccagggaatctt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>cattle</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cttctccaggggatctt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>cattle</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atactggagtgggtagcctttcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims (9)

1. Способ детекции однонуклеотидного полиморфизма гена TG5 крупного рогатого скота с помощью тест-системы, включающей смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, буфер для постановки реакции, термостабильный фермент - Taq-полимеразу, два синтетических олигонуклеотидных праймера, специфичных к данному участку ДНК:
2. TG5_forw: 5' - ggt gaa aat ctt gtg gag gct gta – 3',
3. TG5_rev: 5' - cag ttc ttc ctt ggt ggc tca ga – 3',
4. два вида аллель-специфичных флюоресцирующих зондов:
5. TG5_FAM: (FAM) – 5'- ctt ctc cag gga atc tt – 3' - (P),
6. TG5_HEX: (HEX) – 5'- ctt ctc cag ggg atc tt – 3' - (P),
7. общий для обоих аллелей гасящий зонд:
8. TG5_BHQ1: 5'- ata ctg gag tgg gta gcc ttt cc – 3' - (BHQ1),
9. минеральное масло, защищающее реакционную смесь от испарения при ПЦР.