RU2847297C1 - Способ терапии спинальной травмы с помощью трансплантации регенеративного матрикса с последующей нейромодуляцией - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу лечения острой осложненной позвоночно-спинномозговой травмы (ПСМТ). Указанный способ включает два этапа: 1) интраоперационное интраспинальное субдуральное введение регенеративного матрикса, состоящего из фибринового гидрогеля, концентрация которого составляет 50-75 мг/мл, с аллогенными мезенхимальными стволовыми клетками (МСК) из Вартонового студня нормальной плаценты человека или аутологичными или аллогенными МСК из костного мозга; 2) последующую электрическую стимуляцию спинного мозга ниже уровня травмы. Настоящее изобретение обеспечивает повышение эффективности лечения ПСМТ и сокращение сроков проведения эпидуральной электрической стимуляции для достижения восстановления локомоторной функции за счет комбинированной терапии. 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к нейрохирургии и регенеративной медицине, и может быть использовано для терапии острой осложненной позвоночно-спинномозговой травмы (ПСМТ).

Существует неудовлетворенная медицинская потребность в эффективных методах терапии и нейрореабилитации при спинальной травме, заболеваемость которой составляет от 26,5 до 50 случаев на миллион населения [Barbiellini Amidei С, 2022]. Одним из наиболее перспективных подходов к регенерации спинного мозга является регенеративная терапия с помощью стволовых/прогениторных клеток, таких как нейральные прогениторные клетки или мезенхимальные стволовые клетки (МСК). Проведенный мета-анализ результатов 188 доклинических исследований по трансплантации 16 видов стволовых клеток на животных моделях ПСМТ показал, что применение клеточной терапии вместе с различными скаффолдами существенно улучшает функциональное восстановление спинного мозга [Shang Z., 2022]. Это происходит за счет паракринного эффекта стволовых клеток, улучшающего выживание и регенерацию структур спинного мозга. Именно паракринным эффектом можно объяснить положительное влияние мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани на восстановление функций спинного мозга при интратекальном введении человеку в рамках I фазы клинических исследований [Bydon, М., 2024].

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) - это удовлетворяющие критериям стволовости клетки из популяций мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (согласно терминологии, разработанной по рекомендациям Международного общества клеточной терапии (International Society for Cellular Therapy - ISCT)) [Horwitz E.M., 2005]. Под критериями стволовости подразумевается способность дифференцироваться в мезодермальные, эктодермальные и энтодермальные клетки (то есть так называемая клеточная мультипотентность), наряду со способностью к делению и пролиферации. МСК широко применяются в клеточной терапии и регенеративной медицине, в связи с иммуномодулирующим, противовоспалительным, стимулирующим ангиогенез и снижающим клеточную гибель действием как самих МСК, так и биоактивных молекул, которые они секретируют [Jin Q, 2022, Pang Q-M, 2022]

Клиническое испытание второй фазы, при котором проводилась аутологичная трансплантация МСК костного мозга при ПСМТ зарегистрировано как JMA-IIA00154 (Японская медицинская ассоциация, англ. the Japan Medical Association).

В клиническом испытании NCT02481440 (фаза 1/11) проводилась оценка безопасности и эффективности повторных (четырехкратных) интратекальных субарахноидальных введений аллогенных мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека для терапии травм спинного мозга. Это было проспективное одноцентровое клиническое исследование с одной группой, куда рекрутировали 102 пациентов с полной или неполной шейной, грудной и грудопоясничной травмой спинного мозга. Испытание было завершено в марте 2020 года. В ходе исследования не было зарегистрировано серьезных нежелательных эффектов.

Рандомизированное двойное слепое перекрестное плацебо-контролируемое клиническое исследование фазы 1/2а под номером NCT03003364 было проведено на 10 пациентах с хронической полной травмой спинного мозга на дорсальном уровне. Введение МСК не привело к значительным нежелательным эффектам. После терапии МСК наблюдалось значительное улучшение ощущения уколов в дерматомах ниже уровня повреждения по сравнению с плацебо. Никаких изменений в двигательной функции, функции кишечника, качестве жизни или показателях независимости не наблюдалось.

В междисциплинарном клиническом исследовании фазы 1 CELLTOP проводимом в Mayo Clinic (идентификатор исследования NCT03308565), проводилось изучение безопасности и эффективность интратекальных инфузий аутологичных МСК, полученных из жировой ткани у пациентов с тупой травмой спинного мозга. Клиническая оценка эффективности проводилась через 3, 6, 12 и 18 месяцев после инъекции, как по двигательным, так и по сенсорным показателям на основе Международных стандартов неврологической классификации повреждений спинного мозга. В отчете по исследованию сообщается о состоянии первого пациента, участвовавшего в исследовании. Это 53-летний пациент, с травмой класса С по классификации Американской ассоциации травм позвоночника на момент начала исследования. Согласно протоколу, пациент получил интратекальную инъекцию аутологичных МСК, которые были введены после стандартной люмбальной пункции, в область на уровне L3-4 позвонка, через 11 месяцев после травмы. Каких-либо нежелательных эффектов после процедуры не наблюдалось. Клинические признаки эффективности были оценены через 3, 6, 12 и 18 месяцев после введения клеток, по двигательным и сенсорным показателям на основе Международных стандартов неврологической классификации повреждений спинного мозга.

Мета-анализ 26 клинических испытаний МСК при спинномозговой травме показал, что в пяти исследованиях у некоторых пациентов наблюдалось улучшение по классификации AIS от А до С, а в четырех исследованиях - от А до В. У большего числа пациентов, получавших МСК, состояние улучшилось от AIS А до С по сравнению с контрольной группой (только исследования, на пациентах в течение 8 недель после травмы) [Kvistad С.Е., 2022].

Еще одним индуктором нейрогенеза является обогащенная тромбоцитами плазма (PRP). В ряде исследований показано, что PRP, за счет содержания различных факторов роста (PDGF-AB, TGF-β1, IGF-1, VEGF) и тромбоцитарных экзосом, содержащих микроРНК и другие сигнальные молекулы, способствует нейрогенезу и росту аксонов, усилению пролиферации и миграции Шванновских клеток а также экспрессии NGF GDNF. Указанные свойства PRP позволяют рассматривать ее как перспективный источник аутологичных факторов роста и биомиметический скаффолд, создающий необходимое микроокружение.

Помимо PRP для усиления эффектов клеточной терапии применяются различные гидрогели, в том числе гидрогели на основе природных биоматериалов, таких как гиалуроновая кислота, хитозан, коллаген, фибрин и др. [Feng С, 2023].

Из уровня техники известны несколько способов регенеративной терапии с помощью фибринового гидрогеля. Известен способ, описанный в патенте RU2739912. «Способ стимулирования регенерации спинного мозга при помощи везикул, полученных из мезенхимных стволовых клеток жировой ткани». Вместе с тем, в отличие от указанного способа, в РМ Нейромат присутствуют не экзосомы, а живые аллогенные МСК из Вартонова студня плаценты, продуцирующие экзосомы и таким образом, действующие дольше, чем экзогенно введенные экзосомы. Способ применения ЛС на основе везикул -местно, внутривенно и интратекально, в то время как РМ Нейромат применяется только местно, интраспинально и субдурально.

Способ терапии спинальной травмы, описанный в патенте RU2650638 «Способ стимулирования регенерации спинного мозга с помощью мезенхимальных стволовых клеток, заключенных в фибриновый матрикс» описывает применение МСК из жировой ткани или из пульпы зуба, заключенных в фибриновый клей Tissucol. Клетки вводятся эпидурально через 6 недель после травмы, с нанесением «насечек» на твердую мозговую оболочку. Эффективность способа, так же, как в случае РМ «Нейромат» показана в эксперименте на минипигах, спинальная травма у которых гораздо более релевантна спинальной травме человека, чем спинальная травма у грызунов. В отличие от указанного способа в РМ Нейромат МСК выделяют из Вартонова студня плаценты человека, клетки имплантируются субдурально и интраспинально, дополнительными компонентами РМ является аутологичная плазма, обогащенная тромбоцитами. Также, способ применения РМ Нейромат включает второй этап - нейромодуляцию для ускорения регенерации поврежденных проводящих путей спинного мозга. Недостатком данного способа является наличие в составе клея Tissucol белков крупного рогатого скота, что повышает вероятность развития нежелательных явлений, в то время как РМ «Нейромат» полностью состоит из компонентов человеческого происхождения.

Перспективным методом нейрореабилитации после травмы спинного мозга является электростимуляция при помощи эпидуральных электродов. Все больше доказательств показывают, что за счет нейропластичности стимуляция спинного мозга улучшает двигательную функцию [Karamian В.А., 2022, Rowald А., 2022]. Из уровня техники известны подходы по эпидуральной электростимуляции спинного мозга, описанные в работах группы G.Courtine, показавшие частичное восстановление локомоции при спинальной травме в результате инвазивной эпидуральной стимуляции [Rowald А., 2022]. В патенте RU 2452528 С1 от 10.06.2012 заявлен способ хирургического лечения спинномозговой травмы позвоночника, включающий установку электродов для последующей электростимуляции передних отделов спинного мозга. При этом данные подходы малоэффективны у пациентов с полным поперечным поражением спинного мозга, поскольку сама по себе эпидуральная электрическая стимуляция никак не влияет на формирование глиомезодермального рубца, препятствующего прорастанию аксонов.

Недостатками всех перечисленных выше способов является то, что они не предусматривают возможности применения комбинации различных подходов для повышения эффективности лечения ПСМТ.

Наиболее близким аналогом нашего способа терапии является способ, описанный в статье Siddiqui AM et al. в 2021 году, в котором применили комбинацию эпидуральной электрической стимуляции (ЭЭС) с трансплантацией биосовместимого скаффолда на основе желатин-метакрилата (Gel-MA), содержащего нейротрофин-продуцирующие Шванновские клетки. В данном способе было показано наилучшее восстановление локомоторной функции в группе животных, получивших комбинированную терапию, по сравнению с животными, получившими отдельно ЭЭС и отдельно - трансплантацию Gel-MA со Шванновскими клетками. Недостатком указанного способа является то, что применялись генетически модифицированные клетки, имеющие худший профиль безопасности, по сравнению с первичными аллогенными или аутологичными МСК.

Таким образом, несмотря на известность различных подходов для лечения ПСМТ, существует потребность в улучшенных способах лечения, например, предусматривающих применение комбинированной терапии, направленной как на стимуляцию регенерации аксонов, так и на уменьшение выраженности глиомезодермального рубца для повышения эффективности лечения.

Разработанный нами способ терапии ПСМТ объединяет в себе регенеративную терапию путем трансплантации аллогенных МСК человека и нейромодуляцию ниже уровня травмы.

Изобретение относится к способу лечения острой осложненной ПСМТ, включающему два этапа: 1) интраспинальную, субдуральную эпидуральную трансплантацию аллогенных МСК из Вартонового студня нормальной плаценты человека или аутологичных/аллогенных МСК из костного мозга, выращенных в бессывороточной среде с добавлением 5% тромбоцитарного лизата человека, суспендированных в аутологичной плазме обогащенной тромбоцитами; трансплантация проводится в острейшем периоде ПСМТ во время проведения операции по декомпрессии спинного мозга; 2) последующую электрическую стимуляцию спинного мозга ниже уровня травмы.

В частном случае исполнения электрическая стимуляция осуществляется инвазивно через инвазивные эпидуральные электроды на уровне сегментов Th11 - L2 в двух частотных спектрах: одиночные импульсы 1 Гц; при мультисегментарной электростимуляции - от 10 до 35 Гц прямоугольными монополярными электрическими стимулами длительностью 200-250 мкс при инвазивной электрической стимуляции спинного мозга с величиной тока, подбираемой индивидуально, в зависимости от порога активации мышц нижних конечностей на фоне интенсивной двигательной реабилитации в течение 6 месяцев.

Электрическая стимуляция также осуществляется неизвазивно через накожные электроды, установленные на уровнях Th11-Th12 и/или Th12-L1 позвонков, в двух частотных спектрах: одиночные импульсы 1 Гц; при мультисегментарной электростимуляции - от 10 до 35 Гц прямоугольными монополярными электрическими стимулами длительностью 1 мс с величиной тока, подбираемой индивидуально, в зависимости от порога активации мышц нижних конечностей на фоне интенсивной двигательной реабилитации в течение 6 месяцев.

Техническим результатом данного изобретения является повышение эффективности лечения и сокращение сроков проведения эпидуральной электрической стимуляции для достижения восстановления локомоторной функции за счет комбинированной терапии, предусматривающей трансплантацию регенеративного матрикса в острейшем периоде во время операции по декомпрессии спинного мозга с последующей электрической стимуляцией спинного мозга и интенсивной реабилитацией в течение 6 месяцев.

Изобретение поясняется следующими чертежами.

На Фиг. 1 представлены иммунофенотипирование и оценка клеточного индекса полученных по разработанной технологии МСК. А. Раскрыта информация по иммунофенотипированию полученных по разработанной технологии МСК. Результат иммунофенотипирования: CD29+=98,8%; CD90+=97,7%; CD105=87,7%; CD73+=94,5%; CD44+=99,3%; CD45+=3,48%; CD34=0,51; HLA DR=10%. Б. Продемонстрирован повышенный клеточный индекса при культивировании МСК в присутствии 5% тромболизата, по сравнению с культивированием в аутологичной плазме.

На Фиг. 2 представлена количественная оценка экспрессии генов ростовых факторов и интерлейкинов в МСК из Вартонова студня плаценты человека. А. Высоко экспрессируемые гены. Б. Низко и средне экспрессируемые гены.

На Фиг. 3 показаны результаты кинематического анализа. Раскрыты результаты кинематического анализа, показывающие достоверное улучшение угловых движений в нижних конечностях у минипигов группы комбинированной терапии на фоне нейромодуляции. Обозначения: ГС - скакательный сустав (аналог голеностопного сустава у человека); КС - коленный сустав, ТБС - тазобедренный сустав. Группы: А.В. Контроль (группа №1) - травма без терапии; Б, Д, Е - «РМ Нейромат» (группа №3) - травма спинного мозга + трансплантация регенеративного матрикса + нейромодуляция. Г. РМ травма спинного мозга + РМ «Нейромат» (группа №2) Ж, З - травма спинного мозга + Нейромодуляция (№4) - группа сравнения. * - р<0,05 при сравнении с контрольными показателями; # - р<0,05 при сравнении комбинированной и изолированной терапии.

На Фиг. 4 продемонстрированы результаты регистрации мышечных ответов нижних конечностей у минипигов группы №3 (комбинированная терапия). А. Пример записи мышечной активности тазовых конечностей до (контроль) и после травмы спинного мозга (ТСМ) на фоне комбинированной терапии через 14 суток (ответы отсутствуют). Б. Пример записи мышечной активности тазовых конечностей до (контроль) и после травмы спинного мозга (ТСМ) на фоне комбинированной терапии через 30 и 75 сут. VL R - m. vastus lateralis справа, ТА R - m. tibialis anterior справа, GM R - m. gastrocnemius medialis справа.

На Фиг. 5 показана оценка параметров компонентов ответов икроножной мышцы, вызванных электрической стимуляцией спинного мозга на уровне L2-S1 у карликовых свиней группы №3 (комбинированная терапия). Показаны параметры компонентов ответов икроножной мышцы, вызванных электрической стимуляцией спинного мозга на уровне L2-S1 у карликовых свиней группы комбинированной терапии (раскрыто пятикратное увеличение амплитуды ответов к 85 суткам).

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Забор Вартонового студня для выделения МСК осуществляется из области, предлежащей к материнской части плаценты, вокруг входа пупочного канатика. Выделение МСК включает механическое измельчение и мягкую ферментативную обработку. Культивирование МСК производится в модифицированной бессывороточной среде, содержащей 5% тромболизат человека, приготовленный из свежезамороженного патоген-редуцированного тромбоконцентрата по технологии, являющейся ноу-хау. Полученные МСК характеризуются следующим фенотипом: не менее 90% положительных клеток по маркерам CD29, CD44, CD73, CD90; не менее 85% положительных клеток по маркеру CD105, не более 10% положительных HLA-DR и не более 5% положительных CD34 и CD45 (фиг. 1А); клеточный индекс не менее 5,8 через 120 часов культивирования (фиг. 1Б).

Полученные МСК характеризуются высокой паракринной активностью: лизат клеток содержит мРНК и белки IGFBP-3, -4, TGFbeta, VEGF, IL-6, BDNF, IGF2, PDGF, FGF2 (фиг. 2).

С целью оценки регенеративного потенциала МСК из различных источников проводили сравнительный анализ мультипотентности и экспрессии поверхностных маркеров (CD29, CD73, CD90, CD 105, CD34, CD44 и CD45) у МСК, полученных из Вартонового студня и костного мозга (аутологичных и аллогенных). Проведенное исследование показало, что МСК из двух указанных источников достоверно не отличаются друг от друга ни по экспрессии поверхностных маркеров, ни по способности дифференцироваться в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлении. Таким образом, в составе РМ «Нейромат» могут применяться аутологичные и аллогенные МСК из костного мозга человека.

Пример 2. Концентрация фибринового гидрогеля подобрана таким образом, чтобы обеспечить надежную фиксацию МСК в очаге патологии и при этом не оказывать влияния на их жизнеспособность вследствие избыточной контракции геля и изменения биомеханических свойств. Экспериментально подобрано, что для соответствия указанным характеристикам концентрация фибриногена должна находиться в пределах 50-75 мг/мл. Показано, что концентрация менее 50 мг/мл приводит к вымываю МСК из гидрогеля, в то время как концентрация выше 75 мг/мл приводит к образованию плотного гидрогеля, в котором наблюдается снижение выживаемости МСК менее 80%. Суспендирование МСК в аутологичной плазме, обогащенной тромбоцитами, способствует повышению выживаемости МСК по сравнению с суспензией в PBS на 35% и 47% спустя 12 и 24 часа инкубации соответственно.

Пример 3. В регламентном доклиническом исследовании исследовали эффективность заявляемого способа терапии ПСМТ на модели контузионной травмы спинного мозга у карликовых свиней. Исследование проводили на половозрелых самцах и самках карликовых свиней (n=20). Тестируемый препарат вводили однократно в 1-й день эксперимента в очаг поражения и субдурально. В рамках эксперимента была проведена оценка эффективности тестируемого препарата в условиях модельной патологии контузионной травмы спинного мозга.

Экспериментальных животных разделили на 4 группы: 1) контрольная группа (п=8; индукция патологии путем контузионной травм спинного мозга с помощью импактора) [Islamov R.R., 2022]; 2) группа трансплантации (n=4; индукция патологии + трансплантация регенеративного матрикса); 3) группа комбинированной терапии (n=4; индукция патологии + трансплантация регенеративного матрикса + эпидуральная электростимуляция спинного мозга); 4) группа нейромодуляции (n=4; эпидуральная электростимуляция спинного мозга).

За 21 день до индукции патологии животным групп №3 и №4 была проведена операция по имплантации эпидуральных стимулирующих и внутримышечных миографических электродов. Для осуществления имплантации в проекции остистых отростков Т5-Т7, L1-L3, L4-L6 выполняли срединные продольные разрезы 5-7 см. Паравертебральные мыщцы тупым путем отслаивались, обнажались дужки позвонков Т5, Т6, LI, L2, L4, L5. Остистые отростки Т5-7, L1-L2, L4-L6 резецировались. Выполняли интерляминэктомию Т5-7, L1-L3, L4-L6. обнажали твердую мозговую оболочку. Четыре электрода устанавливали в межпозвонковые промежутки: Т4-5; Т6-7; L2-3; L5-6. Два верхних электрода проводили в межпозвонковом промежутке Т5-6, нижние - через соседний межпозвонковый промежуток (L1-2 и L4-5 соответственно). Электроды располагали срединно на твердой мозговой оболочке и подшивали двумя швами с помощью атравматической иглы и монофиламентной не рассасывающейся нити 6-0. После установки проводили пробную эпидуральную стимуляцию. В случае регистрации удовлетворительных мышечных ответов выполняли санацию раны, после чего послойно ушивали и накладывали асептическую повязку. Внутримышечные электроды устанавливали в толщу мышц и подшивали к мышечным фасциям с двух сторон. Справа устанавливали три пары электродов (по две в каждую мыщцу) в следующие мыщцы: m.vastus femori, m.tibialis anterior, m.gastrocnemius). Слева устанавливали 2 пары электродов в m.tibialis anterior, m.gastrocnemius. Во всех электродах прорезали овальное окошко 2 мм на расстоянии 7-8 мм от конца провода (в толще мышцы). После установки электроды тестировали путем регистрации мышечного ответа (фиксировались амплидута, импеданс). В случае удовлетворительных параметров мышечных ответов фасции и кожа послойно ушивались.

Индукцию патологии проводили под эндотрахеальным наркозом из заднего доступа к спинному мозгу. Выполняли интерляминэктомию Th9, обнажали твердую мозговую оболочку, делая окно диаметром 10 мм. Контузионную травму наносили с помощью импактора, представляющего собой металлическую трубку длиной 70 см с внутренним диаметром 10 мм и металлический стержень массой 50 г и диаметром 9 мм, который размещали в стальной трубке на высоте 50 см от тверодой мозговой оболочки. Контузия возникала в результате свободного падения металлического стержня с высоты 50 см. До и после нанесения контузионной травмы выполняли регистрацию вызванных потенциалов. В случае подтверждения исчезновения SSEP и МЕР с нижних конечностей в контрольной группе операцию заканчивали. Выполняли санацию раны, после чего послойно ушивали и накладывали асептическую повязку. В группах №2-3 непосредственно после индукции патологии выполняли трансплантацию регенеративного матрикса. Для этого вскрывалась твердая мозговая оболочка и выполнялась ревизия повреждения. Затем выполняли интраспинальное введение суспензии аллогенных МСК (2×10⁷/мл) в 50% PRP и растворе фибриногена с конечной концентрацией 50 мг/мл с одномоментным добавлением 100 мкл тромбина. Суммарно в патологические полости и субдурально каждому животному было введено 300 мкл смеси МСК в PRP с фибриногеном (50 мг/мл). Дополнительно интраспинально было введено по 100 мкл суспензии МСК (2×10⁷/мл) выше и ниже очага контузии в интактную ткань спинного мозга. Введение всех компонентов осуществляли со скоростью 100 мкл в минуту с помощью инсулинового шприца с иглой 26G. После образования сгустка всем животным, получившим трансплантацию РМ «Нейромат» выполнялась пластика твердой мозговой оболочки с помощью аутофасции.

Всем экспериментальным животным на протяжении всего эксперимента после индукции патологии проводилась локомоторная реабилитация, включающая проводку по беговой дорожке (все группы) и нейростимуляцию (группы №3 и №4). Проводку по беговой дорожке проводили 3 раза в неделю, начиная с 7-го дня после индукции патологии. С 7-го по 14-й дни по 15 минут, далее по 30 минут до окончания эксперимента. Во время проводки по беговой дорожке выполнялся количественный анализ кинематики с помощью программы Kinovea V9.5. Для оценки эффективности терапии регистрировались соматосенсорные и моторные вызванные потенциалы (МВП) (все группы), а также мышечные ответы при эпидуральной стимуляции спинного мозга (группа №3 и №4).

Результаты исследования. Кинематический анализ показал, что средние объемы углового движения в трех суставах тазовых конечностей при ходьбе на беговой дорожке резко снижаются после травмы спинного мозга во всех группах по сравнению с уровнем до травмы. Данное снижение носит достоверный характер (р<0.05). В случае активирования электростимуляции спинного мозга СМ одновременно с регистрацией кинематики при нахождении животных на движущейся беговой дорожке были обнаружены изменения объема углового движения в суставах тазовой конечности в группе 3 на поздних сроках-через 60 и 90 дней после ПСМТ (фиг. 3). Данные изменения носили достоверный характер (р<0.05) по сравнению с контрольной группой. Наблюдалось также достоверное увеличение объема углового движения в голеностопном (скакательном) суставе в группе с комбинированной терапией, по сравнению с группой нейромодуляции.

Животным групп №3 и №4 производилась оценка ЭМГ мышц VL, ТА и GM до (контроль) и через 14 дней после травмы спинного мозга и в последующем еженедельно в течении 8 недель. Регистрация ЭМГ была проведена с помощью подкожных электродов имплантированных в область активных точек m. vastus lateralis, m. tibialis anterior и m. gastrocnemius medialis во время движения животного на дорожке со скоростью 0.9-1.1 км/ч. Во время движения по дорожке животное располагалось в специальной подвесной системе, поддерживающей вес тела в области груди и живота. Анализ записей ЭМГ показал, что активация ритмической активности животных в группе №3 на фоне электростимуляции спинного мозга на уровне L2-S1 с частотами 15-35 Гц длительностью 0,25 мс наступала после 6 недель реабилитационной терапии в сочетании с тренировками на беговой дорожке и нейромодуляции.

После установки стимулирующих эпидуральных электродов на уровне Th5-7 и L2-S1, а также установки подкожных миографических электродов в основные группы мышц разгибателей и сгибателей тазовых конечностей, была произведена оценка параметров ответов, вызванных электростимуляцией спинного мозга. Электрофизиологические записи проводились до травмы спинного мозга, на 7-е, 14-е, 21-е, 40-е, 75-е, 85-е сутки после ТСМ. Электрическая стимуляция осуществлялась с помощью многоканального стимулятора NeoStim 5 (КОСИМА, Россия), подключенного к спинальному имплантату через проводные соединения. Подача одиночного импульса длительностью 0,2 мс, интенсивностью 2-15 мА и частотой 1 Гц через выбранный электродный контакт вызывала двигательные реакции в мышцах тазовых конечностей. При стимуляции спинного мозга в мышцах нижних конечностей регистрировали вызванные ответы, состоящие из моторного (ER- early response), рефлекторного моно- (MR - middle response) и поли- (LR - late response) компонентов. Регистрация ЭМГ была проведена с помощью подкожных электродов имплантированных в область активных точек m. vastus lateralis, m. tibialis anterior и m. gastrocnemius medialis.

Анализ электромиографических записей показал, что через 14 дней после травмы спинного мозга (ТСМ) у всех животных не наблюдаются ответы при стимуляции на уровне выше уровня травмы (Th5-7), что свидетельствует о нарушении проведения через уровень поражения (фиг. 4А).

После 7 недель электростимуляции в сочетании с двигательными тренировками на беговой дорожке было обнаружено, что в группе №3 МВП наблюдаются в мышцах VL, ТА и GM, в группе №4 мышечные ответы были зарегистрированы только в мышце бедра (VLR). Появление мышечных ответов, вызванных электростимуляцией спинного мозга на уровне выше ТСМ, свидетельствуют в пользу восстановления супраспинального афферентного входа на двигательные центры спинного мозга и проведения сигнала через область повреждения в группе животных с комбинированной терапией.

При стимуляции спинного мозга на уровне L2-S1 в период до ТСМ в m. gastrocnemius medialis регистрировали вызванные ответы, содержащие как ранний моторный компонент (ER), так рефлекторные и моно- (MR) и поли- (LR) синаптические ответы (фиг. 4Б, 5). Через 7 и 14 суток после травмы спинного мозга стимуляция ниже ТСМ не вызывала раннего ответа (ER). Через 21 сутки ранний компонент снизился по сравнению с контрольными значениями на 50%. На 40-е, 75-е и 85-е сутки амплитуда среднего компонента продолжала снижаться. При этом амплитуда среднего компонента (MR) после ТСМ возрастала и к 85 суткам увеличивалась в 5 раз (фиг. 5). Увеличение амплитуды моносинаптического рефлекторного компонента вызванного ответа указывает на повышение рефлекторной возбудимости мотонейронов на уровне поясничного утолщения спинного мозга и облегчение рефлекторной функции. Поздний ответ (LR) не наблюдался до 6-8 недель после ТСМ. Появление позднего полисинаптического компонента (LR) совпадало с появлением мышечных ответов при электро стимуляции выше уровня травмы и началом активации генератора шагательных движений у животных после комбинированной терапии, выявленной посредством регистрации кинематики движений конечностей при активной электростимуляции СМ во время тренировки животных на беговой дорожке.

Восстановление показателей МВП у животных после трансплантации регенеративного матрикса свидетельствует о его эффективности в отношении восстановления функций спинного мозга. По совокупности показателей, восстановления локомоторной функции и восстановления МВП наиболее выраженный эффект восстановления наблюдался в группе с комбинированной терапией - трансплантацией регенеративного матрикса и последующей эпидуральной электростимуляцией выше и ниже уровня травмы спинного мозга одномоментно с локомоторной реабилитацией.

Заключение. Восстановление локомоторной функции при электростимуляции и восстановление моторных вызванных потенциалов у животных, получивших трансплантацию регенеративного матрикса однозначно свидетельствует об эффективности комбинированного метода терапии в отношении восстановления функций спинного мозга.

Пример 4. Электрическая стимуляция спинного мозга у пациентов.

Процедура электрической стимуляции спинного мозга у пациентов может производится с помощью чрескожной электрической стимуляции спинного мозга и эпидуральной стимуляции в ходе основных видов тренировок: 1) в положении лежа на боку; 2) в положении лежа на боку в подвеске; 3) в положении сидя; 4) в положении стоя в системе поддержки веса тела. Стимуляция осуществляется с целью вызова непроизвольной ритмической активности мышц нижних конечностей, поддержания статического напряжения мышц спины и пресса во время тренировок, а также во время попыток произвольной активации исследуемых мышц (подпороговая стимуляция). Параметры стимуляции подбираются индивидуально для каждого участника исследования, а также в зависимости от цели тренировки.

Чрескожная электрическая стимуляция спинного мозга (ЧЭССМ) проводится с помощью стимулятора (КОСИМА, БИОСТИМ 5, Россия). Активный накожный электрод в виде диска диаметром 2.5 см располагается по средней линии позвоночника между остистыми отростками на уровнях Th11-Th12 и/или TM12-L1 позвонков. Пассивные электроды прямоугольной формы располагаются симметрично на коже над гребнями подвздошных костей. Запись ответов индуцированных ЧЭССМ проводится с помощью биполярных накожных электродов расположенных билатерально на мышцах: m. soleus, m. gastrocnemius, m. tibialis anterior, m. biceps femoris, m. rectus femorisv

Эпидуральная электрическая стимуляция спинного мозга (ЭССМ) проводится у участников исследования с имплантированным стимулятором с помощью системы: Электрод 5-6-5 (фирмы Medtronic) или электрод Tripole 16 (16С) (Abbot).

ЭССМ осуществляется, например, на уровне поясничного утолщения (Th11 - L2 сегменты). Запись ответов индуцированных ЭССМ проводится с помощью биполярных накожных электродов расположенных билатерально на мышцах: m. soleus, m. gastrocnemius, m. tibialis anterior, m. biceps femoris. m. rectus femoris. Два поверхностных отводящих электрода устанавливаются латерально к месту расположения эпидурального стимулятора над параспинальными мышцами, для регистрации артефакта стимула. Запись и оценка ЭМГ проводится с помощью 8 или 16-канального электронейромиографа.

Электрическая стимуляция спинного мозга осуществляется в двух частотных спектрах: одиночные импульсы 1 Гц; при мультисегментарной электростимуляции - от 10 до 35 Гц. В качестве воздействия применяются прямоугольные монополярные электрические стимулы длительностью 1 мс при ЧЭССМ (неинвазивной) и 200-250 мкс при ЭССМ (инвазивной). Величина тока подбирается индивидуально для каждого испытуемого индивидуально, в зависимости от порога активации мышц нижних конечностей на фоне интенсивной двигательной реабилитации в течение 6 месяцев.

ЛИТЕРАТУРА

1. Barbiellini Amidei С, Salmaso L, Bellio S, Saia M. Epidemiology of traumatic spinal cord injury: a large population-based study. Spinal Cord. 2022 Sep; 60(9):812-819. doi: 10.1038/s41393-022-00795-w. Epub 2022 Apr 8. PMID: 35396455; PMCID: PMC8990493.

2. Shang Z, Wang R, Li D, Chen J, Zhang B, Wang M, Wang X, Wanyan P. Spinal Cord Injury: A Systematic Review and Network Meta-Analysis of Therapeutic Strategies Based on 15 Types of Stem Cells in Animal Models. Front Pharmacol. 2022 Mar 14;13:819861. doi: 10.3389/fphar.2022.819861. PMID: 35359872; PMCID: PMC8964098.

3. Bydon, M., Qu, W., Moinuddin, F.M. et al. Intrathecal delivery of adipose-derived mesenchymal stem cells in traumatic spinal cord injury: Phase I trial. Nat Commun 15, 2201 (2024). https://doi.ors/10.1038/s41467-024-46259-y

4. Feng C, Deng L, Yong YY, Wu JM, Qin DL, Yu L, Zhou XG, Wu AG. The Application of Biomaterials in Spinal Cord Injury. Int J Mol Sci. 2023 Jan 3;24(1):816. doi: 10.3390/ijms24010816. PMID: 36614259; PMCID: PMC9821025.

5. Horwitz E.M., Le Blanc K., Dominici M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. // Cytotherapy. - 2005. - №7 - P. 393-5. doi: 10.1080/14653240500319234

6. Jin Q.-H., Kim H.-K., Na J.-Y., et al. Anti-inflammatory effects of mesenchymal stem cell-conditioned media inhibited macrophages activation in vitro. // Scientific Reports. - 2022. - №12 - P. 4754. doi: 10.1038/s41598-022-08398-4

7. Karamian B.A., Siegel N., Nourie В., et al. The role of electrical stimulation for rehabilitation and regeneration after spinal cord injury. // Journal of Orthopaedics and Traumatology. - 2022. - №23 - P. 2. doi: 10.1186/s10195-021-00623-6

8. Kvistad C.E., Krakenes Т., Gjerde C, et al. Safety and Clinical Efficacy of Mesenchymal Stem Cell Treatment in Traumatic Spinal Cord Injury, Multiple Sclerosis and Ischemic Stroke - A Systematic Review and Meta-Analysis. // Frontiers in Neurology. - 2022. - №13 - P. 891514. doi: 10.3389/fneur.2022.891514

9. Pang Q.-M., Chen S.-Y., Fu S.-P., et al. Regulatory Role of Mesenchymal Stem Cells on Secondary Inflammation in Spinal Cord Injury. // Journal of Inflammation Research. - 2022. - №Volume 15 - P. 573-93. doi: 10.2147/JIR.S349572

10. Rowald A, Komi S, Demesmaeker R, et al., and Courtine G. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nat Med. 2022 Feb; 28(2):260-271. doi: 10.1038/s41591-021-01663-5. Epub 2022 Feb 7. PMID: 35132264.

11. Siddiqui AM, Islam R, Cuellar CA, et al., and Lavrov IA. Newly regenerated axons via scaffolds promote sub-lesional reorganization and motor recovery with epidural electrical stimulation. NPJ Regen Med. 2021 Oct 20; 6(1):66. doi: 10.1038/s41536-021-00176-6. PMID: 34671050; PMCID: PMC8528837.

Claims (3)

1. Способ лечения острой осложненной позвоночно-спинномозговой травмы (ПСМТ), включающий два этапа: 1) интраоперационное интраспинальное субдуральное введение регенеративного матрикса, состоящего из фибринового гидрогеля, концентрация которого составляет 50-75 мг/мл, с аллогенными мезенхимальными стволовыми клетками (МСК) из Вартонового студня нормальной плаценты человека или аутологичными или аллогенными МСК из костного мозга, выращенными в бессывороточной среде с добавлением 5% тромбоцитарного лизата человека, суспендированными в аутологичной плазме, обогащенной тромбоцитами; трансплантация проводится в острейшем периоде ПСМТ во время проведения операции по декомпрессии спинного мозга; 2) последующую электрическую стимуляцию спинного мозга ниже уровня травмы.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что электрическая стимуляция спинного мозга ниже уровня травмы осуществляется неинвазивно через накожные электроды, установленные на уровнях Th11-Th12 и/или Th12-L1 позвонков в двух частотных спектрах: одиночные импульсы 1 Гц; при мультисегментарной электростимуляции - от 10 до 35 Гц прямоугольными монополярными электрическими стимулами длительностью 1 мс с величиной тока, подбираемой индивидуально, в зависимости от порога активации мышц нижних конечностей на фоне интенсивной двигательной реабилитации в течение 6 месяцев.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что электрическая стимуляция спинного мозга ниже уровня травмы осуществляется инвазивно через инвазивные эпидуральные электроды на уровне сегментов Th11-L2 в двух частотных спектрах: одиночные импульсы 1 Гц; при мультисегментарной электростимуляции - от 10 до 35 Гц прямоугольными монополярными электрическими стимулами длительностью 200-250 мкс при инвазивной электрической стимуляции спинного мозга с величиной тока, подбираемой индивидуально, в зависимости от порога активации мышц нижних конечностей на фоне интенсивной двигательной реабилитации в течение 6 месяцев.